Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Technika śledzenia opisana w tym protokole pomaga nam badać morfogenezę neuronów i wykrywać połączenia w systemie neuronów ruchowych Drosophila. Barwnik lipofilowy może szybko dyfundować do każdej części błony komórkowej o bardzo dużej gęstości. Właśnie dlatego nasz protokół skutecznie rozwiązuje problemy ze znalezieniem struktur znakowanego neuronu.

Jeśli koniec aksonu jest dostępny za pomocą mikropipety iniekcyjnej, technikę tę można zastosować do dowolnego neuronu w stadiach larwalnych i dorosłych much lub w innych organizmach. Jeśli nie masz doświadczenia w preparowaniu lub używaniu mikroiniektora, precyzyjna operacja na próbce może być trudna. Zrozumienie anatomii zarodka pomoże w prawidłowym porcjowaniu narzędzi do przeprowadzenia sekcji lub zastrzyku.

Aby rozpocząć, przygotuj i ułóż wszystkie materiały do pobierania zarodków. Przygotuj aparat filtracyjny, przecinając rurkę o pojemności 50 mililitrów i wycinając otwór w nasadce. Następnie umieść filtr siatkowy z porami 100 mikrometrów między rurką a nasadką.

Przygotować mikropipetę do wstrzykiwań barwnika i igłę do rozwarstwiania z tej samej rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 1,2 milimetra. Pociągnij rurkę za pomocą mikropipety, ściągacza przy 7% od maksymalnej mocy wyjściowej 170 V, aby utworzyć ostrą igłę ze stożkiem o długości około 0,4 centymetra. Aby przygotować mikropipetę do iniekcji barwnika, nasącz młynek środkiem zwilżającym i umieść igłę na zacisku mikropipety pod kątem 25 do 30 stopni.

Następnie opuść końcówkę na dwie trzecie promienia od środka powierzchni ukosowania. Zmielić igłę, podczas gdy strzykawka z rurką wpycha do niej powietrze. Oznacz mikropipetę markerem permanentnym z cienką końcówką, aby wskazać położenie otworu na końcówce po ukosowaniu, ponieważ zlokalizowanie wąskiego otworu, który jest utworzony pod kątem, może być trudne.

Pozwól muchom złożyć jaja przez noc w temperaturze pokojowej i zbierz fajkę z jajami rano. Aby zebrać zarodki, odchloruj jajka na talerzu 50% wybielaczem przez pięć minut. Po usunięciu chlorionów przelać zawartość płytki przez aparat filtracyjny lub sitko do komórek, aby wyizolować zarodki.

Użyj wyciśniętej butelki z wodą, aby rozcieńczyć wybielacz pozostały na płytce i zbierz jak najwięcej zarodków, dekantując mieszaninę do filtra. Umyj zarodki trzy do czterech razy wodą, aż zapach wybielacza zniknie. Wyjmij filtr z urządzenia i umyj je wodą na innej czystej płycie.

Następnie zdekantuj wodę z nowej płytki, na której znajdują się zarodki. Użyj cienkich kleszczy, aby wybrać od pięciu do 10 zarodków po 15 godzinach od złożenia jaj i umieść je na dwustronnej taśmie stroną grzbietową skierowaną do góry. Dodać sól fizjologiczną z owadów do basenu rozwarstwiającego, aby chronić zarodki przed wysuszeniem.

Użyj szklanej igły pod mikroskopem preparacyjnym, aby przeciągnąć zarodek z błony środkowej z taśmy na szkło, uważając, aby nie uszkodzić wewnętrznych tkanek zarodka. Następnie przetnij linię środkową pojedynczego zarodka na jego powierzchni od tylnego do przedniego końca. Odwróć tkanki nabłonkowe od środka i przymocuj krawędź naskórka do powierzchni szkiełka

Użyj igły połączonej z rurką z otworem na końcówkę o długości około 300 mikrometrów, aby zassać lub wydmuchać powietrze, aby usunąć grzbietowe podłużne pnie tchawicy, a także wszelkie pozostałe jelita. Użyj 4% PFA i PBS, aby utrwalić zarodki przez pięć minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Następnie umyj je trzykrotnie PBS.

Zarodki należy wybarwić jednym mikrolitrem przeciwciała przeciwko peroksydazie chrzanowej sprzężonego z barwnikiem cyjaniny3 i 200 mikrolitrami PBS przez godzinę na wytrząsarce orbitalnej. I powtórz pranie w PBS. Aby napełnić mikropipetę iniekcyjną, umieść ją w uchwycie kapilarnym.

Następnie umieść szkiełko barwnikowe na stoliku i za pomocą mikromanipulatora umieść je nad szkiełkiem. Następnie wyreguluj stolik, aby umieścić mikropipetę na barwniku. Zebrać barwnik w mikropipecie, ustawiając ciśnienie wtrysku w zakresie od 200 do 500 hektopaskalów, czas wstrzykiwania od 0,1 do 0,5 sekundy, a ciśnienie kompensacyjne do zera na pięć minut.

Po zebraniu barwnika usuń szkiełko barwnikowe i umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Następnie zwiększ ciśnienie kompensacyjne do zakresu od 30 do 60 hektopaskalów i zanurz mikropipetę do próbki. Użyj soczewki obiektywu 10 razy, aby zlokalizować zarodek i wyrównać mikropipetę z zarodkiem.

Zmień soczewkę obiektywu na soczewkę 40 razy zanurzoną w wodzie. I zanurz obiektyw w PBS. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić morfologię neuronów oznaczoną przez anty-HRP Cy3 i określić miejsce wstrzyknięcia.

Gdy zarodek jest w ostrości, zmień położenie mikropipety, aby delikatnie zetknąć się z końcówką aksonu będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie użyj mikroskopii jasnego pola podczas wstrzyknięcia, aby zobaczyć kroplę barwnika. Upuść barwnik do prawego półsegmentu brzusznego w połączeniu nerwowo-mięśniowym aCC lub RP3 z DiD lub DiO.

Użyj pilota, aby uwolnić barwnik i wyjąć mikropipetę. Następnie przejdź do następnego miejsca wstrzyknięcia. Przed obrazowaniem należy inkubować próbkę przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.

Za pomocą cienkich kleszczyków usuń taśmy ze szklanego szkiełka. Aby zamontować próbkę, należy przygotować szkiełko nakrywkowe z niewielką ilością smaru próżniowego w czterech rogach. Ostrożnie umieść go na próbce, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

Dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wyregulować przestrzeń od próbki, aby umożliwić odległość roboczą między soczewką obiektywu a szkiełkiem. Usuń nadmiar PBS za pomocą czyszczenia zadań. Całkowicie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.

Obraz w 10-krotnym i 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu konfokalnego i przetwarzanie obrazów za pomocą oprogramowania imageJ. Protokół ten został wykorzystany do wstecznego oznaczenia neuronu ruchowego aCC unerwiającego mięśnia pierwszego i mięśnia unerwiającego neuronu ruchowego RP3 szóstego i siódmego. Gałęzie dendrytyczne neuronów ruchowych ACC i RP3 w znacznym stopniu się pokrywają.

Oba neurony są dwubiegunowe, tworząc dwie różne populacje dendrytów. Aby zademonstrować możliwości ilościowe tej metody, policzono całkowitą liczbę końcówek dendrytów w typie dzikim i mutantach Dscam1. Ipsilateralne dendryty aCC są pokazane dla typu dzikiego, ale niewiele dendrytów ipsilateralnych zaobserwowano dla mutanta Dscam1.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, że kluczowa jest wielkość kropli barwnika, która wynosi około 10 do 20 mikrometrów. Sprawdzić rozmiar na taśmie dwustronnej, a następnie przyłożyć go do miejsca wstrzyknięcia. Korzystając z tej procedury, możemy wykorzystać właściwość przełączania zdjęć sondy DiD, aby uzyskać obrazy błony plazmatycznej w super rozdzielczości.

W ten sposób możemy badać ultrastrukturalną charakterystykę błon synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym. Zrobiliśmy kliknięcie. Przeprowadziliśmy analizę fenotypową dendrytów aCC w zmutowanym szczepie i odkryliśmy, że wstrzyknięcie Dscam1-Dock-Pak określa miejsce wyrostu dendrytów w aCC.