Name: Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę wstecznego śledzenia neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych. Technika ta umożliwia badanie morfogenezy neuronów i łączności w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Laboratorium Kamiyama za komentarze do manuskryptu. Praca ta była wspierana przez NS107558 NIH R01 (do M.I., K.B. i D.K.).

1. Sprzęt i zaopatrzenie
<ol>
	<li>Materiały do pobierania zarodków i szkolenia dorosłych osobników do składania jaj
	<ol>
		<li>Przygotuj aparat filtracyjny, przecinając probówkę o pojemności 50 ml i wycinając otwór w nasadce, aby umieścić filtr siatkowy z porami 100 μm (tabela materiałów) między probówką a nasadką. 
		UWAGA: Alternatywnie do etapu filtracji pobierania zarodków można użyć sitek komórkowych o porach 100 μm (tabela materiałów).</li>
		<li>Wykonaj płytki agarowe z premiksem agaru winogronowego (tabela materiałów) zgodnie z podanymi instrukcjami. Krótko delikatnie wymieszać 1 opakowanie mieszanki proszkowej z 500 ml mleka o temperaturze pokojowej (RT, 23 °C) dH2O i podgrzać rozpuszczoną mieszaninę w kuchence mikrofalowej do energicznego wrzenia. Po schłodzeniu do temperatury 70−75 °C mieszaninę rozlać na szalki Petriego (60 mm). Po zestaleniu się agaru przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować pastę drożdżową, mieszając aktywne suche drożdże (Tabela Materiałów) i wodę do konsystencji pasty i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Używaj klatek do zbierania jaj (dla szalki Petriego 60 mm, tabela materiałów), które zapewniają wystarczający przepływ powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie igieł preparacyjnych i mikropipet do iniekcji barwnika
	<ol>
		<li>Przygotować mikropipetę do wstrzykiwania barwnika i igłę do rozwarstwiania z tej samej rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,6 mm i średnicy zewnętrznej 1,2 mm (tabela materiałów). Pociągnij rurkę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet pod kątem 7% od maksymalnej mocy wyjściowej 170 V (tabela materiałów), aby uzyskać ostrą igłę o zwężeniu o długości ~0,4 cm.</li>
		<li>W przypadku wstrzykiwania barwnika należy wyregulować mikropipetę za pomocą ukosownika do mikropipet (tabela materiałów) za pomocą techniki ukosowania pęcherzykowego opisanej w instrukcji obsługi urządzenia.
		<ol>
			<li>Krótko mówiąc, namocz młynek środkiem zwilżającym (tabela materiałów), aby zapobiec "ciągnięciu" końcówki igły przez wodę. Umieść igłę na zacisku mikropipety pod kątem 25−30° i opuść końcówkę na dwie trzecie promienia od środka powierzchni ukosowania. Zmielić igłę, podczas gdy strzykawka z rurką wpycha powietrze do igły, aby upewnić się, że mikropipeta będzie wolna od wiórów szklanych.</li>
			<li>Oznacz mikropipetę markerem permanentnym z cienką końcówką, aby wskazać położenie otworu na końcówce po ukosowaniu, ponieważ trudno jest zlokalizować wąski otwór mikropipety, który jest uformowany pod kątem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie do pobrania zarodków
<ol>
	<li>Upewnij się, że dorosłe muchy (20−40 dzikich typu Canton-S lub białe muchy), samce i samice, są utrzymywane w młodych (<7 dni) i zdrowych warunkach dla idealnego zbierania jaj. 
	UWAGA: Aby stymulować składanie jaj, muchy są szkolone w klatce do zbierania jaj na kilka dni przed pobraniem jaj na płytkach agarowych posmarowanych pastą drożdżową co najmniej raz dziennie.</li>
</ol>
3. Stopień zarodka
<ol>
	<li>Pozwól muszkom złożyć jaja przez noc (lub co najmniej 15 godzin) w temperaturze RT, aby zebrać zarodki po 15 godzinach AEL, tj. stadium 1618, aby zobaczyć dendrytogenezę neuronów ruchowych aCC i RP3. Rano zbierz talerz z jajkami. 
	UWAGA: Zarodki po 15 godzinach AEL będą miały wyraźną 4-komorową klasę jelit<sup="xref">18. W przypadku obrazowania różne etapy należy kierować się ich specyficznymi kryteriami morfologicznymi i warunkami starzenia.</li>
	<li>Aby zebrać zarodki, należy zdekorionować jaja złożone na płytce za pomocą 50% wybielacza przez 5 minut.</li>
	<li>Po oczyszczeniu kosmówki przelać zawartość płytki przez aparat filtracyjny lub sitko do komórek w celu wyizolowania zarodków. Używając wyciśniętej butelki z wodą, rozcieńczyć wybielacz pozostały na płytce i zebrać jak najwięcej zarodków, dekantując mieszaninę do filtra.</li>
	<li>Umyj zarodki na filtrze 3−4x większą ilością wody lub do momentu, gdy zapach wybielacza zniknie. Wyjmij filtr z aparatu i umyj zarodki na innej czystej płytce z wodą. Zdekantować wodę z nowej płytki, na której znajdują się zarodki.</li>
	<li>Przygotuj szklane szkiełko, przykrywając je dwiema warstwami taśmy winylowej pośrodku, tworząc prostokąt. Wytnij prostokątną kałużę z taśmy za pomocą żyletki. Umieść cienki pasek dwustronnej taśmy w kierunku górnego końca basenu, to jest miejsce, w którym zostaną umieszczone zarodki, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy wybierz indywidualnie 5-10 zarodków po 15 godzinach AEL i umieść je na taśmie dwustronnej stroną grzbietową skierowaną do góry. Dodaj sól fizjologiczną owada Ringera class<="xref">19 do puli rozwarstwiającej, aby chronić zarodki przed wysuszeniem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie i barwienie
<ol>
	<li>Za pomocą szklanej igły pod mikroskopem preparacyjnym (Tabela materiałów) przeciąć linię środkową pojedynczego zarodka na jego powierzchni od tylnego do przedniego końca. Następnie przeciągnij zarodek z błony witeliny z taśmy na szkło (w pudełku <silna klasa="xfig">Ryc. 1). Uważaj, aby nie uszkodzić wewnętrznych tkanek zarodka.</li>
	<li>Odwróć tkanki nabłonkowe od środka i przymocuj krawędź naskórka do powierzchni szkiełka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, wstawka).</li>
	<li>Za pomocą igły połączonej z rurką z otworem końcówki ~300 μm (przygotowanej przez złamanie cienkiej końcówki igły preparcyjnej), zassaj lub przedmuchnij powietrze, aby odłączyć i usunąć grzbietowe podłużne pnie tchawicy, a także wszelkie pozostałe jelita.</li>
	<li>Użyj 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby utrwalić zarodki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj zarodki 3x PBS.</li>
	<li>Zarodki należy wybarwić 1 μl przeciwciała przeciwko peroksydazie chrzanowej sprzężonego z barwnikiem cyjaniny3 (anty-HRP Cy3) (tabela materiałów) w 200 μl PBS przez 1 godzinę. Po barwieniu przemyć zarodki PBS 3x. 
	UWAGA: Barwnik anty-HRP można zmienić w oparciu o wybrane barwniki lipofilowe do wstrzykiwań.</li>
</ol>
5. Napełnianie mikropipety iniekcyjnej
<ol>
	<li>Przed użyciem podgrzać barwniki lipofilowe (5 mg/ml DiO lub DiD, tabela materiałów) do 60 °C w mieszaninie 1:10 etanolu: olej roślinny.</li>
	<li>Przygotować rozpuszczony w oleju szkiełko barwnikowe do mikropipety iniekcyjnej. Umieść mikropipetę w uchwycie kapilarnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, #1). Za pomocą mikromanipulatora (tabela materiałów) wyreguluj mikropipetę tak, aby znajdowała się nad szkiełkiem barwnikowym. Następnie wyreguluj stolik, aby umieścić mikropipetę na barwniku (Rysunek 2, #2).</li>
	<li>Aby napełnić mikropipetę, użyj mikroiniektora (Tabela materiałów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, #3). Zbierz barwnik w mikropipecie, ustawiając Pi (ciśnienie wtrysku) w zakresie 200−500 hPa (hektopaskal), Ti (czas wtrysku) w zakresie 0,1−0,5 s i Pc (ciśnienie kompensacyjne) na 0 hPa przez 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, #4).</li>
	<li>Po zebraniu barwnika usuń szkiełko barwnikowe i umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Następnie zwiększ Pc do zakresu 20-60 hPa przed opuszczeniem mikropipety do próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu PBS przez działanie kapilarne.</li>
</ol>
6. Wstrzykiwanie barwnika do neuronów
<ol>
	<li>Zlokalizuj zarodek w środku za pomocą mikroskopu z soczewką obiektywową 10x (tabela materiałów) i wyrównaj mikropipetę z zarodkiem. 
	UWAGA: Wielkość kropli barwnika można regulować, zmieniając Pi lub rozmiar otworu końcówki mikropipety. Kropla powinna mieć 10−20 μm, co odpowiada w przybliżeniu szerokości 1 mięśnia.</li>
	<li>Zmień soczewkę obiektywu na soczewkę 40-krotną zanurzoną w wodzie (tabela materiałów) i zanurz soczewkę w PBS, aby zobaczyć zarodek.
	<ol>
		<li>Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić morfologię neuronów oznaczoną przez anty-HRP Cy3 i określić miejsce wstrzyknięcia.</li>
		<li>Podczas wstrzykiwania należy użyć mikroskopii w jasnym polu, aby zobaczyć kroplę barwnika. Gdy zarodek jest w ostrości, zmień położenie mikropipety, aby delikatnie zetknąć się z końcówką aksonu będącego przedmiotem zainteresowania (np. aCC, RP3).</li>
		<li>Upuść barwnik do prawego półsegmentu brzucha (A2−A6) w połączeniu nerwowo-mięśniowym aCC lub RP3 (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 3) z DiD lub DiO, używając neuronów oznaczonych anty-HRP Cy3. Korzystanie z pilota (mysz; <silna klasa="xfig">Rysunek 2, 5) Uwolnij barwnik i wyjmij mikropipetę po upuszczeniu barwnika za pomocą mikromanipulatora i przejdź do następnego miejsca wstrzyknięcia. 
		UWAGA: W przeciwieństwie do innych barwników (np. żółcień Lucyfera, kalceina), które rozprzestrzeniają się do sąsiednich komórek przez połączenia szczelinowe, barwniki lipofilowe łączą się z błonami komórkowymi i nie przenoszą się na sąsiadów. Jednak ze względu na stosunkowo duży rozmiar kropli barwnika, technika ta powoduje również znakowanie mięśni partnerskich (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę po upuszczeniu barwnika przed obrazowaniem. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać przed montażem, a próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Barwniki lipofilowe mogą być również dostarczane za pomocą jonoforezy, jeśli wewnątrzkomórkowy wzmacniacz sprzężony bezpośrednio (DC) jest łatwo dostępny20.</li>
</ol>
7. Obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego
<ol>
	<li>Usuń taśmę dwustronną i taśmę winylową ze szkiełka za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przygotować szkiełko nakrywkowe (szkło nakrywkowe 22 x 22 mm2 nr 1) z niewielką ilością smaru próżniowego (tabela materiałów) w czterech rogach i ostrożnie umieścić na próbce, unikając pęcherzyków powietrza. Usuń nadmiar PBS za pomocą wycieraczek zadań.</li>
	<li>Dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wyregulować odległość roboczą między soczewką obiektywu a próbką. Całkowicie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obraz w powiększeniu 10x i 100x za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Użyj oprogramowania ImageJ do przetwarzania surowych obrazów z mikroskopu (tabela materiałów). 
	UWAGA: Obserwacja musi rozpocząć się w ciągu 10 minut po zamontowaniu, aby uzyskać najlepsze obrazy. W przeciwnym razie, w RT, barwnik rozprzestrzeni się na miejsca sąsiadujące z miejscem wstrzyknięcia, tworząc niepożądane tło do obrazowania. Aby spowolnić dyfuzję barwnika, próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li>
<li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%3A+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).</li>
<li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li>
<li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347(2009).</li>
<li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348(2009).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li>
<li>Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrero-Mart%C3%ADnez%2C+FA+%22The+Sticky+Synapse%3A+Cell+Adhesion+Molecules+and+Their+Role+in+Synapse+Formation+and+Maintenance%22">The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance</a>. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).</li>
<li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li>
<li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li>
<li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia%3A+accumulation+and+function+of+Capricious%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li>
<li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin%2C+location%2C+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li>
<li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li>
<li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).</li>
<li>Drosophila Ringer's solution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2007 (4), (2007).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).</li>
<li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-skipped%2C+acting+as+a+repressor%2C+regulates+axonal+projections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li>
<li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li>
<li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo+and+Frazzled%2FDCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li>
<li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+a+motor+system%3A+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie znakowania barwnikiem do badania morfologii neuronów ma kilka zalet w porównaniu z technikami genetycznego znakowania komórek. Technika znakowania barwnikiem może zminimalizować ilość czasu potrzebnego na znakowanie i obrazowanie morfologii neuronów ruchowych. Proces znakowania barwnikiem jest dość szybki, ponieważ trwa mniej niż 2 godziny i pozwala nam określić zarys projekcji neuronalnych. Alternatywnie można uwidocznić neuron ruchowy aCC, wybierając linię GAL4, która wyraża drożdżowy czynnik transkrypcyjn...

embrionalny system neuronów ruchowych Drosophila oferuje potężny model eksperymentalny do analizy mechanizmów leżących u podstaw rozwoju ośrodkowego układu nerwowego (CNS)1,2,3. System neuronów ruchowych jest podatny na techniki biochemiczne, genetyczne, obrazowe i elektrofizjologiczne. Korzystając z tych technik, manipulacje genetyczne i analizy funkcjonalne mogą być przeprowadzane na poziomie pojedynczych neuronów ruchowych2,4,5,6.
Podczas wczesnego rozwoju układu nerwowego, neuroblasty dzielą się i generują dużą liczbę gleju i neuronów. Czasoprzestrzenny związek między delaminacją a profilem ekspresji genów neuroblastów został wcześniej szczegółowo zbadany7,8,9. W przypadku układu neuronów ruchowych tworzenie embrionalnego połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) zostało szeroko zbadane przy użyciu neuronów ruchowych aCC (przednia komórka narożna), RP2 (surowa krewetka 2) i RP52,10. Na przykład, gdy neuron ruchowy RP5 tworzy powstające połączenie synaptyczne, filopodia presynaptyczne i postsynaptyczne są wymieszane11,12,13. Taka bezpośrednia komunikacja komórkowa jest niezbędna do zainicjowania tworzenia się NMJ. W przeciwieństwie do tego, co wiemy o gałęziach nerwów obwodowych, nasza wiedza o tym, jak dendryty motoryczne inicjują połączenia synaptyczne w OUN, jest nadal prymitywna.
W tym raporcie prezentujemy technikę, która pozwala na wsteczne znakowanie neuronów ruchowych w zarodkach za pomocą dostarczania barwników lipofilowych za pośrednictwem mikropipet. Technika ta pozwala nam prześledzić 38 neuronów ruchowych unerwiających każdy z 30 mięśni ściany ciała w segmencie półkulowym po 15 godzinach od złożenia jaj (AEL)14. Korzystając z tej techniki, nasza grupa dokładnie zbadała liczne allele zysku/utraty funkcji15,16,17. Niedawno odkryliśmy mechanizmy molekularne, które napędzają inicjację połączenia dendrytów motorycznych i wykazaliśmy, że interakcja Dscam1-Dock-Pak definiuje miejsce wyrostu dendrytów w neuronach ruchowych aCC 17. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta można dostosować do analizy fenotypowej dowolnych embrionalnych neuronów ruchowych w szczepach dzikich lub zmutowanych, zwiększając naszą zdolność do dostarczania nowych informacji na temat funkcjonalnego projektu układu nerwowego Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Soczewka obiektywowa 10x</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>40x Soczewka zanurzeniowa w wodzie</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>Rurka kapilarna</td><td>Frederick Haer& Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>Dragonfly Jednostka konfokalna z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Corning</td><td></td><td>22x22 mm Kwadrat #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Smar wysokopróżniowy</td><td>Fisher Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Klatka do zbierania jaj</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td><td>wycofany z produkcji</td><td>FemtoJet 4i (nr kat. 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Ukosowarka do mikropipet</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Pakiety premiksów z agarem winogronowym w proszku</td><td>FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Filtr z siatki nylonowej</td><td>Milipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór, klasa EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td>Dowolne gatunki EM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>Sprzedawane na sigmaaldrich, pudełko 10x roztwór</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>Środek zwilżający</td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Eclipse Ci ze źródłem światła LED</td></tr><tr><td>Winylowa taśma izolacyjna</td><td>Scotch</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR Sitka do komórek</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>Aktywne suche drożdże (RED STAR)</td></tr></tbody></table>

wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Opisujemy technikę wstecznego znakowania neuronów ruchowych u Drosophila. Używamy rozpuszczonego w oleju barwnika lipofilowego i dostarczamy małą kropelkę do embrionalnego preparatu filetowego za pomocą mikroiniektora. Każdy neuron ruchowy, którego błona styka się z kropelką, może być następnie szybko oznakowany. Poszczególne neurony ruchowe są w sposób ciągły znakowane, co umożliwia wyraźną wizualizację drobnych szczegółów strukturalnych. Biorąc pod uwagę, że barwniki lipofilowe występują w różnych kolorach, technika ta zapewnia również sposób na oznaczenie sąsiednich neuronów w wielu kolorach. Ta technika śledzenia jest zatem przydatna do badania morfogenezy neuronów i połączeń synaptycznych w systemie neuronów ruchowych Drosophila.

Reprezentatywny obraz neuronów ruchowych aCC i RP3 przedstawiono na Rysunku 3C, aby zademonstrować wielokolorowe znakowanie neuronów ruchowych w 15 h AEL. Morfologia ich dendrytów jest w dużej mierze niezmienna pomiędzy zarodkami. Wzór barwienia uzyskany przy użyciu przeciwciała anty-HRP przedstawiono w kolorze szarym. Mała kropla DiO lub DiD została naniesiona odpowiednio na NMJ mięśnia 1 lub 6/7. Rysunek 4 demonstruje możliwość ilościowego pom...

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Technika śledzenia opisana w tym protokole pomaga nam badać morfogenezę neuronów i wykrywać połączenia w systemie neuronów ruchowych Drosophila. Barwnik lipofilowy może szybko dyfundować do każdej części błony komórkowej o bardzo dużej gęstości. Właśnie dlatego nasz protokół skutecznie rozwiązuje problemy ze znalezieniem struktur znakowanego neuronu.Jeśli koniec aksonu jest dostępny za pomocą mikropipety iniekcyjnej, technikę tę można zastosować do dowolnego neuronu w stadiach larwalnych i dorosłych much lub w innych organizmach. Jeśli nie masz doświadczenia w preparowaniu lub używaniu mikroiniektora, precyzyjna operacja na próbce może być trudna. Zrozumienie anatomii zarodka pomoże w prawidłowym porcjowaniu narzędzi do przeprowadzenia sekcji lub zastrzyku.Aby rozpocząć, przygotuj i ułóż wszystkie materiały do pobierania zarodków. Przygotuj aparat filtracyjny, przecinając rurkę o pojemności 50 mililitrów i wycinając otwór w nasadce. Następnie umieść filtr siatkowy z porami 100 mikrometrów między rurką a nasadką.Przygotować mikropipetę do wstrzykiwań barwnika i igłę do rozwarstwiania z tej samej rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 1,2 milimetra. Pociągnij rurkę za pomocą mikropipety, ściągacza przy 7% od maksymalnej mocy wyjściowej 170 V, aby utworzyć ostrą igłę ze stożkiem o długości około 0,4 centymetra. Aby przygotować mikropipetę do iniekcji barwnika, nasącz młynek środkiem zwilżającym i umieść igłę na zacisku mikropipety pod kątem 25 do 30 stopni.Następnie opuść końcówkę na dwie trzecie promienia od środka powierzchni ukosowania. Zmielić igłę, podczas gdy strzykawka z rurką wpycha do niej powietrze. Oznacz mikropipetę markerem permanentnym z cienką końcówką, aby wskazać położenie otworu na końcówce po ukosowaniu, ponieważ zlokalizowanie wąskiego otworu, który jest utworzony pod kątem, może być trudne.Pozwól muchom złożyć jaja przez noc w temperaturze pokojowej i zbierz fajkę z jajami rano. Aby zebrać zarodki, odchloruj jajka na talerzu 50% wybielaczem przez pięć minut. Po usunięciu chlorionów przelać zawartość płytki przez aparat filtracyjny lub sitko do komórek, aby wyizolować zarodki.Użyj wyciśniętej butelki z wodą, aby rozcieńczyć wybielacz pozostały na płytce i zbierz jak najwięcej zarodków, dekantując mieszaninę do filtra. Umyj zarodki trzy do czterech razy wodą, aż zapach wybielacza zniknie. Wyjmij filtr z urządzenia i umyj je wodą na innej czystej płycie.Następnie zdekantuj wodę z nowej płytki, na której znajdują się zarodki. Użyj cienkich kleszczy, aby wybrać od pięciu do 10 zarodków po 15 godzinach od złożenia jaj i umieść je na dwustronnej taśmie stroną grzbietową skierowaną do góry. Dodać sól fizjologiczną z owadów do basenu rozwarstwiającego, aby chronić zarodki przed wysuszeniem.Użyj szklanej igły pod mikroskopem preparacyjnym, aby przeciągnąć zarodek z błony środkowej z taśmy na szkło, uważając, aby nie uszkodzić wewnętrznych tkanek zarodka. Następnie przetnij linię środkową pojedynczego zarodka na jego powierzchni od tylnego do przedniego końca. Odwróć tkanki nabłonkowe od środka i przymocuj krawędź naskórka do powierzchni szkiełka podstawowego.Użyj igły połączonej z rurką z otworem na końcówkę o długości około 300 mikrometrów, aby zassać lub wydmuchać powietrze, aby usunąć grzbietowe podłużne pnie tchawicy, a także wszelkie pozostałe jelita. Użyj 4% PFA i PBS, aby utrwalić zarodki przez pięć minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Następnie umyj je trzykrotnie PBS.Zarodki należy wybarwić jednym mikrolitrem przeciwciała przeciwko peroksydazie chrzanowej sprzężonego z barwnikiem cyjaniny3 i 200 mikrolitrami PBS przez godzinę na wytrząsarce orbitalnej. I powtórz pranie w PBS. Aby napełnić mikropipetę iniekcyjną, umieść ją w uchwycie kapilarnym.Następnie umieść szkiełko barwnikowe na stoliku i za pomocą mikromanipulatora umieść je nad szkiełkiem. Następnie wyreguluj stolik, aby umieścić mikropipetę na barwniku. Zebrać barwnik w mikropipecie, ustawiając ciśnienie wtrysku w zakresie od 200 do 500 hektopaskalów, czas wstrzykiwania od 0,1 do 0,5 sekundy, a ciśnienie kompensacyjne do zera na pięć minut.Po zebraniu barwnika usuń szkiełko barwnikowe i umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Następnie zwiększ ciśnienie kompensacyjne do zakresu od 30 do 60 hektopaskalów i zanurz mikropipetę do próbki. Użyj soczewki obiektywu 10 razy, aby zlokalizować zarodek i wyrównać mikropipetę z zarodkiem.Zmień soczewkę obiektywu na soczewkę 40 razy zanurzoną w wodzie. I zanurz obiektyw w PBS. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić morfologię neuronów oznaczoną przez anty-HRP Cy3 i określić miejsce wstrzyknięcia.Gdy zarodek jest w ostrości, zmień położenie mikropipety, aby delikatnie zetknąć się z końcówką aksonu będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie użyj mikroskopii jasnego pola podczas wstrzyknięcia, aby zobaczyć kroplę barwnika. Upuść barwnik do prawego półsegmentu brzusznego w połączeniu nerwowo-mięśniowym aCC lub RP3 z DiD lub DiO.Użyj pilota, aby uwolnić barwnik i wyjąć mikropipetę. Następnie przejdź do następnego miejsca wstrzyknięcia. Przed obrazowaniem należy inkubować próbkę przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.Za pomocą cienkich kleszczyków usuń taśmy ze szklanego szkiełka. Aby zamontować próbkę, należy przygotować szkiełko nakrywkowe z niewielką ilością smaru próżniowego w czterech rogach. Ostrożnie umieść go na próbce, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.Dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wyregulować przestrzeń od próbki, aby umożliwić odległość roboczą między soczewką obiektywu a szkiełkiem. Usuń nadmiar PBS za pomocą czyszczenia zadań. Całkowicie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.Obraz w 10-krotnym i 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu konfokalnego i przetwarzanie obrazów za pomocą oprogramowania imageJ. Protokół ten został wykorzystany do wstecznego oznaczenia neuronu ruchowego aCC unerwiającego mięśnia pierwszego i mięśnia unerwiającego neuronu ruchowego RP3 szóstego i siódmego. Gałęzie dendrytyczne neuronów ruchowych ACC i RP3 w znacznym stopniu się pokrywają.Oba neurony są dwubiegunowe, tworząc dwie różne populacje dendrytów. Aby zademonstrować możliwości ilościowe tej metody, policzono całkowitą liczbę końcówek dendrytów w typie dzikim i mutantach Dscam1. Ipsilateralne dendryty aCC są pokazane dla typu dzikiego, ale niewiele dendrytów ipsilateralnych zaobserwowano dla mutanta Dscam1.Próbując tej procedury, należy pamiętać, że kluczowa jest wielkość kropli barwnika, która wynosi około 10 do 20 mikrometrów. Sprawdzić rozmiar na taśmie dwustronnej, a następnie przyłożyć go do miejsca wstrzyknięcia. Korzystając z tej procedury, możemy wykorzystać właściwość przełączania zdjęć sondy DiD, aby uzyskać obrazy błony plazmatycznej w super rozdzielczości.W ten sposób możemy badać ultrastrukturalną charakterystykę błon synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym. Zrobiliśmy kliknięcie. Przeprowadziliśmy analizę fenotypową dendrytów aCC w zmutowanym szczepie i odkryliśmy, że wstrzyknięcie Dscam1-Dock-Pak określa miejsce wyrostu dendrytów w aCC.

retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje...

Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Źródło: Inal, M. A. et. al., wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila przy użyciu lipofilowych barwników fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych Drosophila za pomocą barwników lipofilowych. Barwnik dostaje się do aksonu, przemieszcza się wstecz i oznacza neurony na zielono, umożliwiając szczegółową wizualizację ich morfologii i projekcji pod mikroskopem konfokalnym.

Wsteczne znakowanie neuronów ruchowych Drosophila za pomocą fluorescencyjnych barwników lipofilowych

Źródło: Guan, W., et. al. Wizualizuj Drosophila Aksony neuronu ruchowego nóg przez dorosły naskórek. J. vis. exp. (2018) Ten film pokazuje obrazowanie Drosophila z zielonymi fluorescencyjnymi neuronami ruchowymi eksprymującymi białko za pomocą mikroskopii konfokalnej. Laser i dwa detektory wychwytują GFP i autofluorescencję naskórków. Obrazy są przetwarzane przez dzielenie kanałów, odejmowanie autofluorescencji i łączenie w kolorowy obraz kompozytowy w celu wizualizacji aksonów w segmencie nogi.

Obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji celowania aksonalnego za pomocą białka fluorescencyjnego w odnóżach dorosłych Drosophila poprzez etapy fiksacji, montażu, obrazowania i po obrazowaniu.

Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Poznaj metodę wstecznego śledzenia neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych. Technika ta umożliwia badanie morfogenezy neuronów i łączności w układzie nerwowym.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów