Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych
12 stycznia 2020
Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.
Technika śledzenia opisana w tym protokole pomaga nam badać morfogenezę neuronów i wykrywać połączenia w systemie neuronów ruchowych Drosophila. Barwnik lipofilowy może szybko dyfundować do każdej części błony komórkowej o bardzo dużej gęstości. Właśnie dlatego nasz protokół skutecznie rozwiązuje problemy ze znalezieniem struktur znakowanego neuronu.
Jeśli koniec aksonu jest dostępny za pomocą mikropipety iniekcyjnej, technikę tę można zastosować do dowolnego neuronu w stadiach larwalnych i dorosłych much lub w innych organizmach. Jeśli nie masz doświadczenia w preparowaniu lub używaniu mikroiniektora, precyzyjna operacja na próbce może być trudna. Zrozumienie anatomii zarodka pomoże w prawidłowym porcjowaniu narzędzi do przeprowadzenia sekcji lub zastrzyku.
Aby rozpocząć, przygotuj i ułóż wszystkie materiały do pobierania zarodków. Przygotuj aparat filtracyjny, przecinając rurkę o pojemności 50 mililitrów i wycinając otwór w nasadce. Następnie umieść filtr siatkowy z porami 100 mikrometrów między rurką a nasadką.
Przygotować mikropipetę do wstrzykiwań barwnika i igłę do rozwarstwiania z tej samej rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 1,2 milimetra. Pociągnij rurkę za pomocą mikropipety, ściągacza przy 7% od maksymalnej mocy wyjściowej 170 V, aby utworzyć ostrą igłę ze stożkiem o długości około 0,4 centymetra. Aby przygotować mikropipetę do iniekcji barwnika, nasącz młynek środkiem zwilżającym i umieść igłę na zacisku mikropipety pod kątem 25 do 30 stopni.
Następnie opuść końcówkę na dwie trzecie promienia od środka powierzchni ukosowania. Zmielić igłę, podczas gdy strzykawka z rurką wpycha do niej powietrze. Oznacz mikropipetę markerem permanentnym z cienką końcówką, aby wskazać położenie otworu na końcówce po ukosowaniu, ponieważ zlokalizowanie wąskiego otworu, który jest utworzony pod kątem, może być trudne.
Pozwól muchom złożyć jaja przez noc w temperaturze pokojowej i zbierz fajkę z jajami rano. Aby zebrać zarodki, odchloruj jajka na talerzu 50% wybielaczem przez pięć minut. Po usunięciu chlorionów przelać zawartość płytki przez aparat filtracyjny lub sitko do komórek, aby wyizolować zarodki.
Użyj wyciśniętej butelki z wodą, aby rozcieńczyć wybielacz pozostały na płytce i zbierz jak najwięcej zarodków, dekantując mieszaninę do filtra. Umyj zarodki trzy do czterech razy wodą, aż zapach wybielacza zniknie. Wyjmij filtr z urządzenia i umyj je wodą na innej czystej płycie.
Następnie zdekantuj wodę z nowej płytki, na której znajdują się zarodki. Użyj cienkich kleszczy, aby wybrać od pięciu do 10 zarodków po 15 godzinach od złożenia jaj i umieść je na dwustronnej taśmie stroną grzbietową skierowaną do góry. Dodać sól fizjologiczną z owadów do basenu rozwarstwiającego, aby chronić zarodki przed wysuszeniem.
Użyj szklanej igły pod mikroskopem preparacyjnym, aby przeciągnąć zarodek z błony środkowej z taśmy na szkło, uważając, aby nie uszkodzić wewnętrznych tkanek zarodka. Następnie przetnij linię środkową pojedynczego zarodka na jego powierzchni od tylnego do przedniego końca. Odwróć tkanki nabłonkowe od środka i przymocuj krawędź naskórka do powierzchni szkiełka
podstawowego.Użyj igły połączonej z rurką z otworem na końcówkę o długości około 300 mikrometrów, aby zassać lub wydmuchać powietrze, aby usunąć grzbietowe podłużne pnie tchawicy, a także wszelkie pozostałe jelita. Użyj 4% PFA i PBS, aby utrwalić zarodki przez pięć minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Następnie umyj je trzykrotnie PBS.
Zarodki należy wybarwić jednym mikrolitrem przeciwciała przeciwko peroksydazie chrzanowej sprzężonego z barwnikiem cyjaniny3 i 200 mikrolitrami PBS przez godzinę na wytrząsarce orbitalnej. I powtórz pranie w PBS. Aby napełnić mikropipetę iniekcyjną, umieść ją w uchwycie kapilarnym.
Następnie umieść szkiełko barwnikowe na stoliku i za pomocą mikromanipulatora umieść je nad szkiełkiem. Następnie wyreguluj stolik, aby umieścić mikropipetę na barwniku. Zebrać barwnik w mikropipecie, ustawiając ciśnienie wtrysku w zakresie od 200 do 500 hektopaskalów, czas wstrzykiwania od 0,1 do 0,5 sekundy, a ciśnienie kompensacyjne do zera na pięć minut.
Po zebraniu barwnika usuń szkiełko barwnikowe i umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Następnie zwiększ ciśnienie kompensacyjne do zakresu od 30 do 60 hektopaskalów i zanurz mikropipetę do próbki. Użyj soczewki obiektywu 10 razy, aby zlokalizować zarodek i wyrównać mikropipetę z zarodkiem.
Zmień soczewkę obiektywu na soczewkę 40 razy zanurzoną w wodzie. I zanurz obiektyw w PBS. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić morfologię neuronów oznaczoną przez anty-HRP Cy3 i określić miejsce wstrzyknięcia.
Gdy zarodek jest w ostrości, zmień położenie mikropipety, aby delikatnie zetknąć się z końcówką aksonu będącego przedmiotem zainteresowania. Następnie użyj mikroskopii jasnego pola podczas wstrzyknięcia, aby zobaczyć kroplę barwnika. Upuść barwnik do prawego półsegmentu brzusznego w połączeniu nerwowo-mięśniowym aCC lub RP3 z DiD lub DiO.
Użyj pilota, aby uwolnić barwnik i wyjąć mikropipetę. Następnie przejdź do następnego miejsca wstrzyknięcia. Przed obrazowaniem należy inkubować próbkę przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.
Za pomocą cienkich kleszczyków usuń taśmy ze szklanego szkiełka. Aby zamontować próbkę, należy przygotować szkiełko nakrywkowe z niewielką ilością smaru próżniowego w czterech rogach. Ostrożnie umieść go na próbce, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
Dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wyregulować przestrzeń od próbki, aby umożliwić odległość roboczą między soczewką obiektywu a szkiełkiem. Usuń nadmiar PBS za pomocą czyszczenia zadań. Całkowicie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
Obraz w 10-krotnym i 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu konfokalnego i przetwarzanie obrazów za pomocą oprogramowania imageJ. Protokół ten został wykorzystany do wstecznego oznaczenia neuronu ruchowego aCC unerwiającego mięśnia pierwszego i mięśnia unerwiającego neuronu ruchowego RP3 szóstego i siódmego. Gałęzie dendrytyczne neuronów ruchowych ACC i RP3 w znacznym stopniu się pokrywają.
Oba neurony są dwubiegunowe, tworząc dwie różne populacje dendrytów. Aby zademonstrować możliwości ilościowe tej metody, policzono całkowitą liczbę końcówek dendrytów w typie dzikim i mutantach Dscam1. Ipsilateralne dendryty aCC są pokazane dla typu dzikiego, ale niewiele dendrytów ipsilateralnych zaobserwowano dla mutanta Dscam1.
Próbując tej procedury, należy pamiętać, że kluczowa jest wielkość kropli barwnika, która wynosi około 10 do 20 mikrometrów. Sprawdzić rozmiar na taśmie dwustronnej, a następnie przyłożyć go do miejsca wstrzyknięcia. Korzystając z tej procedury, możemy wykorzystać właściwość przełączania zdjęć sondy DiD, aby uzyskać obrazy błony plazmatycznej w super rozdzielczości.
W ten sposób możemy badać ultrastrukturalną charakterystykę błon synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym. Zrobiliśmy kliknięcie. Przeprowadziliśmy analizę fenotypową dendrytów aCC w zmutowanym szczepie i odkryliśmy, że wstrzyknięcie Dscam1-Dock-Pak określa miejsce wyrostu dendrytów w aCC.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych embrionów Drosophila z wykorzystaniem lipofilnych barwników fluorescencyjnych. Technika ta wspomaga badania morfogenezy i połączeń neuronalnych w obrębie systemu neuronów ruchowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuroanatomia
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Zrozumienie połączeń neuronalnych jest kluczowe dla badania funkcji układu nerwowego.
- Muszka owocowa Drosophila służy jako organizm modelowy w badaniach neurobiologicznych.
- Barwniki fluorescencyjne umożliwiają wizualizację struktur neuronalnych.
- Techniki śledzenia wstecznego (retrogradnego) pozwalają na lepsze zrozumienie morfologii neuronów.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody śledzenia neuronów ruchowych u Drosophila.
- Ułatwienie badania morfogenezy neuronalnej.
- Poprawa zrozumienia łączności neuronów ruchowych.
Zastosowane metody
- Zastosowanie lipofilnych barwników fluorescencyjnych do śledzenia retrogradnego.
- Wstrzykiwanie barwników do dostępnych zakończeń aksonów za pomocą mikropipety.
- Disekcja zarodków Drosophila w celu ukierunkowanego zastosowania barwnika.
- Obserwacja znakowanych neuronów w celu analizy morfologii i połączeń.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne znakowanie neuronów ruchowych do szczegółowych analiz.
- Wysoka dyfuzja barwnika umożliwia kompleksową wizualizację struktur neuronalnych.
- Metoda jest możliwa do zastosowania zarówno w stadium larwalnym, jak i dorosłym much *Drosophila*.
- Istnieje potencjał zastosowania metody u innych organizmów o podobnych strukturach neuronalnych.
Wnioski
- Ta technika śledzenia jest cennym narzędziem w badaniach neurobiologicznych.
- Zrozumienie anatomii zarodka jest niezbędne do prawidłowego zastosowania tej metody.
- Metoda ta otwiera nowe możliwości prowadzenia dalszych badań nad łącznością neuronalną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokorozdzielcze śledzenie wsteczne neuronów ruchowych embrionów Drosophila przy użyciu lipofilnych barwników fluorescencyjnych umożliwia precyzyjne mapowanie morfologii neuronalnej i połączeń synaptycznych. Możliwość ta wspomaga wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania koncentrujących się na neurobiologii. Ilościowe wyniki tej metody oraz wielokolorowe znakowanie ułatwiają rzetelne przesiewy fenotypowe i analizy porównawcze w różnych tłach genetycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szczegółową analizę morfogenezy neuronów oraz architektury szlaków.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez obrazowanie drobnych cech strukturalnych pojedynczych neuronów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezpośredniej wizualizacji łączności synaptycznej.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe dla badań genetycznych opartych na hipotezach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy neuronalne do dalszych procesów przesiewowych fenotypowych.
- Zapewnia powtarzalne, gęste znakowanie niezbędne do opracowania zestandaryzowanych testów.
- Umożliwia wielokolorowy tracing w celu rozróżnienia sąsiadujących populacji neuronów w analizach multipleksowych.
- Wspiera wiarygodną kwantyfikację cech dendrytycznych i synaptycznych do oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu chorób, umożliwiając analizę fenotypów mutantów wpływających na strukturę neuronów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki zastosowaniu ilościowych punktów końcowych morfologii.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z architekturą neuronów.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych za pomocą odczytów strukturalnych w systemach modelowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta technika śledzenia wstecznego integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie łączności i morfologii neuronów.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne znakowanie do ilościowej analizy fenotypowej.
- Analityka: Umożliwia pomiar liczby końcówek dendrytów oraz nakładania się synaps na potrzeby badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy mutacje genetyczne ze strukturalnymi fenotypami neuronów, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Zastosowania korporacyjne: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla zróżnicowanych badań neurogenetycznych i łączności na różnych etapach rozwojowych oraz u różnych organizmów modelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuronalnych i zmniejsza niejednoznaczność mechanicystyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wysokorozdzielcze znakowanie neuronów i wspiera skalowalne, powtarzalne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie ilościowych, porównawczych danych morfologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli neurobiologicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrodysekcji embrionalnej i mikroiniekcji.
- Wymaga dostępu do infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej.
- Konieczna jest standaryzacja wielkości kropli barwnika i parametrów iniekcji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych etapów rozwoju i potencjalnie do innych organizmów modelowych z dostępnymi zakończeniami aksonów.
- Skuteczność celowania i powtarzalność zależą od precyzyjnej wiedzy anatomicznej.
