Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Ocena właściwości kurczliwych miofibryli wyizolowanych z mięśni prążkowanych może być wykorzystana do określenia, czy dysfunkcja sarkomeru jest główną przyczyną osłabienia mięśni z powodu mutacji w białkach sarkomerycznych. Technika ta może być wykorzystywana do pozyskiwania danych o bardzo wysokim stosunku sygnału do szumu o rozdzielczości nanoniutonów. Protokół ten jest również odpowiedni do pomiaru kurczliwości w przepuszczalnych kardiomiocytach.

Należy pamiętać, że przetwornik siły jest bardzo delikatny. Tak więc podczas usuwania kleju z igły montażowej lub podczas klejenia miofibrylu musisz mieć pewną rękę, dużo praktyki i dużo cierpliwości. Przed zamontowaniem tkanki należy umieścić pręt homogenizujący w probówce zawierającej tkankę mięśniową.

Trzymając rurkę na lodzie, obracaj wirnikiem przez 15 sekund z prędkością piątą. Pod koniec homogenizacji przenieść 50 mikrolitrów powstałej zawiesiny miofibrylowej i 250 mikrolitrów roztworu relaksującego na szkiełko pokryte poli-HEMA w kąpieli tkankowej. Przykryj wannę pokrywką, aby chronić mieszaninę przed kurzem i odczekaj 5 do 10 minut, aby miofibryle opadły na dno kropli.

Podczas tonięcia miofibryli podgrzej szelak i klej etanolowy w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 do 60 sekund, a następnie dodaj około sześciu mikrolitrów kleju na niepowlekane szkiełko podstawowe. Kilkakrotnie zanurzaj końcówkę każdej igły montażowej w kleju, aż będzie widoczna warstwa kleju. Następnie za pomocą mikromanipulatorów przesuń sondę i piezo w pionie, aby zrobić miejsce na kąpiel tkankową na stoliku mikroskopu i usuń szklane szkiełko zawierające klej.

Po zamontowaniu miofibryli, aby zmierzyć długość sarkomeru, przesuń sondę piezoelektryczną i/lub siłową, aby ustawić początkową długość sarkomeru miofibrylu na 2,5 mikrometra. Korzystając z funkcji naczynia w oprogramowaniu sterownika systemu, zmierz długość i szerokość miofibryli. Użyj stolika mikroskopowego, aby ustawić miofibryl na środku obrazu wideo i rozciągnij prostokąt z jednej strony miofibrylu na drugą, zwracając uwagę, aby uwzględnić ciemną krawędź kropelek kleju.

Aby rozpocząć rejestrowanie danych, kliknij przycisk Start. Po pięciu sekundach kliknij przycisk pauza. Długość zostanie zarejestrowana.

Aby zmierzyć szerokość, obróć kamerę o 90 stopni, aby zobaczyć kontrast krawędzi samej miofibryli. Dostosuj prostokąt i kliknij start, aby rozpocząć rejestrowanie danych. Po pięciu sekundach kliknij przycisk pauza.

Szerokość zostanie zarejestrowana. Aby ustawić szkło theta, użyj okularu i manipulatora, aby ostrożnie przesunąć szkło theta w kierunku miofibrylu. Dopasuj górny kanał szkła theta do miofibrylu i wykonaj szybki krok, aby sprawdzić pozycję.

Włącz przepływ rozluźniający tło, aby sprawdzić wyrównanie szkła theta i użyj dźwigni zaworu Luer, aby włączyć dopływ do komory przepływowej. Następnie, aby rozpocząć opróżnianie komory przepływowej i zapobiec przepełnieniu komory przepływowej, należy ustawić zawór pompy odpływowej na zawór kąpielowy drugi, tryb mikrokroku na mikro, docelowy tłok na 48 000, a prędkość tłoka na 38 na 40. Aby zmierzyć szybkość przebudowy napięcia, oblicz ruch piezoelektryczny niezbędny do poluzowania miofibrylu o 15% i wprowadź tę wartość do generatora sygnału.

Kliknij wznów, aby kontynuować rejestrowanie danych i otwórz zawory pierwszy i szósty, aby rozpocząć przepływ roztworu relaksacyjnego i różnych stężeń wapnia odpowiednio przez szkło theta. Wybierz resetowanie zakresu na interferometrze, aby zresetować zakres interferometru tak, aby siła podstawowa wynosiła zero woltów. Gdy ślad siły jest stabilny, wykonaj szybki krok ze szkłem theta z krokiem o rozmiarze 100 mikrometrów.

Gdy plateau siły zostanie osiągnięte, wykonaj ponowne rozciąganie skracające za pomocą piezo. Zostanie zarejestrowany ślad relaksacji aktywacji. Kliknij pauzę.

Aby wykonać rozciąganie krokowe, kliknij start i zresetuj zakres interferometru tak, aby siła podstawowa wynosiła zero woltów. Wykonaj stopniowe rozciąganie za pomocą generatora sygnału. Po zakończeniu rozciągania użyj piezofibrylu, aby skrócić miofibryl do długości luzu.

Następnie naciśnij pauzę i zatrzymaj się, a następnie zapisz dane. Pokazano tu ślady siły z eksperymentu z aktywną siłą z miofibrylem wyizolowanym ze zdrowego ludzkiego mięśnia czworogłowego. Miofibryl aktywowano pięciokrotnie roztworami o różnych stężeniach wapnia, przy średniej maksymalnej sile wszystkich miofibryli wynoszącej około 123 miliniutonów na milimetr kwadratowy.

Konstrukcja krzywej siły stężenia wapnia na podstawie sił plateau osiąganych podczas każdej aktywacji w każdej z pięciu krzywych wapniowych pozwala na obliczenie stężenia wapnia przy 50% maksymalnej produkcji siły. Jak pokazano w tej reprezentatywnej analizie, miofibryle można leczyć wieloma związkami w jednym eksperymencie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące typu miofibryli. Siła czynna i długość sarkomeru mogą być również mierzone, aby umożliwić obliczenie szybkości przebudowy, aktywacji i relaksacji.

Gwałtowny wzrost pokazany w kropkowanym czerwonym polu jest spowodowany zarówno lepkością, jak i elastycznością. Plateau przypomina tylko składnik elastyczny. Ponieważ lepkość jest odporna na odkształcenia liniowo, siła spadła po usunięciu odkształcenia.

Podczas ustawiania szkła theta upewnij się, że jest ono prawidłowo wyrównane z miofibrylem. W przeciwnym razie roztwór aktywujący może znaleźć się między światłowodem a wspornikiem sondy siłowej, co spowoduje pojawienie się artefaktów w danych. Ponadto miofibryl może nie aktywować się prawidłowo.

Ta metoda perfuzji jest również odpowiednia do określenia rodzaju włókien mięśniowych miofibrylu. Na przykład możesz najpierw perfuzjować miofibryl normalnym roztworem wapnia, a następnie perfuzję tego samego roztworu, ale następnie dodać specyficzny dla włókien mięśniowych związek zwiększający siłę.