Wkraplanie dotchawicze komórek macierzystych u nowonarodzonych szczurów donoszonych

Opisany jest protokół do wykonywania dotchawniczego przeszczepu mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) poprzez wstrzyknięcie dotchawicze u noworodków szczurów donoszonych. Technika ta jest klinicznie realną opcją dostarczania komórek macierzystych i leków do płuc noworodków szczurów w celu oceny ich skuteczności.

Wkraplanie dotchawicze jest kliniczną metodą biotechniczną służącą do dostarczania komórek macierzystych i leków do płuc noworodków w celu oceny skuteczności szczepionki Chilmana. Technika ta może być stosowana w dobrej wierze z różnymi podstawowymi zastosowaniami u noworodków szczurów i jest stosunkowo łatwym i opłacalnym środkiem leczenia chorób płuc. W piątym dniu po urodzeniu należy unieruchomić znieczulone młode szczurów Sprague-Dawley na stanowisku do intubacji pod kątem 60 stopni.

I przymocuj taśmę do etykietowania laboratoryjnego do wszystkich czterech kończyn każdego szczeniaka, aby zabezpieczyć je na miejscu. Nałóż taśmę pod każdym nosem, aby przymocować głowy. I wskaż pierwszą szyję do tracheotomii nakłucia.

Użyj wacika do przygotowania 75% nasączonego alkoholem, aby zdezynfekować obszar nacięcia. I wykonaj pionowe 3-centymetrowe nacięcie w linii środkowej nad tchawicą, aby uniknąć uszkodzenia tętnic szyjnych. Użyj zakrzywionej, stożkowej pęsety bez haczyka, aby oddzielić warstwy tłuszczu i mięśni, aby zlokalizować tchawicę.

Kiedy tchawica może być obserwowana, użyj pęsety, aby chwycić tchawicę i użyj strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów wyposażonej w igłę o rozmiarze 30, aby wstrzyknąć jeden razy dziesięć piątych komórek zrębu lucyferazy świetlika GFP oznaczonych w 30 mikrolitrach soli fizjologicznej do tchawicy, podczas fazy wdechowej. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek zamknij nacięcie jedwabnym ściegiem 160, zawiązując węzeł tak mocno, jak to możliwe. I przycinanie końców szwu tak krótko, jak to możliwe.

Następnie pozwól szczenięciu dojść do siebie po znieczuleniu, w ciepłym miejscu z monitorowaniem, aż stanie się ciepłe, różowe i zdolne do spontanicznych ruchów, zanim wróci do klatki. Aby śledzić przeszczepione ludzkie mezenchymalne komórki zrębu 15 minut po wyzdrowieniu szczurów po operacji, wstrzyknij dootrzewnowo znieczulonym szczeniętom 125 miligramów na kilogram lucyferiańskiej soli potasowej w PBS. 10 minut po wstrzyknięciu należy użyć systemu obrazowania małych zwierząt, aby uzyskać sekwencyjne obrazy w odstępach 5-15 sekund ze średnim biningiem, 1 przysłoną i polem widzenia 26 centymetrów.

Następnie użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo aktywność luminescencji z płuc w oparciu o automatyczne obszary zainteresowania. Wysoki poziom ekspresji GFP obserwuje się w ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych znakowanych lucyferazyą świetlika. Mezenchymalne komórki macierzyste można dodatkowo scharakteryzować poprzez ekspresję markerów powierzchniowych komórek i ich zdolność do różnicowania się w osteocyty, chondrocyty i adipocyty.

Obrazowanie luminescencyjne przeszczepionych ludzkich komórek mezenchymalnych w systemie VIVO ujawnia brak sygnalizacji luminescencyjnej w obszarach płuc szczurów leczonych zwykłą solą fizjologiczną. U szczurów leczonych mezenchymalnymi komórkami macierzystymi obserwuje się luminescencję w tchawicy i centralnych obszarach płuc tych zwierząt. Rzeczywiście, w tej reprezentatywnej analizie kwantyfikacja intensywności luminescencji wykazała, że szczury leczone mezenchymalnymi komórkami macierzystymi wykazywały około 13-krotny wzrost aktywności luminescencji w porównaniu ze szczurami leczonymi zwykłą solą fizjologiczną.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby wypreparować i wyizolować tchawicę bez ograniczania otaczających tętnic. Technika ta pozwala na badanie efektów dotchawiczego podawania komórek i leków w chorobie Palmera u noworodków za pomocą promieni w trybie pacjenta