Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Tak więc analiza metylacji DNA w całym genomie za pomocą platformy LA pod kątem złożonej aberracji metylacji DNA w ludzkim genomie może dostarczyć ważnych informacji na temat biomarkerów epigenetycznych w raku przewodu pokarmowego. Chociaż ta platforma LA do złożonej aberracji metylacji DNA w ludzkim genomie jest optymalna pod względem kosztów i pokrycia genomu. Procedurę zademonstruje Hirotaka Momose, doktorantka z mojego laboratorium.

Na początek przygotuj 10 mikrometrów niebarwionych skrawków parafiny utrwalonych w formalinie. Umieść szkiełka w szklanym uchwycie na szkiełko i napełnij je solą fizjologiczną, upewniając się, że cała tkanka na szkiełku jest zanurzona. Pozostaw szkiełka w ksylenie na 15 minut, a następnie wylej ksylen, trzymając szkiełka końcówką pipety, aby nie wypadły.

Wlej więcej ksylenu do tego samego poziomu co poprzednio i powtórz inkubację. Wylej ksylen i napełnij uchwyt szkiełka 100% etanolem, upewniając się, że cała tkanka na szkiełku jest całkowicie zanurzona. Pozostaw szkiełka w etanolu na trzy minuty, a następnie zastąp etanol świeżym etanolem i pozwól im inkubować przez kolejne dwie minuty.

Odlej etanol i usuń szkiełka. Ostrożnie połóż je ekranem do góry na czystym ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Napełnij 1,5-mililitrową jednorazową probówkę polipropylenową 80 mikrolitrami buforu do lizy i włóż czystą końcówkę pipety do buforu.

Zidentyfikuj tkanki rakowe w obszarze guza najbardziej odpowiednie do makrodysekcji zgodnie z odpowiednim przekrojem barwionym H&E, a następnie wykonaj makrosekcję tkanki rakowej na podstawie zaznaczonego odcinka. Weź czystą żyletkę i delikatnie zeskrob tkankę rakową ze szkiełka, próbując utrzymać ją w jednym kawałku. Za pomocą końcówki pipety przenieś zeskrobaną tkankę do fiolki z buforem do lizy.

Powtórz ten proces z pozostałymi slajdami. Po tym, jak cała tkanka znajdzie się w probówce, użyj końcówki, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona i nie jest przyklejona do ściany. Dodać 20 mikrolitrów proteazy serynowej związanej z subtylizyną do fiolki i delikatnie strzepnąć, aby wymieszać.

Umieść fiolkę w bloku grzewczym o temperaturze 55 stopni Celsjusza na co najmniej cztery godziny lub na noc, upewniając się, że po dwóch godzinach lekko zawirowałeś. Zabieg wodorosiarczynowy należy wykonać na 45 mikrolitrach strawionej tkanki za pomocą zestawu do konwersji wodorosiarczynu zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać pięć mikrolitrów buforu rozcieńczającego do próbki i inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

W międzyczasie przygotuj odczynnik konwersyjny wodorosiarczynu, dodając 750 mikrolitrów wody destylowanej i 210 mikrolitrów buforu rozcieńczającego do jednej probówki odczynnika konwersyjnego CT. Wymieszaj probówki, wirując przez 10 minut, a następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego odczynnika konwersji CT do każdej próbki i wymieszaj przez inwersję. Próbki inkubować w ciemności w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin.

Po inkubacji umieścić próbki na lodzie na 10 minut. Dodać 400 mikrolitrów buforu wiążącego i wymieszać każdą próbkę, pipetując w górę iw dół. Załaduj każdą próbkę do kolumny wirującej i umieść kolumnę w dwumililitrowej probówce zbiorczej.

Odwirować próbki z pełną prędkością przez jedną minutę i odrzucić przepływ. Dodaj 200 mikrolitrów buforu do płukania do każdej kolumny i wiruj z pełną prędkością przez jedną minutę, a następnie wyrzuć przepływ. Dodać 200 mikrolitrów buforu odsiarczającego do każdej kolumny i pozostawić kolumny w temperaturze pokojowej na 15 minut.

Po inkubacji obracać kolumny z pełną prędkością przez jedną minutę i odrzucić przepływ. Przemyć kolumnę dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu do płukania, odwirowując przez jedną minutę z pełną prędkością po każdym płukaniu. Dodaj 46 mikrolitrów wody destylowanej do każdej kolumny i umieść ją w nowej sterylnej jednorazowej tubie polipropylenowej o pojemności 1,5 mililitra.

Obracaj probówki przez dwie minuty, aby wymyć DNA i wyrzuć kolumnę. DNA jest teraz gotowe do analizy. Użyj zmodyfikowanego DNA wodorosiarczynu jako matrycy do ilościowego PCR specyficznego dla metylacji w celu oceny metylacji regionu promotora w każdej analizie genu.

Połącz odczynniki zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym i użyj 96-dołkowego instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym, aby uruchomić protokół termocykli. Przedstawiono charakterystykę 48 pacjentów z rakiem żołądka w kohorcie treningowej. Średni wiek pacjentów wynosił 74 lata, a kohorta obejmowała 38 mężczyzn i 10 kobiet.

Po pierwsze, załadowano wszystkie 48 próbek w celu identyfikacji wartości odstających. Dwie próbki dały piki, które były większe niż dwa odchylenia standardowe przemieszczone od pozostałych, a próbki te zostały usunięte. Uzyskaną mapę cieplną podzielono na dwie grupy w oparciu o wysoką i niską metylację.

Ta mapa cieplna umożliwia wizualizację 50 pierwszych sond w obrębie 1 500 par zasad od miejsca rozpoczęcia transkrypcji w różnicowej analizie metylacji. Rodzaj nowotworu i obecność przerzutów do węzłów chłonnych okazały się istotnymi niezależnymi czynnikami predykcyjnymi, gdy kliniczne czynniki patologiczne zostały wykorzystane jako zmienne towarzyszące w analizie wieloczynnikowej. Wreszcie, stwierdzono, że gen EPB41L3 jest silnie związany z kodyfikacją kohorty treningowej na grupy o wysokiej i niskiej metylacji w analizie mikromacierzy.

Wyniki analizy mikromacierzy dla EPB41L3 w kohorcie testowej zostały zweryfikowane za pomocą ilościowej PCR specyficznej dla metylacji. RMV EPB41L3 w tkankach PGC były znacznie wyższe niż te w resztkowym raku żołądka w analizie jednoczynnikowej. Podobnie, RMV w próbkach z przerzutami do węzłów chłonnych były znacznie wyższe niż te bez przerzutów do węzłów chłonnych.

Tak więc identyfikacja na tkance nowotworowej najbardziej odpowiedniej do makrodysekcji zgodnie z odpowiednim wycinkiem barwionym H&E jest wymagana do pomyślnego przeprowadzenia tego protokołu.