Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 u nitkowatego workowca Huntiella omanensis

Nasz protokół jest istotny, ponieważ daje naukowcom pracującym nad grzybami niemodelowymi możliwość ustanowienia najnowocześniejszych technologii edycji genomu w swoich laboratoriach. Ponieważ protokół ten nie opiera się na istniejących technikach, takich jak systemy wyrażeń, ma tę zaletę, że jest łatwiejszy do ustanowienia w systemach niemodelowych. Metoda ta może być stosowana w odniesieniu do różnych gatunków grzybów i może być stosowana do wyjaśniania funkcji genów zaangażowanych w kojarzenie szlaków, wzrost i patogenność.

Tak więc, wykonując tę procedurę, należy upewnić się, że masz wystarczająco dużo kolejnych dni, aby zakwestionować protokół, ponieważ w eksperymencie jest tylko kilka punktów, w których można go wstrzymać. Aby zebrać konidia, przefiltruj płynną kulturę przez warstwę sterylnej tkaniny laboratoryjnej do 50-mililitrowych probówek wirówkowych do odwirowania. Ponownie zawiesić osad konidiów w pięciu mililitrach wody i wyświetlić 10-mikrolitrową porcję roztworu konidiów pod mikroskopem świetlnym przy 40-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić, że odzyskano tylko konidia.

Następnie dodaj 200 mililitrów świeżego 1% bulionu z ekstraktu słodowego do kolby o pojemności 500 mililitrów i przenieś całą objętość konidiów do kolby. Następnie inkubuj płynną kulturę przez maksymalnie 12 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 25 stopni Celsjusza z prędkością 120 obrotów na minutę. Aby zebrać kiełki, przenieś kulturę do 50-mililitrowych probówek wirówkowych do odwirowania i ponownie zawieś kiełki w maksymalnie 10 mililitrach jednego molowego sorbitolu.

Dodaj jeden mililitr roztworu do kiełkowania do roztworu enzymatycznego o różnych stężeniach i inkubuj roztwór enzymu zarodnikowego przez dwie do trzech godzin w inkubatorze do wytrząsania z prędkością 80 obrotów na minutę. Aby zebrać protoplasty, przefiltruj roztwór enzymu przez warstwę sterylnej tkaniny laboratoryjnej i zbierz protoplasty przez odwirowanie. Następnie ostrożnie ponownie zawiesić osad protoplastu w 200 mikrolitrach buforu STC i sprawdzić 10 mikrolitrów podwielokrotności roztworu pod mikroskopem, aby potwierdzić, że odzyskano tylko protoplasty.

Aby rozpocząć transformację, połącz około pięć razy 10 do sześciu protoplastów z pojedynczą objętością roztworu rybonukleoproteiny i około sześcioma mikrogramami fragmentu DNA dawcy. Następnie za pomocą pipety powoli i równomiernie wlej jeden mililitr świeżo przygotowanego 30% roztworu PTC na zawiesinę protoplastów, aby utworzyć hydrofobową warstwę na protoplastach i inkubować roztwór przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać pięć mililitrów osmotycznej pożywki kontrolnej do zawiesiny protoplastów, pipetując powoli i delikatnie, aby dokładnie wymieszać roztwór.

Po wymieszaniu inkubować roztwór protoplastu w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 80 obrotów na minutę przez noc. Następnego ranka podziel roztwór między pięć 60-milimetrowych płytek hodowlanych. Dodaj 10 mililitrów agaru z osmotyczną pożywką kontrolną uzupełnioną 30 mikrogramami na mililitr higromycyny B do każdej płytki i powoli obracaj każdą płytkę, aby wymieszać.

Poczekaj, aż pierwsza warstwa agaru stwardnieje przed dodaniem 10 mililitrów agaru z osmotyczną pożywką kontrolną uzupełnioną 40 mikrogramami na mililitr higromycyny B po dwie na każdą płytkę. Po pozostawieniu drugiej warstwy agaru do zastygnięcia, inkubuj kultury w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż będzie można zaobserwować pojedyncze izolaty rosnące przez obie warstwy agaru. Aby odzyskać pomyślnie przekształcone izolaty, przenieś poszczególne izolaty zdolne do wzrostu na świeże płytki agarowe z ekstraktem słodowym uzupełnione 50 mikrogramami na mililitr higromycyny B.To ocenić wpływ docelowego rozerwania genu na zdolności heterotalliczne grzyba, zaszczepić świeże podłoże agarowe z ekstraktem słodowym jednym zmutowanym szczepem, a także szczepem o przeciwnym typie krycia.

Podczas pracy z H.omanensis należy przykryć, ale nie uszczelniać płyt. Umieść talerze w temperaturze pokojowej na siedem dni. Pod koniec inkubacji oceń wizualnie produkcję struktur płciowych.

Aby przetestować zdolności homotalliczne zmutowanego szczepu, należy zaszczepić świeże podłoże agarowe z ekstraktem słodowym zmutowanym szczepem będącym przedmiotem zainteresowania i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jeden tydzień, jak pokazano. Aby ocenić wpływ zakłócenia na tempo wzrostu badanego grzyba, włóż tylną stronę dużej sterylnej końcówki pipety w aktywnie rosnące krawędzie kultury każdego zmutowanego i dzikiego szczepu będącego przedmiotem zainteresowania, aby stworzyć pokryte grzybnią korki agarowe i zaszczepić świeżą pożywkę agarową z ekstraktem słodowym. Należy przeprowadzić co najmniej trzy powtórzenia dla każdego typu kultury.

Po trzech dniach wzrostu w temperaturze 20 stopni Celsjusza zmierz wzrost na każdej płytce o dwóch prostopadłych średnicach. Konidiom używanym jako materiał wyjściowy dla protokołu pozwala się kiełkować i rosnąć, dopóki nie staną się młodymi kiełkami. Zauważ, że dojrzałe pasma grzybni, takie jak te, są zbyt dojrzałe do degradacji i nie powinny być używane.

Kiedy komórki nie mają już ścian komórkowych, stają się bardzo wrażliwe na zakłócenia mechaniczne i uwalniają okrągłe protoplasty, które można zebrać w celu transformacji. Powodzenie protokołu można potwierdzić na podstawie analizy fenotypowej zmutowanych szczepów. W przypadku tego zmutowanego izolatu MAT 127 tempo wzrostu wegetatywnego promieniowego zostało znacznie zmniejszone, co sugeruje plejotropowy efekt nowego genu kojarzenia.

Co więcej, zmutowany izolat nie był zdolny do zakończenia cyklu płciowego, wytwarzając tylko niedojrzałe struktury płciowe, które nie wytwarzały zarodników płciowych, w porównaniu z izolatem typu dzikiego, który zakończył cały cykl płciowy w ciągu kilku dni od inkubacji. RNA jest bardzo wrażliwe i bardzo łatwo ulega degradacji. Dlatego zarówno czyste środowisko pracy, jak i szybka praca na lodzie są niezbędne dla powodzenia tego eksperymentu.

Po pomyślnym wygenerowaniu zmutowanego izolatu można je poddać analizie fenotypowej lub analizie sekwencyjnej RNA, w zależności od charakteryzowanego genu.