Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Przedstawiony tutaj protokół zmniejsza nadmierne uszkodzenia spowodowane hipoksją podczas przygotowywania dorosłych i starzejących się wycinków hipokampa myszy, usuwając w ten sposób główną przeszkodę w badaniu funkcji dojrzałych i starzejących się obwodów nerwowych. Wprowadzenie hipotermii w roztworach bezsodowych powoduje, że plastry hipokampa są zdrowe do 10 godzin po cięciu i nadają się zarówno do długoterminowych zapisów terenowych, jak i badań typu patch-clamp. Ta metoda przygotowywania wycinków hipokampa może być szczególnie istotna dla modeli zwierzęcych w chorobach neurodegeneracyjnych, które z definicji wymagają przygotowania starzejącego się mózgu.

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest wprowadzenie hipotermii poprzez obfitość przezsercową z lodowatym roztworem. Przy odrobinie wprawy badacze będą w stanie niezawodnie wykonać ten krok. Zacznij od przygotowania jednego litra roztworu CSF do komory rekuperacyjnej i kolejnych zapisów.

Następnie przygotuj 300 mililitrów NMDG-aCSF do etapów obfitości przezsercowej i cięcia. Umieść wibrującą tacę do cięcia mikrotomów i tarczę montażową w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować komorę regeneracji, napełnij ją tuż nad siatką przytrzymującą plastry i uruchom bełkotkę, utrzymując komorę na stole w temperaturze pokojowej.

Schłodź całe 300 mililitrów NMDG-aCSF w zamrażarce, aż kryształki lodu zaczną tworzyć się na powierzchni i ściankach butelki. Umieść butelkę ze schłodzonym NMDG-aCSF na lodzie i bąbelkuj, utrzymując roztwór w temperaturze od zera do dwóch stopni Celsjusza. Wyjmij dysk montażowy chusteczki higienicznej z zamrażarki i wytrzyj go do sucha, jeśli to konieczne.

Wytnij blok 5% agaru wielkości mózgu myszy i przyklej go na środku dysku za pomocą cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego. Umieść krążek z przyklejonym agarem na lodzie i przykryj ręcznikiem papierowym, aż będzie gotowy do użycia. Wyjmij tackę do krojenia z zamrażarki, umieść ją w mikrotomie, a następnie otocz ją lodem i załaduj ostrze.

Przygotuj wszystkie narzędzia z wyprzedzeniem do sekcji mózgu. Ustawić pompę perystaltyczną do perfuzji przezsercowej. Włóż jedną stronę rurki pompy do butelki z lodowatym NMDG-aCSF i dopasuj drugą stronę igłą o rozmiarze 27.

Ustaw prędkość pompy na około 3.5 mililitra na minutę. Przy tej prędkości odpływ NMDG-aCSF jest szybką podróżą, a nie przepływem ciągłym. Połóż mysz na plecach na pieluszce.

Przed kontynuowaniem potwierdź, że mysz znajduje się w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. Mysz powinna nie reagować, a następnie przykleić taśmą przednie i tylne nogi, tak aby klatka piersiowa i brzuch były odsłonięte. Wytnij duży fragment skóry na klatce piersiowej, idący od spodutka do gardła.

Chwyć mostek kleszczami, delikatnie go unieś i zacznij przecinać klatkę piersiową po obu stronach, aż jama klatki piersiowej zostanie odsłonięta. Przeciąć przeponę, pozostawiając klapę klatki piersiowej przymocowaną za pomocą cienkiego kawałka mięśnia. Powinno być możliwe odłożenie go na bok bez ponownego opadania na odsłoniętą jamę klatki piersiowej.

Sprawdź, czy serce nadal bije i upewnij się, że większość wątroby jest widoczna. Włóż igłę do lewej komory, która ma jaśniejszy kolor niż prawa. Aby ustabilizować igłę, przebij ją przez pozostałe żebra po lewej stronie ciała.

Zlokalizuj ciemnoczerwone prawe przedsionek i przetnij je małymi nożyczkami. Krew powinna zacząć wypływać. Uruchom pompę i obserwuj wątrobę, która zmieni kolor z czerwonego na brązowy.

Monitoruj kolor wątroby i kontynuuj perfuzję, aż wątroba zmieni kolor na bladobrązowy. Uruchom pompę jeszcze na kilka minut. Temperatura ciała zwierzęcia powinna spaść do 28 do 29 stopni Celsjusza, a jego nos powinien być zimny w dotyku.

Odetnij głowę myszy dużymi nożyczkami do dekapitacji, a następnie użyj skalpela z ostrzem numer 10, aby rozciąć skórę na szczycie czaszki. Małymi kątowymi nożyczkami przetnij czaszkę na linii środkowej. Następnie użyj kleszczy numer trzy, aby podważyć prawą i lewą połowę czaszki, uważając, aby zabrać ze sobą oponę twardą.

Usuń mózg, który powinien mieć kolor złamanej bieli, wyjmując go szpatułką i wrzuć do roztworu NMDG-aCSF na lodzie. Zostaw go tam na maksymalnie minutę. Wyjmij mózg z NMDG-aCSF i umieść go na kawałku bibuły filtracyjnej.

Wytnij i usuń klin tkanki pod kątem 60 stopni za pomocą narzędzia 60 stopni wyśrodkowanego na linii środkowej od rostralnego końca przodomózgowia. Użyj przyciętych boków powierzchni montażowej, ponieważ zapewnia ona odpowiedni kąt dla plastrów hipokampa. Oddziel półkule wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela i przyklej je do dysku montażowego.

Wyjmij tarczę montażową z lodu i wytrzyj ją do sucha, jeśli to konieczne. Następnie przyklej każdą półkulę przed blokiem agaru, przyciętą stroną do dołu. Upewnij się, że brzuszne strony obu półkul stykają się z blokiem agaru i że grzbietowe strony obu półkul są skierowane w stronę ostrza.

Po przyklejeniu po stronie ciętej każda półkula powinna być zorientowana względem ostrza w taki sposób, aby zapewnić poprzeczne przekroje grzbietowego hipokampa in situ. Zanurz dysk z półkulami w komorze tnącej zawierającej lodowaty karbogenowany NMDG-aCSF. Wyciąć odcinek o grubości 400 mikrometrów, a następnie użyć jednorazowej pipety transferowej z końcówką odcinającą, aby przenieść plasterek do komory odzyskiwania zawierającej karbogenowany NMDG-aCSF w temperaturze pokojowej.

Kontynuuj cięcie pozostałych odcinków i przenoszenie ich do komory regeneracyjnej, nie zajmując więcej niż 10 minut, aby pokroić w sumie od ośmiu do 10 plasterków z grzbietowego obszaru hipokampa. Inkubować plastry w temperaturze pokojowej przez około dwie godziny przed zapisem. Protokół ten został wykorzystany do wygenerowania wycinków hipokampa od dorosłych myszy.

Duża liczba komórek piramidowych w polu CA1 i subiculum pojawia się w niskim kontraście, co jest cechą charakterystyczną zdrowych komórek, gdy jest obserwowana pod mikroskopią różnicową z kontrastem w podczerwieni. Zapisy patch-clamp można uzyskać z neuronów CA1 myszy w wieku powyżej sześciu miesięcy. W tym przykładowym eksperymencie zmierzono częstotliwość miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych po indukcji NMDA-LTD w stosunku do warunków kontrolnych.

Częstość występowania miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych była niższa w neuronach po indukcji NMDA-LTD, co wskazuje na zależne od aktywności przycinanie streszczeń w CA1. Nie wykryto zmian amplitudy. Podczas zapisów mEPSC komórki CA1 zostały również wypełnione biocytyną i nienaruszoną trzpieniem dendrytycznym oraz zdrowym pokrojem komórek neuronów piramidowych.

Solidny rozkład barwnika fluorescencyjnego w komórce umożliwia analizę dendrytów i kolców dendrytycznych w różnych warunkach. Zaobserwowano długoterminowe wzmocnienie (LTP) synaps CA3-CA1 o około 170%, co sugeruje, że utrzymanie kaskad sygnałowych potrzebnych do LTP jest obecne w wycinkach przygotowanych z dorosłych myszy. Silny sygnał potencjału postsynaptycznego pobudzającego pole sugeruje, że łączność sieciowa również została zachowana.

Dwa krytyczne aspekty protokołu to profuzja przezsercowa z lodowatym roztworem w celu wywołania hipotermii oraz wprowadzenie NMDG jako substytutu jonów sodu w roztworach w celu zapobiegania obrzękom cytotoksycznym. Stosując te środki ostrożności, ostre plastry można przygotować z dowolnego obszaru mózgu. Co więcej, tak przygotowane plastry mogą być wykorzystywane do obrazowania wapnia i napięcia za pomocą mikroskopii dwufotonowej lub szerokopolowej.

Protokół ten może służyć jako podstawa do standaryzowanego preparatu do ostrych wycinków hipokampa ze starzejących się zwierząt, a tym samym ułatwić porównania między badaniami w kontekście mechanizmów choroby neurodegeneracyjnej.