Name: Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę oceny inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D przy użyciu sferoidów w agarozowych komórkach wielodziurkowych. Technika umożliwia jednoczesne monitorowanie procesów w jednym urządzeniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Virginie Ory za pomocne dyskusje i porady na temat podejścia modelu 3D co-culture. Dziękujemy również Elizabeth Jones za doskonałą pomoc techniczną przy sekcji IHC. Badanie to było wspierane przez granty z DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) dla YL (LI 2547/4-1) i National Institutes of Health dla AW (R01 CA231291), dla ATR (R01 CA205632), dla GWP (R01 CA218670) oraz Core Grant Centrum Onkologii (P30 CA51008).

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li>
<li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li>
<li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+of+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li>
<li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial%2C+endothelial%2C+and+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li>
<li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li>
<li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367(2016).</li>
<li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening%3A+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103(2016).</li>
<li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li>
<li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput%2C+High-content+Phenotypic+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039(2018).</li>
<li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li>
<li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428(2017).</li>
<li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351(2015).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868(2015).</li>
<li>Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html">http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html</a> (2014).</li>
<li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin%2C+collagen+IV+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li>
<li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen%27s+RNeasy+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protocol+Place%22%5BJournal%5D)">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiona tutaj metoda opisuje generowanie sferoidów guza 3D, które umożliwia kohodowlę z komórkami T, testy funkcjonalne i molekularne oparte na komórkach, a także różnorodne możliwości monitorowania i analizy przy użyciu jednego urządzenia. Główną zaletą naszego podejścia jest to, że nie wymaga ono przenoszenia kultury 3D do oddzielnego testu i zachowuje integralność kultury 3D przez cały czas trwania testów.
Przedstawiony tutaj przepływ pracy można modyfikować w zależności od potrzeb. C...

Pomimo znacznego postępu w immunoterapii nowotworów w ciągu ostatniej dekady, nasze mechanistyczne zrozumienie wrażliwości i odporności na leczenie jest nadal dość słabe1. Powszechnie wiadomo, że nowotwory wykazują znaczną niejednorodność i że dynamiczne interakcje komórek nowotworowych z ich mikrośrodowiskiem, jak również z komórkami odpornościowymi, wpływają na śmierć komórek nowotworowych, inwazyjne zachowanie i odpowiedź na leczenie, które obejmuje immunoterapię1,2,3. Jako jedno ramię adaptacyjnego układu odpornościowego, limfocyty T wykonują cytotoksyczność specyficzną dla komórki. Analiza rozpoznawania limfocytów T i odpowiedzi na nie komórkom nowotworowym dostarcza mechanistycznego wglądu w oporność i wrażliwość na leczenie immunomodulacyjne.
Modelowanie in vitro i monitorowanie interakcji między rakiem a limfocytami T w odpowiednim środowisku było wyzwaniem i jak dotąd skutkowało ograniczonymi wglądami mechanistycznymi. Większość testów opartych na komórkach opiera się na dwuwymiarowym (2D) środowisku, w którym brakuje kluczowych cech, które są krytyczne dla rekapitulacji trójwymiarowej (3D) fizjologii in vivo4,5,6, a mianowicie przestrzenne interakcje komórka-komórka, kontakt z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)7, dynamiczne zapotrzebowanie metaboliczne, zwiększone niedotlenienie spowodowane wzrostem masy8oraz wpływ mikrośrodowiska guza (TME)9. Z drugiej strony, nadal istnieje szereg niedociągnięć w obecnie stosowanych trójwymiarowych (3D) systemach kokultur i testów inwazji: (1) czasochłonny charakter generowania i zbierania sferoidów5,10, (2) brak kontroli nad rozmiarem, kształtem i gęstością komórek sferoidów11,12, (3) testy typu niskoprzepustowego, (4) wymóg specjalnego sprzętu13,14, (5) konieczność przeniesienia kokultury do różnych środowisk dla różnych testów15,16,17. W szczególności przeniesienie testu kokulturowego często prowadzi do zakłócenia sferoid i utraty integralności kokultury. Dotyczy to zwłaszcza "luźnych" sferoid o zmniejszonej adhezji komórka-komórka. Na przykład większość testów inwazji 3D wymaga, aby sferoidy były zbierane po ich początkowym uformowaniu, a następnie ponownie zawieszane w ECM14,15,16. Ten etap ponownego zawieszenia powoduje utratę kontroli nad odległością między sferoidami. Ponieważ odległość między sferoidami guza wpływa na ich inwazyjne zachowanie, ta utrata kontroli wprowadza wysoką wariancję między testami i zmniejsza odtwarzalność. Ponadto zastosowanie testów frakcjonowania komórek poprzez kolejne etapy wirowania w celu oceny obwodowych i sferoidalnych komórek odpornościowych naciekających guza jest ograniczone do populacji komórek nowotworowych, które generują bardziej stabilne sferoidy17.
Koncepcja i podejście
Nasze podejście rozwiązuje wyżej wymienione braki za pomocą modelu kokultury sferoidów "All-in-One" - 3D, który nie wymaga transferu sferoid do kolejnych testów. Dostosowaliśmy urządzenie do tworzenia sferoidów (patrz tabela materiałów) do wygenerowania testu do jednoczesnego monitorowania inwazyjnego zachowania komórek nowotworowych i cytotoksyczności współhodowanych limfocytów T. Ta metoda jest przyjazna dla użytkownika, niedroga i pozwala na szybką i łatwą obsługę w środowisku 3D o stosunkowo wysokiej przepustowości. W zależności od typu używanego urządzenia, w jednym kroku pipetowania można wygenerować do 81 dużych sferoid o jednakowej wielkości z kontrolą nad indywidualnym rozmiarem sferoidy poprzez modyfikację liczby wysiewanych komórek. Tworzenie sferoidów jest wymuszane przez wzmocnione interakcje komórka-komórka w wielodołkowych odlewach agarozowych bez rusztowań z dnem w kształcie litery U. Dostosowaliśmy ten system 3D do dynamicznych badań funkcjonalnych opartych na komórkach, a także do końcowych testów molekularnych i biochemicznych, które obejmują sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), barwienie immunofluorescencyjne (IF) lub immunohistochemiczne (IHC), a także analizę ekspresji genów w nienaruszonej kokulturze 3D.
Dla badań funkcjonalnych, osadzenie sferoid w kolagenie typu I w odlewach agarozy powoduje inwazję komórek rakowych z równoodległych sferoid i pozwala na monitorowanie istotnych cech specyficznych dla linii komórkowej, takich jak migracja komórek pojedynczych i zbiorowych18,19. Co więcej, macierz kolagenowa jest łatwo oddzielana od odlewu agarozy, w wyniku czego powstaje łata o grubości 1–2 mm zawierająca wiele sferoid, które można dalej przetwarzać w celu barwienia IF i obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Może to ujawnić wyraźną inwazję komórek i interakcje komórka-macierz w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym. Ponadto komórki w macierzy kolagenowej można wyizolować po trawieniu kolagenu i dysocjacji pojedynczych komórek w celu późniejszej hodowli lub analizy komórek.
Dla analizy IHC sferoidów, po utrwaleniu i podziale odlewu agarozy, białka lub inne interesujące cząsteczki są wykrywalne przy zachowaniu geograficznych pozycji sferoid. W opisanym tutaj podejściu sferoidy są bezpośrednio osadzone w żelu do przetwarzania agarozy hydroksyetylowej w odlewie agarozowym, a żel służy jako "pokrywka" do zatrzymywania sferoid na dnie mikrostudzienek. Po zatopieniu parafiny w odlewie agarozowej klasy <sup="xref">20, wykonuje się szeregowe cięcie poziome, przy czym punktem początkowym jest dolna część odlewu.
To podejście kontrastuje z konwencjonalnym cięciem sferoid IHC, które wymaga pobierania komórek przed zatopieniem w żelu do przetwarzania agarozy hydroksyetylu21 i grozi zakłóceniem sferoidów, a tym samym utratą przestrzennego układu komórek. Ponadto, frakcjonowanie komórek przez wirowanie w celu oceny, czy komórki odpornościowe infiltrowały lub pozostały obwodowe w sferoidach guza17 jest unikane przez bezpośrednie osadzanie.
Ponadto, kokultura 3D może być przeprowadzana poprzez mieszanie komórek nowotworowych, zrębowych lub odpornościowych, a tym samym badanie przesłuchów komórek nowotworowych lub rekapitulację różnych mikrośrodowisk nowotworowych w celu analizy interakcji komórka-komórka, w tym kokultur z komórkami śródbłonka16.
To ustawienie kohodowli sferoidów 3D może być użyte do przeprowadzenia kohodowli różnych typów komórek obecnych w mikrośrodowisku guza i do oceny efektów zmienionych elementów ECM. Oprócz kolagenu typu I można stosować inne składniki ECM (np. matrigel, mieszaniny matrigel/kolagen, fibronektyna), ponieważ na inwazję komórek nowotworowych ma wpływ obfitość różnych substratów22. Również mikrostudzienki odlewu agarozowego nadają się do sferoidalnego tworzenia pierwotnych linii komórkowych oraz do komórek o niskiej adhezji komórka-komórka.

<table><tbody><tr><td>Mikrotkanki 3D Petriego</td><td>Inc</td><td>Z764019 & Z764051</td><td>określane w protokołach jako "formy gumowe"; Formy 81-mikrodołkowe i 35-mikrodołkowe</td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe 8-dołkowe</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Typ I, niskie EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>anty-królicze przeciwciało wtórne skoniugowane HRP</td><td>Agilent</td><td>K4003</td><td>gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Kolagen typu I, ogon szczura, 100 mg</td><td>miliporów</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 4, 1 g</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092, 16000044</td><td>określana jako "pożywka do hodowli komórkowych" w protokołach</td></tr><tr><td>Harris hematoksylina</td><td>ThermoFisher</td><td>SH30-500D</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>ThermoFisher</td><td>HG-4000-012</td><td>określana jako "przetwarzanie agarozy hydroksyetylowej żel" w protokołach</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Rozcieńczenie 1/1000</td></tr><tr><td>Falloidyna 546</td><td>Invitrogen</td><td>486624</td><td>1/200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>królika przeciwciało anty-CD8</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>98941</td> 1<td>/25 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>szczura antykeratyna 8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I AB_531826</td><td>1/500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>określany jako "zestaw do ekstrakcji RNA" w protokołach</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td>11875093</td><td>do pożywki do hodowli komórek T</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td>określany jako "Octoxynol" w protokołach</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>określany jako "tiocyjanian guanidyny z fenolem" w protokołach</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>określany jako "polisorbat 20" w protokołach</td></tr><tr><td>TypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td>określany jako "roztwór enzymów dysocjacji komórek" w protokołach</td></tr></tbody></table>

monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów t w hodowli 3d

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Znaczący postęp został osiągnięty w leczeniu raka za pomocą immunoterapii, chociaż duża liczba nowotworów pozostaje oporna na leczenie. Ograniczona liczba testów pozwala na bezpośrednie monitorowanie i mechanistyczny wgląd w interakcje między nowotworem a komórkami odpornościowymi, wśród których limfocyty T odgrywają znaczącą rolę w wykonywaniu cytotoksycznej odpowiedzi adaptacyjnego układu odpornościowego na komórki nowotworowe. Większość testów opiera się na dwuwymiarowej (2D) kohodowli komórek ze względu na względną łatwość użycia, ale z ograniczoną reprezentacją fenotypu inwazyjnego wzrostu, jednej z cech charakterystycznych komórek nowotworowych. Obecne trójwymiarowe (3D) systemy kohodowli wymagają specjalnego sprzętu lub oddzielnego monitorowania inwazji współhodowanych komórek nowotworowych i oddziałujących limfocytów T.
Tutaj opisujemy podejście do jednoczesnego monitorowania inwazyjnego zachowania w 3D sferoid komórek rakowych i cytotoksyczności komórek T w kohodowli. Tworzenie sferoidów jest napędzane przez wzmocnione interakcje komórka-komórka w odlewach mikrostudzienek agarozowych bez rusztowań z dnem w kształcie litery U. Zarówno kohodowla komórek T, jak i inwazja komórek rakowych do macierzy kolagenu typu I są przeprowadzane w mikrodołkach odlewów agarozy bez konieczności przenoszenia komórek, utrzymując w ten sposób nienaruszony system kohodowli 3D przez cały czas trwania testu. Macierz kolagenową można oddzielić od odlewu agarozowego, co pozwala na barwienie immunofluorescencyjne (IF) i obrazowanie konfokalne komórek. Komórki mogą być również izolowane w celu dalszego wzrostu lub poddawane analizom, takim jak ekspresja genów lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Wreszcie, kokultura 3D może być analizowana za pomocą immunohistochemii (IHC) po osadzeniu i sekcji. Możliwe modyfikacje testu obejmują zmieniony skład macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a także włączenie różnych komórek zrębu lub komórek odpornościowych do komórek nowotworowych.

Model 3D współuprawy umożliwia przeprowadzenie różnych analiz przedstawionych na Ryc. 1A, które można łączyć lub modyfikować w zależności od potrzeb. W naszym ustalonym układzie doświadczalnym komórki nowotworowe i limfocyty T są współuprawiane przez 2 dni, po czym rozpoczyna się analizę inwazji w celu wyselekcjonowania inwazyjnych i/lub opornych komórek nowotworowych (Ryc. 1B). W 4. dniu przeprowadzana jest kwantyfikacja inwazji, a komórki „ocalające” są izolow...

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Metody te mogą dostarczyć mechanistycznego wglądu w cytotoksyczność komórek nowotworowych za pośrednictwem komórek odpornościowych i inwazyjne zachowanie w otoczeniu 3D. Główną zaletą tej techniki jest to, że ten trójwymiarowy model kokultury sferoidów nie wymaga przenoszenia sferoid dla wielu kolejnych esejów. Procedurę tę zademonstruje Apsra Nasir, doktorantka z naszego wydziału.Aby wytworzyć sferoidy przy użyciu techniki aseptycznej, w okapie do hodowli komórkowych dodaj 500 mikrolitrów stopionej agarozy do gumowej formy o grubości 81 mikrodołków, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Gdy agaroza stwardnieje, ostrożnie wygnij gumową formę, aby wyskoczyć z odlewów agarozy do poszczególnych dołków 12-dołkowej płytki. Aby zrównoważyć odlewy, dodaj 2,5 mililitra pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą do każdego dołka i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę.Pod koniec inkubacji przechylić płytkę, aby najpierw usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z otoczenia, a następnie do komory wysiewającej i ostrożnie wysiewać kroplami 190 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek nowotworowych do każdej komory wysiewu komórek. Po 15-m

monitoring-cancer-cell-invasion-and-t-cell-cytotoxicity-in-3d-culture

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Ten film przedstawia szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi w matrycy białkowej błony podstawnej 3D, ilustrując potencjał hodowli 3D w ocenie inwazji komórek do otaczającego środowiska.

Test błony podstawnej hodowli 3D: hodowla komórek rakowych na matrycy białkowej błony podstawnej 3D w celu zbadania inwazji komórek

Ten film opisuje technikę wykorzystania natywnej matrycy do badania inwazji komórek nowotworowych. Technika zastosowana w tym teście zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy.

Test inwazji komórek nowotworowych: natywna metoda 3D oparta na macierzy in vitro do oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych

Ten film demonstruje metodę tworzenia trójwymiarowej kohodowli sferoidów guza i limfocytów T. Przygotowuje się odlew agarozowy z mikrostudzienkami zawierającymi sferoidy guza, a następnie dodaje się limfocyty T. Po inkubacji układ ten pozwala na badanie interakcji limfocytów T ze sferoidami guza w kontrolowanym trójwymiarowym środowisku.

Trójwymiarowy model kohodowli naciekających limfocytów T w sferoidach nowotworowych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj metodę oceny inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D przy użyciu sferoidów w agarozowych komórkach wielodziurkowych. Technika umożliwia jednoczesne monitorowanie procesów w jednym urządzeniu.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Przeglądaj więcej filmów