Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób mikroskopia dwufotonowa in vivo może być wykorzystana do powtarzalnej wizualizacji dynamiki komórkowej w tym samym miejscu mózgu przez dłuższy czas. Zaletą tej techniki jest to, że umożliwia obrazowanie długoterminowych zmian w elementach komórkowych mózgu, w tym układu, morfologii i fizycznych interakcji między różnymi typami komórek OUN. Technika ta może być szczególnie przydatna w wywoływaniu interakcji komórka-komórka, dynamiki komórki i zmian morfologicznych podczas plastyczności mózgu i neurodegeneracji.

Zacznij od przygotowania młodocianej lub młodej osoby dorosłej, w wieku od czterech do 10 tygodni, myszy heterozygoty CX3CR1 GFP, która waży od 17 do 25 gramów, do implantacji okna czaszkowego. Po znieczuleniu myszy użyj trymera do włosów, aby ogolić włosy na głowie, między uszami, mniej więcej od poziomu oczu do górnej części szyi. Przesuń mysz do stereotaktycznego stanowiska chirurgicznego, stożka nosowego i ustabilizuj głowę za pomocą pasków nausznych.

Trzymaj mysz na poduszce grzewczej przez cały czas trwania procedury. Nasmaruj oba oczy maścią olejową, a następnie wstrzyknij 100 mikrolitrów 0,25% bupiwakainy i 100 mikrolitrów czterech miligramów na mililitr deksametazonu podskórnie w miejscu nacięcia. Odczekaj co najmniej pięć minut, zanim przejdziesz dalej.

Odpowietrz ogoloną głowę trzema naprzemiennymi wacikami betadyny i 70% alkoholu. Następnie wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej za pomocą ostrza chirurgicznego lub nożyczek. Rozciąga się od tylnej części czaszki, między uszami, do przedniej części między oczami.

Przetnij pozostałą skórę, aby odsłonić czaszkę. Odpowietrz tkankę łączną znajdującą się między skórą głowy a leżącą pod nią czaszką za pomocą 3% nadtlenku wodoru i zlokalizuj obszar mózgu, który ma być zobrazowany za pomocą współrzędnych stereotaktycznych. Wywierć okrągły otwór, około czterech milimetrów w głąb czaszki, za pomocą wiertła dentystycznego.

Podczas wiercenia regularnie zwilżaj czaszkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej i wacikami, aby schłodzić mózg. Usuń resztki kości kostnych i zmiękcz kość czaszki. Po zakończeniu ostrożnie usuń tę część czaszki za pomocą spiczastych kleszczy.

Po usunięciu czaszki ostrożnie umieść w kraniotomii małą szklankę nakrywkową, zwilżoną solą fizjologiczną. Osusz nadmiar soli fizjologicznej za pomocą sterylnej chusteczki. Za pomocą spiczastego aplikatora nałóż klej cyjanoakrylowy wokół okna i pozwól mu przymocować się do mózgu i czaszki.

Nałóż klej podkładowy na resztę czaszki i utwardź go światłem utwardzającym przez 20 do 40 sekund. Za pomocą końcowego kleju utwardź zagłębienie wokół okna i utwardź je światłem utwardzającym przez 20 do 40 sekund. Przyklej małą płytkę głowy do czaszki, na przeciwległej półkuli, kraniotomii, za pomocą kleju podkładowego, a następnie za pomocą końcowego kleju, utwardzając obie przez 20 do 40 sekund.

Po przebudzeniu myszy wstrzyknij jedną podskórną dawkę buprenorfiny SR jako znieczulenie pooperacyjne, które wystarczy na 72 godziny. Ożyw mysz za pomocą dodatkowego solnego pokarmu, aby ułatwić zdrowy powrót do zdrowia. Obrazowanie można wykonać już po dwóch tygodniach od zabiegu implantacji.

Za pomocą zamontuj płytkę głowicy na stoliku mikroskopu dwufotonowego, który powinien być utrzymywany w temperaturze 35 stopni Celsjusza za pomocą płytki grzewczej. Wstrzyknij mysz podskórnie 100 mikrolitrów barwnika do naczyń krwionośnych, takiego jak Rhodamine B. Delikatnie oczyść powierzchnię okna czaszki bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem. Nałóż kilka kropel wody lub soli fizjologicznej na okno i opuść soczewkę obiektywu do roztworu.

Upewnij się, że laser jest wyłączony, gdy obiektyw się obniża, i narysuj mapę kursu, aby oznaczyć główne punkty orientacyjne naczyń krwionośnych, patrząc przez okular. Użyj tego rysunku, aby zidentyfikować określone obszary podczas obrazowania dwufotonowego. Zbieraj obrazy fluorescencyjnych komórek i naczyń za pomocą obrazowania dwufotonowego.

Zapoznaj się z manuskryptem tekstowym, aby zapoznać się z parametrami obrazowania, rób staranne notatki z odpowiednimi współrzędnymi, aby upewnić się, że dokładne obszary mogą być ponownie zbadane w celu kolejnego obrazowania. Narysuj jak kilka pól widzenia w tej początkowej sesji obrazowania, Pod koniec obrazowania zdejmij mysz ze sceny, pozwól jej obudzić się ze znieczulenia i wróć do klatki domowej. Wykorzystaj uzyskane notatki i obrazy do ponownego zobrazowania obszarów podczas kolejnych sesji.

Protokół ten został wykorzystany do wizualizacji dynamiki mikrogleju In Vivo na Tajwanie myszy z linii YFP-H. Specyficzne dendryty służyły jako stabilne punkty orientacyjne do precyzyjnego mapowania obszarów mózgu. Podczas gdy dendryty są stabilne, niektóre mikroglej poruszają się codziennie.

Pojedyncze transgeniczne myszy CX3CR1 / GFP wykorzystano do obserwacji mikrogleju przez okres do ośmiu tygodni. Zastrzyki z rodaminy B stosowano w celu oznaczenia układu naczyniowego podczas każdej sesji obrazowania. Podczas gdy układ naczyniowy pozostaje stabilnie stały, mikroglej jest dynamiczny.

Myszy CX3CR1 / GFP były używane do śledzenia mikrogleju przed i po ciężkich napadach. Struktura łożyska naczyniowego została zachowana, ale sieć komórkowa mikrogleju i krajobraz pozycji były przejściowe. Większe zmiany zaobserwowano w ciągu 24 do 48 godzin od napadów.

Podwójnie transgeniczne myszy CX3CR1 / GFP i NG2DS-Red wykorzystano do śledzenia mikrogleju, a NG2 do komórek dodatnich In Vivo. Bez znakowania naczyń krwionośnych zidentyfikowano mikroglej, a także pasożyty związane z naczyniami krwionośnymi oraz komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Pasożyty mają wydłużone procesy, które przebiegają wzdłuż ściany naczyniowej, a OPC zazwyczaj wykazują większe ciała komórkowe, które znajdują się w miąższu mózgu, z dala od układu naczyniowego.

Gdy zastosowano rodaminę B, jaśniejszą fluorescencję pasożytów można było odróżnić od słabszej fluorescencji rodaminy świetlnej, pomimo podobnego wzbudzenia podczas obrazowania. Codzienne obrazowanie wykazało, że pasożyty były stabilnie rozmieszczone, podczas gdy OPC i mikroglej były dynamiczne. Ważne jest, aby dokładnie obserwować wizualizowany obszar, narysować reprezentatywną mapę, która jest jak najdokładniejsza i oznaczyć kroki podjęte w celu dotarcia do innych lokalizacji w odniesieniu do punktu początkowego.

W kolejnych sesjach obrazowania te kroki, ręcznie rysowane mapy i wcześniej wykonane obrazy, będą miały kluczowe znaczenie dla wielokrotnego identyfikowania tych samych lokalizacji. Technika ta pozwoliła naukowcom wyjaśnić interakcje neuron-glej, interakcje neuroimmunologiczne i dynamikę komórek nerwowych w dłuższych okresach czasu zarówno w zdrowiu, jak i patologii.