Name: Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj technikę implantacji okna czaszkowego do długoterminowego obrazowania dynamiki komórkowej w mózgu myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Ta metoda umożliwia powtarzalną wizualizację interakcji neuro-glio-naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Eyo za dyskusję na temat pomysłów przedstawionych w tym manuskrypcie. Dziękujemy dr Justinowi Rustenhovenowi z Kipnis Lab na Uniwersytecie Wirginii za dar w postaci myszy NG2DsRed33. Prace te są finansowane przez Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu Narodowego Instytutu Zdrowia dla U.B.E (K22 NS104392).

Wszystkie kroki są zgodne z wytycznymi ustalonymi i zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii.
1. Przygotowanie myszy do implantacji okna czaszkowego
UWAGA: Różne transgeniczne linie myszy z fluorescencyjnymi znacznikami nadają się do obrazowania.
<ol>
	<li>Użyj CX3CR1GFP/+ mice26, aby uwidocznić mikroglej in vivo. Zazwyczaj używa się młodocianych i młodych dorosłych myszy w wieku od 4 do 10 tygodni o wadze 17-25 g. 
	UWAGA: Chociaż to podejście jest odpowiednie nawet w przypadku myszy przed odsadzeniem, konieczność powrotu myszy do klatki z matkami w celu karmienia może skomplikować powrót do zdrowia, jeśli matka nie dba odpowiednio o młode po operacji. Dlatego zaleca się stosowanie myszy po odsadzeniu.</li>
	<li>Znieczulij mysz za pomocą izofluranu (5% przepływu tlenu do indukcji przez 1 min) w komorze anestezjologicznej. Sprawdź, czy mysz nie wykazuje żadnych ruchów ani drgań na szczypanie palców i/lub ogona. Wyjmij mysz z komory i na świeżym powietrzu dokładnie ogol włosy na głowie między uszami mniej więcej od poziomu oczu do górnej części szyi za pomocą trymera do włosów. 
	UWAGA: Stężenie użytego izofluranu zależy od wielkości komory indukcyjnej. Dlatego w przypadku mniejszych komór można zastosować 3-4% izofluranu w celu skutecznego wywołania znieczulenia, podczas gdy w przypadku większych komór będzie to wymagało do 5%.</li>
	<li>Przesuń mysz na stożek nosowy stereotaktycznego stanowiska chirurgicznego w celu znieczulenia (1,5-2% w celu konserwacji operacji), ustabilizuj głowę za pomocą pasków nausznych i utrzymuj mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała w cieple.</li>
	<li>Nasmaruj oba oczy maścią do oczu. Wstrzyknąć 100 μl 0,25% bupiwakainy (w celu zapewnienia myszu miejscowego znieczulenia, które będzie trwało 8-12 godzin) i 100 μl 4 mg/ml deksametazonu (w celu zmniejszenia stanu zapalnego, który może wynikać z zabiegu chirurgicznego) podskórnie w miejsce nacięcia. Pozwól myszy siedzieć przez co najmniej 5 minut przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Oczyść ogoloną głowę trzema naprzemiennymi wacikami z betadyną i 70% alkoholem. Wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej za pomocą ostrza chirurgicznego lub nożyczek rozciągających się od tylnej części czaszki między uszami do przedniej części między oczami. Pozostała skóra jest cięta w celu odsłonięcia czaszki. </li>
	<li>Oczyść tkankę łączną znajdującą się między skórą głowy a leżącą pod nią czaszką za pomocą 3% nadtlenku wodoru (H2O2) i zlokalizuj obszar mózgu, który ma być zobrazowany, za pomocą współrzędnych stereotaktycznych. 
	UWAGA: Często występuje krwawienie (krok 1.5) z nacięcia na powierzchni czaszki. Krwawienie to zwykle ustępuje samoistnie w ciągu 3-5 minut. Pomaga czyszczenie nadtlenkiem. Zauważono również, że wcześniejsze leczenie bupiwakainą (etap 1.4) ogranicza ilość krwawień w tym czasie.</li>
</ol>
2. Operacja implantacji okna czaszkowego myszy
<ol>
	<li>Wywierć okrągły otwór ~4 mm w czaszce za pomocą wiertła dentystycznego (średnica końcówki 0,7 mm) i ostrożnie usuń tę część czaszki za pomocą spiczastych kleszczy. Aby zobrazować korę somatosensoryczną myszy w wieku 6-8 tygodni, zlokalizuj środek kraniotomii na -2,5 tylnej i ± 2,0 bocznej do bregmy. Podczas wiercenia regularnie zwilżaj czaszkę sterylnymi solami fizjologicznymi i wacikami, aby schłodzić mózg, oczyścić resztki kości kostnej i zmiękczyć kość czaszki w celu ewentualnego usunięcia. 
	UWAGA: Współrzędne kraniotomii różnią się w zależności od regionu zainteresowania i wieku myszy.</li>
	<li>Po usunięciu czaszki ostrożnie umieść w kraniotomii małe szkło nakrywkowe (rozmiar #0 o grubości 0,1 ± 0,02 mm) zwilżone solą fizjologiczną. Osusz nadmiar soli fizjologicznej za pomocą sterylnej chusteczki.</li>
	<li>Za pomocą spiczastego aplikatora (takiego jak końcówka pipety lub spiczasty koniec złamanego drewnianego bawełnianego patyczka) nałóż klej cyjanoakrylowy wokół okna i pozwól mu przyczepić się do mózgu i czaszki. Nałóż klej podkładowy na resztę czaszki i utwardź go światłem utwardzającym przez 20-40 s. Przygotuj studzienkę wokół okna z końcowym klejem i utwardź światłem utwardzającym przez 20-40 s.</li>
	<li>Przyklej małą płytkę głowy do czaszki na przeciwległej półkuli kraniotomii, najpierw za pomocą kleju podkładowego jako podkładu, a następnie za pomocą końcowego kleju. Utwardzaj oba lampą utwardzającą przez 20-40 s każdy. 
	UWAGA: Szwy nie są potrzebne, jeśli czaszka jest całkowicie pokryta klejem podczas tej procedury.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Pozwól myszy obudzić się bez znieczulenia (rekonwalescencja wykonana na poduszce grzewczej skraca czas rekonwalescencji) i wróć do klatki domowej, gdy całkowicie się obudzi. Wstrzyknąć jedną podskórną dawkę buprenorfiny SR (0,5 mg/kg) jako znieczulenie pooperacyjne, które wystarcza na 72 godziny.</li>
	<li>Aby ułatwić zdrowy powrót do zdrowia po operacji, podaj myszy dodatkowy miękki pokarm, który może mieć postać zwykłej stałej karmy w wodzie, aby zmiękczyć karmę lub pokarmu w postaci żelu. 
	UWAGA: Wystarczające jest jednorazowe podanie miękkiego pokarmu bezpośrednio po zabiegu.</li>
	<li>Codziennie monitoruj mysz pod kątem zdrowia i prawidłowej rekonwalescencji przez pierwsze 72 godziny zabiegu chirurgicznego. Następnie należy wykonać obrazowanie już po 2 tygodniach od zabiegu implantacji okiennej. 
	UWAGA: Jeśli zostanie to zrobione dobrze, myszy dobrze się regenerują, wykazując normalne zachowania ambulatoryjne, wystarczającą eksplorację klatki, dobre nawodnienie, stabilny przyrost masy ciała i rozległe interakcje z innymi myszami w klatce i innymi przedmiotami w klatce. Myszy wykazujące letarg, odwodnienie i utratę masy ciała większą niż 10% po operacji są poddawane eutanazji i usuwane z badania.</li>
</ol>
4. Dwufotonowe mapowanie mózgu do wstępnego obrazowania
<ol>
	<li>Znieczulić mysz (izofluran, 5% indukcji i 1,5% konserwacji). Ustabilizować głowicę za pomocą w celu zamontowania płytki głowicy na stoliku mikroskopu dwufotonowego, utrzymywanym na płycie grzewczej w temperaturze 35 °C. Wstrzyknąć dootrzewnowo 100 μl barwnika do naczyń krwionośnych, takiego jak rodamina B (2 mg/ml). 
	UWAGA: Obrazowanie można również wykonać u obudzonych myszy bez znieczulenia. Jednak ostatnie badania wskazują, że znieczulenie wpływa na dynamikę nadzoru mikrogleju27,28,29 i że fiksacja głowy dla obrazowania dwóch fotonów u obudzonych myszy zwiększa stres nawet podczas przewlekłego obrazowania przez co najmniej 25 dni (patrz Juczewski i in., 2020)30.</li>
	<li>Delikatnie wyczyść powierzchnię okienka czaszki za pomocą bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem. Nałóż kilka kropel wody lub soli fizjologicznej na okienko czaszki i opuść soczewkę obiektywu do roztworu, ponieważ obiektyw jest soczewką zanurzeniową.</li>
	<li>Ręcznie narysuj grubą mapę, aby oznaczyć główne punkty orientacyjne naczyń krwionośnych w zeszycie laboratoryjnym, patrząc przez okular według epiflorescencji. Użyj tego rysunku, aby zidentyfikować określone obszary podczas obrazowania dwóch fotonów. Alternatywnie, zrób zdjęcia naczyń krwionośnych za pomocą kamery zamontowanej w mikroskopie lub za pomocą ręcznego aparatu lub telefonu. 
	UWAGA: Te ręcznie rysowane obrazy i zdjęcia mają na celu ułatwienie ponownego zbadania tych samych szerokich obszarów pod mikroskopem przed obrazowaniem dwóch fotonów. Nie jest to precyzyjne odwzorowanie obrazu.</li>
	<li>W ramach obrazowania dwoma fotonami zbierz obrazy komórek fluorescencyjnych i naczyń krwionośnych w razie potrzeby. Rób dokładne notatki z odpowiednimi współrzędnymi, aby upewnić się, że dokładne obszary mogą zostać ponownie odwiedzone w celu późniejszego obrazowania. Zbierz kilka pól widzenia podczas tej początkowej sesji obrazowania, np. uzyskuj obrazy stosu z co 1-2 μm przez objętość tkanki. 
	UWAGA: Podczas zbierania obrazów za pomocą dwóch fotonów, punkty orientacyjne naczyń krwionośnych są używane do zgrubnego mapowania. Jeśli potrzebne jest dokładne mapowanie, używane są dendryty znakowane YFP z myszy Thy1-YFP31.
	<ol>
		<li>Do obrazowania należy stosować następujące zalecane parametry: optymalna jest długość fali 880-900 nm; dla wzbudzenia GFP i/lub dsRed/Rhodamine stosuje się zwierciadło dichroiczne 565 nm z filtrami emisyjnymi 525/50 nm (kanał zielony) i 620/60 nm (kanał czerwony); do separacji GFP i YFP stosuje się zwierciadło dichroiczne 509 nm z filtrami emisji 500/15 i 537/26 nm; moc w mózgu jest utrzymywana na poziomie 25 mW lub niższym; rozdzielczość obrazu wynosi 1024 x 1024 pikseli, pole widzenia wykonane obiektywem 25X 0,9 NA przy współczynniku powiększenia 1,5x wynosi 295,24 x 295,24 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod koniec obrazowania zdejmij mysz ze sceny, pozwól jej obudzić się ze znieczulenia i wrócić do swojej domowej klatki do czasu przyszłej sesji obrazowania.</li>
</ol>
5. Obrazowanie dwufotonowe i ponowne obrazowanie
<ol>
	<li>W przypadku przyszłych kolejnych sesji obrazowania, które mogą trwać od kilku godzin do miesięcy po początkowej sesji obrazowania, znieczulij mysz (izofluran, 5% indukcja i 1,5% utrzymanie mięśni), zamontuj na mikroskopie dwufotonowym, utrzymuj na płytce grzewczej i ponownie wstrzyknij 100 μl barwnika do naczyń krwionośnych, takiego jak rodamina B (2 mg / ml).</li>
	<li>Otwórz wcześniej uzyskane obrazy w ImageJ i korzystając z tych obrazów, a także notatek z poprzedniej sesji, zidentyfikuj poprzednio zobrazowane obszary i ostrożnie zobrazuj je ponownie. </li>
	<li>Powtarzaj tę czynność tak długo, jak długo okienko obrazowania jest wyraźne lub jest to niezbędne dla zakresu badania.</li>
</ol>

<ol><li>Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Translational+Disease+Modeling+Using+Human+iPSC-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons.</a> Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Microfluidic+Models+for+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Croushore, C. A., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+studying+neurotransmitters+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission.</a> Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).</li>
<li>Wu, V. W., Schwartz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+for+reactive+gliosis%3A+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives.</a> J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tool+to+test+long-term+effects+of+chemicals+on+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Brain+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Brain Slice Cultures.</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59(2018).</li>
<li>Heine, C., Franke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+co-culture+systems+to+study+axon+regeneration+in+the+dopaminergic+system+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).</li>
<li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecualar+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45(2019).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo%3A+watching+the+brain+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Akassoglou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+CNS+Injury+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease.</a> Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).</li>
<li>Tran, C. H., Gordon, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+and+microvascular+imaging+in+awake+animals+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy.</a> Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).</li>
<li>Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Microglial+Calcium+Signaling+in+Brain+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366(2017).</li>
<li>Bennett, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Ontogeny+and+CNS+Environment+Establishes+Microglial+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity.</a> Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology.</a> Science. 353 (6301), 760-761 (2016).</li>
<li>Kipnis, J., Filiano, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology+in+2017%3A+The+central+nervous+system%3A+privileged+by+immune+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).</li>
<li>Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome%3A+stress%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">The microbiome: stress, health and disease.</a> Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).</li>
<li>Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome-The+Missing+Link+in+the+Gut-Brain+Axis%3A+Focus+on+Its+Role+in+Gastrointestinal+and+Mental+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521(2018).</li>
<li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+two-photon+imaging+of+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Liu, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+network+activity+controls+microglial+process+surveillance+in+awake+mice+via+norepinephrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).</li>
<li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Two-Photon+Imaging+of+Anesthesia-Specific+Alterations+in+Microglial+Surveillance+and+Photodamage-Directed+Motility+in+Mouse+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12R-Dependent+Translocation+Mechanisms+Gate+the+Changing+Microglial+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape.</a> Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+progenitors+balance+growth+with+self-repulsion+to+achieve+homeostasis+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).</li>
<li>Berthiaume, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Remodeling+of+Pericytes+In+Vivo+Maintains+Capillary+Coverage+in+the+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+persistent+dendritic+spines+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo.</a> Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).</li>
<li>Wang, C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8 (6), 67680(2013).</li>
<li>Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+genetic+access+to+transiently+active+neurons+via+TRAP%3A+targeted+recombination+in+active+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations.</a> Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neurogenesis+in+the+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus.</a> Science. 359 (6376), 658-662 (2018).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+fluorescence+microscopy+imaging+of+neural+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo.</a> Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).</li>
<li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neural activity.</a> Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+deep+neural+activity+from+the+cortical+surface+during+hippocampal+epileptiform+events+in+the+rat+brain+using+electrical+impedance+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography.</a> Neuroimage. 209, 116525(2020).</li>
<li>Kulkarni, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Voltage+Imaging+with+Sulfonated+Rhodamine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pojawienie się obrazowania dwufotonowego in vivo otworzyło możliwości zbadania mnóstwa interakcji komórkowych i dynamiki zachodzących w zdrowym mózgu. Wstępne badania koncentrowały się na wykorzystaniu podejścia kraniotomii czaszki z otwartą czaszką do obrazowania dendrytów neuronalnych zarówno za pomocą ostrego, jak i przewlekłego obrazowania37,38. Można to również wykorzystać do wyjaśnienia interakcji neuroimmunologicznych w mózgu. Protokół ten opisuje metodę w...

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) jest zarządzany przez złożoną interakcję interakcji między różnymi typami komórek rezydentnych, w tym neuronami, komórkami glejowymi i komórkami związanymi z naczyniami. Tradycyjnie, komórki nerwowe badano w izolowanych, współhodowanych1,2,3,4,5 (in vitro) lub wyciętej tkance mózgowej (ex vivo)6,7,8,9,10 Kontekstów. Istnieje jednak potrzeba dalszego zrozumienia zachowania i interakcji komórek nerwowych w natywnym środowisku nienaruszonego mózgu in vivo. W tym protokole opisujemy metodę mapowania regionów zainteresowania in vivo i precyzyjnego ponownego obrazowania tych regionów w przyszłych sesjach obrazowania w celu śledzenia złożonych interakcji między różnymi typami komórek OUN w dłuższych okresach czasu.
Rozwój metod obrazowania in vivo przyniósł znaczące korzyści dla właściwego zrozumienia funkcji neuronalnych11,12,13,14,15. W szczególności podejścia te mają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami in vitro i ex vivo. Po pierwsze, systemy obrazowania in vivo mają fizjologicznie istotne komponenty komórkowe i tkankowe, takie jak naczynia krwionośne, z pełnym repertuarem interakcji komórkowych, aby zapewnić pełne zrozumienie fizjologii sieci neuronowych. Po drugie, ostatnie odkrycia sugerują, że po usunięciu ze swojego rodzimego środowiska, niektóre komórki nerwowe (takie jak mikroglej) tracą ważne cechy swojej tożsamości, a tym samym fizjologię16,17, które mogą być zachowane w warunkach in vivo. Po trzecie, systemy obrazowania in vivo dają możliwość stabilnych badań podłużnych trwających od tygodni do miesięcy w celu zbadania interakcji komórkowych OUN. Wreszcie, biorąc pod uwagę rosnące dowody na udział obwodowego układu odpornościowego18,19 i microbiome20,21 w fizjologii OUN, systemy in vivo stanowią platformę do badania takiego wkładu i wpływu na komórki OUN. W związku z tym podejścia, które wykorzystują podłużne obrazowanie in vivo do badania fizjologii neuroimmunologicznej i interakcji w stanach zdrowych, rannych i chorych, są doskonałym uzupełnieniem tradycyjnych podejść.
W tym protokole opisujemy niezawodne podejście do obrazowania różnych typów komórek w mózgu, w tym mikrogleju, neuronów i komórek NG2+ jako przykłady. Opracowano dwa podejścia do wizualizacji komórek nerwowych in vivo: podejście z cieńszą czaszką i otwarte podejście z oknem czaszkowym. Chociaż metody z rozrzedzoną czaszką są w użyciu i są preferowane, ponieważ przezwyciężają niektóre wady podejścia z otwartą czaszką, takie jak aktywacja komórek glejowych, wyższa niż fizjologiczna dynamika kręgosłupa i stosowanie środków przeciwzapalnych22,23,24,25, przerzedzone podejścia czaszki wykazują również kilka krytycznych wad. Po pierwsze, procedura przerzedzania jest bardzo delikatną procedurą, którą wielu badaczy uważa za trudną do udoskonalenia, zwłaszcza gdy konieczne jest ponowne przerzedzenie. Dzieje się tak, ponieważ eksperymentatorom często trudno jest ustalić, czy przerzedzili czaszkę do głębokości ~20 μm. Po drugie, aby uzyskać odpowiednie porównania między myszami, przerzedzenie musiałoby być identyczne, a różne sukcesy przerzedzania między sesjami obrazowania lub myszami mogłyby komplikować wizualizację struktur neuronalnych. Po trzecie, zwierzęta z przerzedzonymi czaszkami mogą być wykorzystywane tylko przez ograniczoną liczbę sesji, gdy stosuje się ponowne przerzedzenie czaszki. Po czwarte, ponieważ część tkanki kostnej nadal pozostaje, przejrzystość w zakresie głębi obrazowania może być zagrożona przez podejście oparte na cieńszej czaszce, co pozwala na doskonałą wizualizację bardziej powierzchownych, ale nie tak bardzo w głębszych obszarach. W związku z tym głębsze struktury mózgu, takie jak hipokamp, nie mogą być z powodzeniem zobrazowane za pomocą podejścia z przerzedzoną czaszką. Rozważania te wskazują na potrzebę alternatywnych i uzupełniających podejść, które mogłyby przezwyciężyć te obawy.
Alternatywa dla metody implantacji przerzedzonej czaszki, metoda implantacji otwartego okna czaszki wykorzystuje procedurę, w której czaszka jest zastępowana optycznie przezroczystym szkiełkiem nakrywkowym. Pozwala to na niemal nieograniczoną liczbę sesji obrazowania. Co więcej, biorąc pod uwagę zastąpienie czaszki szklanym szkiełkiem nakrywkowym, metoda ta pozwala na wyraźne okno obserwacyjne fluorescencyjnie znakowanych komórek mózgowych przez długie okresy czasu od godzin do miesięcy, a zatem może być stosowana do badania aktywności komórek i interakcji, które są istotne dla fizjologii, starzenia się i patologii.
Ogólnie rzecz biorąc, szczegółowo opisujemy kroki, które można wykonać, aby wszczepić przewlekłe okna czaszki za pomocą stereotaktycznej kraniotomii, która umożliwia obrazowanie in vivo interesujących obszarów mózgu. Opisujemy również, w jaki sposób rażąco stabilne unaczynienie mózgu lub fluorescencyjnie znakowane dendryty mogą być wykorzystane do wygenerowania odpowiednio zgrubnej lub drobnej mapy obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania. Podejście to można następnie zastosować do wielokrotnego obrazowania w ciągu kilku sesji. Znaczenie tej techniki polega zatem na jej zdolności do obrazowania długoterminowych zmian lub zastoju w elementach mózgu, w tym układu, morfologii i interakcji różnych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>Szkło nakrywkowe (3mm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0726</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy (Krazy Glue)</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2</td><td></td></tr><tr><td>System utwardzania Demi Ultra LED</td><td>Produkty do zdrowia zębów, Inc</td><td>910860-1</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Osada:</td> Wiertło <td>www.osadausa.edu EXL-M40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>#19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Henry Schien</td><td>1338333</td><td></td></tr><tr><td>iBond Total Etch (klej podkładowy)</td><td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td><td>66040094</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Millipore Sigma</td><td>81-88-9 (R6626)</td><td></td></tr><tr><td>Tetris Klej Evoflow (klej końcowy)</td><td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td><td>#595956</td><td></td></tr><tr><td>Wahl Brav Mini+</td><td>Amazon</td><td></td><td></td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1</tr></tbody></table>

precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) jest regulowany przez złożone interakcje komórek neuronalnych, glejowych, zrębowych i naczyniowych, które ułatwiają jego prawidłowe funkcjonowanie. Chociaż badanie tych komórek w izolacji in vitro lub razem ex vivo dostarcza użytecznych informacji fizjologicznych; W takich kontekstach pominięte zostaną istotne cechy fizjologii komórek nerwowych. W związku z tym istnieje potrzeba badania komórek nerwowych w ich naturalnym środowisku in vivo. Szczegółowo opisany tutaj protokół opisuje powtarzalne obrazowanie dwufotonowe in vivo komórek nerwowych w korze gryzoni jako narzędzie do wizualizacji i badania określonych komórek w dłuższych okresach czasu, od godzin do miesięcy. Szczegółowo opisujemy użycie rażąco stabilnego układu naczyniowego mózgu jako zgrubnej mapy lub fluorescencyjnie znakowanych dendrytów jako dokładnej mapy wybranych obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania. Używając tych map jako klucza wizualnego, pokazujemy, w jaki sposób komórki nerwowe mogą być precyzyjnie przemieszczane w celu późniejszego, powtarzalnego obrazowania in vivo. Wykorzystując przykłady obrazowania in vivo znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju, neuronów i komórek NG2 +, protokół ten demonstruje zdolność tej techniki do umożliwienia powtarzalnej wizualizacji dynamiki komórkowej w tym samym miejscu mózgu przez dłuższy czas, co może dodatkowo pomóc w zrozumieniu strukturalnych i funkcjonalnych odpowiedzi tych komórek w normalnej fizjologii lub po patologicznych zniewagach. W razie potrzeby podejście to można połączyć z funkcjonalnym obrazowaniem komórek nerwowych, np. z obrazowaniem wapnia. Podejście to jest szczególnie potężną techniką wizualizacji fizycznej interakcji między różnymi typami komórek OUN in vivo, gdy dostępne są genetyczne modele myszy lub określone barwniki z wyraźnymi znacznikami fluorescencyjnymi do oznaczania komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Aby zwizualizować dynamikę mikrogleju in vivo, wykorzystano podwójnie transgeniczne myszy CX3CR1GFP/+:Thy1YFP. Zastosowano linię Thy1-YFP H zamiast linii Thy1-GFP M, aby uniknąć nakładania się fluorescencji mikrogleju (GFP) i neuronów (YFP). Alternatywne podejścia mogłyby wykorzystywać linię reporterową, w której mikroglej jest znakowany np. tdTomato, co pozwoliłoby na użycie linii Thy1-GFP M. Wadą linii H jest fakt, że YFP znakuje wiele neuronów, a intensywność znakowania wzrasta wraz z wiekiem (ob...

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób mikroskopia dwufotonowa in vivo może być wykorzystana do powtarzalnej wizualizacji dynamiki komórkowej w tym samym miejscu mózgu przez dłuższy czas. Zaletą tej techniki jest to, że umożliwia obrazowanie długoterminowych zmian w elementach komórkowych mózgu, w tym układu, morfologii i fizycznych interakcji między różnymi typami komórek OUN. Technika ta może być szczególnie przydatna w wywoływaniu interakcji komórka-komórka, dynamiki komórki i zmian morfologicznych podczas plastyczności mózgu i neurodegeneracji.Zacznij od przygotowania młodocianej lub młodej osoby dorosłej, w wieku od czterech do 10 tygodni, myszy heterozygoty CX3CR1 GFP, która waży od 17 do 25 gramów, do implantacji okna czaszkowego. Po znieczuleniu myszy użyj trymera do włosów, aby ogolić włosy na głowie, między uszami, mniej więcej od poziomu oczu do górnej części szyi. Przesuń mysz do stereotaktycznego stanowiska chirurgicznego, stożka nosowego i ustabilizuj głowę za pomocą pasków nausznych.Trzymaj mysz na poduszce grzewczej przez cały czas trwania procedury. Nasmaruj oba oczy maścią olejową, a następnie wstrzyknij 100 mikrolitrów 0,25% bupiwakainy i 100 mikrolitrów czterech miligramów na mililitr deksametazonu podskórnie w miejscu nacięcia. Odczekaj co najmniej pięć minut, zanim przejdziesz dalej.Odpowietrz ogoloną głowę trzema naprzemiennymi wacikami betadyny i 70% alkoholu. Następnie wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej za pomocą ostrza chirurgicznego lub nożyczek. Rozciąga się od tylnej części czaszki, między uszami, do przedniej części między oczami.Przetnij pozostałą skórę, aby odsłonić czaszkę. Odpowietrz tkankę łączną znajdującą się między skórą głowy a leżącą pod nią czaszką za pomocą 3% nadtlenku wodoru i zlokalizuj obszar mózgu, który ma być zobrazowany za pomocą współrzędnych stereotaktycznych. Wywierć okrągły otwór, około czterech milimetrów w głąb czaszki, za pomocą wiertła dentystycznego.Podczas wiercenia regularnie zwilżaj czaszkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej i wacikami, aby schłodzić mózg. Usuń resztki kości kostnych i zmiękcz kość czaszki. Po zakończeniu ostrożnie usuń tę część czaszki za pomocą spiczastych kleszczy.Po usunięciu czaszki ostrożnie umieść w kraniotomii małą szklankę nakrywkową, zwilżoną solą fizjologiczną. Osusz nadmiar soli fizjologicznej za pomocą sterylnej chusteczki. Za pomocą spiczastego aplikatora nałóż klej cyjanoakrylowy wokół okna i pozwól mu przymocować się do mózgu i czaszki.Nałóż klej podkładowy na resztę czaszki i utwardź go światłem utwardzającym przez 20 do 40 sekund. Za pomocą końcowego kleju utwardź zagłębienie wokół okna i utwardź je światłem utwardzającym przez 20 do 40 sekund. Przyklej małą płytkę głowy do czaszki, na przeciwległej półkuli, kraniotomii, za pomocą kleju podkładowego, a następnie za pomocą końcowego kleju, utwardzając obie przez 20 do 40 sekund.Po przebudzeniu myszy wstrzyknij jedną podskórną dawkę buprenorfiny SR jako znieczulenie pooperacyjne, które wystarczy na 72 godziny. Ożyw mysz za pomocą dodatkowego solnego pokarmu, aby ułatwić zdrowy powrót do zdrowia. Obrazowanie można wykonać już po dwóch tygodniach od zabiegu implantacji.Za pomocą zamontuj płytkę głowicy na stoliku mikroskopu dwufotonowego, który powinien być utrzymywany w temperaturze 35 stopni Celsjusza za pomocą płytki grzewczej. Wstrzyknij mysz podskórnie 100 mikrolitrów barwnika do naczyń krwionośnych, takiego jak Rhodamine B. Delikatnie oczyść powierzchnię okna czaszki bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem. Nałóż kilka kropel wody lub soli fizjologicznej na okno i opuść soczewkę obiektywu do roztworu.Upewnij się, że laser jest wyłączony, gdy obiektyw się obniża, i narysuj mapę kursu, aby oznaczyć główne punkty orientacyjne naczyń krwionośnych, patrząc przez okular. Użyj tego rysunku, aby zidentyfikować określone obszary podczas obrazowania dwufotonowego. Zbieraj obrazy fluorescencyjnych komórek i naczyń za pomocą obrazowania dwufotonowego.Zapoznaj się z manuskryptem tekstowym, aby zapoznać się z parametrami obrazowania, rób staranne notatki z odpowiednimi współrzędnymi, aby upewnić się, że dokładne obszary mogą być ponownie zbadane w celu kolejnego obrazowania. Narysuj jak kilka pól widzenia w tej początkowej sesji obrazowania, Pod koniec obrazowania zdejmij mysz ze sceny, pozwól jej obudzić się ze znieczulenia i wróć do klatki domowej. Wykorzystaj uzyskane notatki i obrazy do ponownego zobrazowania obszarów podczas kolejnych sesji.Protokół ten został wykorzystany do wizualizacji dynamiki mikrogleju In Vivo na Tajwanie myszy z linii YFP-H. Specyficzne dendryty służyły jako stabilne punkty orientacyjne do precyzyjnego mapowania obszarów mózgu. Podczas gdy dendryty są stabilne, niektóre mikroglej poruszają się codziennie.Pojedyncze transgeniczne myszy CX3CR1 / GFP wykorzystano do obserwacji mikrogleju przez okres do ośmiu tygodni. Zastrzyki z rodaminy B stosowano w celu oznaczenia układu naczyniowego podczas każdej sesji obrazowania. Podczas gdy układ naczyniowy pozostaje stabilnie stały, mikroglej jest dynamiczny.Myszy CX3CR1 / GFP były używane do śledzenia mikrogleju przed i po ciężkich napadach. Struktura łożyska naczyniowego została zachowana, ale sieć komórkowa mikrogleju i krajobraz pozycji były przejściowe. Większe zmiany zaobserwowano w ciągu 24 do 48 godzin od napadów.Podwójnie transgeniczne myszy CX3CR1 / GFP i NG2DS-Red wykorzystano do śledzenia mikrogleju, a NG2 do komórek dodatnich In Vivo. Bez znakowania naczyń krwionośnych zidentyfikowano mikroglej, a także pasożyty związane z naczyniami krwionośnymi oraz komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Pasożyty mają wydłużone procesy, które przebiegają wzdłuż ściany naczyniowej, a OPC zazwyczaj wykazują większe ciała komórkowe, które znajdują się w miąższu mózgu, z dala od układu naczyniowego.Gdy zastosowano rodaminę B, jaśniejszą fluorescencję pasożytów można było odróżnić od słabszej fluorescencji rodaminy świetlnej, pomimo podobnego wzbudzenia podczas obrazowania. Codzienne obrazowanie wykazało, że pasożyty były stabilnie rozmieszczone, podczas gdy OPC i mikroglej były dynamiczne. Ważne jest, aby dokładnie obserwować wizualizowany obszar, narysować reprezentatywną mapę, która jest jak najdokładniejsza i oznaczyć kroki podjęte w celu dotarcia do innych lokalizacji w odniesieniu do punktu początkowego.W kolejnych sesjach obrazowania te kroki, ręcznie rysowane mapy i wcześniej wykonane obrazy, będą miały kluczowe znaczenie dla wielokrotnego identyfikowania tych samych lokalizacji. Technika ta pozwoliła naukowcom wyjaśnić interakcje neuron-glej, interakcje neuroimmunologiczne i dynamikę komórek nerwowych w dłuższych okresach czasu zarówno w zdrowiu, jak i patologii.

precise-brain-mapping-to-perform-repetitive-vivo-imaging-neuro-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) stało się coraz popularniejszym narzędziem do badania fenotypu myszy z modyfikacjami genetycznymi. Niniejszy artykuł przedstawia metody niezbędne do przeprowadzenia wysokoprzepustowego fenotypowania myszy z modyfikacjami genetycznymi przy użyciu MRI dla wielu osobników jednocześnie.<br...

Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Źródło: Bisht, K., et al. Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej u transgenicznej myszy z implantem czaszki. Stabilność naczyniowa i neuronalna jest obrazowana wraz z dynamicznymi zmianami mikrogleju, odzwierciedlającymi odpowiedzi immunologiczne na aktywność neuronów.

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej za pomocą implantu czaszki

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Poznaj technikę implantacji okna czaszkowego do długoterminowego obrazowania dynamiki komórkowej w mózgu myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Ta metoda umożliwia powtarzalną wizualizację interakcji neuro-glio-naczyniowych.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Przeglądaj więcej filmów