Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Ogólny cel tej procedury wyjaśniono zastosowanie cisplatyny jako środka nefrotoksycznego u dorosłych ryb danio pręgowanego, analizując stan zapalny i śmierć komórek w tkance nerkowej. Aby to osiągnąć, dorosły ryby danio pręgowany jest znieczulany i ważony w celu wstrzyknięcia określonej dawki cisplatyny do jamy otrzewnej. Po monitorowaniu śmiertelności nerka jest preparowana, a komórki są izolowane do cytometrii przepływowej lub utrwalane i preparowane w celu analizy za pomocą fluorescencyjnego testu TUNEL.

Poniższe procedury mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nerek, wykorzystując nefrotoksyczne działanie cisplatyny jako narzędzia do opracowania modelu ostrego uszkodzenia nerek i dorosłej ryby danio pręgowanej. Model ten może być wykorzystany do badania nowych celów terapeutycznych w ochronie nerek, a także do wyjaśnienia mechanizmu regeneracji nerki danio pręgowanego. Cisplatyna jest środkiem chemioterapeutycznym stosowanym w leczeniu różnych nowotworów.

Jednak może łatwo gromadzić się w nerkach, powodując śmierć komórek, stan zapalny i zmniejszając czynność nerek. Działanie cisplatyny jest zależne od dawki, więc możesz zmniejszyć nasze zwiększenie dawki w zależności od swoich celów. Techniki stosowane tutaj do analizy stanu zapalnego i śmierci komórek nie służą wyłącznie rozpowszechnianiu modelu choroby.

Cytometria przepływowa u ryb danio pręgowanego może pomóc w ilościowym wyjaśnieniu stanów zapalnych zwierzęcia, podczas gdy w TUNEL możemy wyjaśnić obecność poptozowanych komórek w kontekście fizjologicznym i patologicznym. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować roztwór roboczy cisplatyny, rozcieńczając roztwór podstawowy do 820 mikrogramów na promil w 0,9% chlorku sodu. Następnie znieczul kolejną rybę zebry i osusz nadmiar wody na ręcznikach papierowych.

Zważ rybę, umieszczając ją na wadze, zwracając uwagę na wagę. Wykonaj obliczenia, aby poznać dokładną objętość do wstrzyknięcia. Aby osiągnąć dawkę 120 mikrogramów na gram masy, należy użyć następnego preparatu.

Podziel ostatnią dawkę przez dawkę roztworu roboczego i przelicz tę liczbę na mikrolitry, mnożąc przez 1000, aby uzyskać objętość 120 mikrogramów cisplatyny. Następnie pomnóż tę liczbę przez wagę ryby, aby uzyskać ostateczną objętość do wstrzyknięcia. Połóż rybę na mokrej gąbce z małą filiżanką do jej trzymania.

Brzuszną stroną do góry i napełnić strzykawkę insulinową obliczoną objętością cisplatyny. Wbij igłę w brzuszną linię środkową pod płytkim kątem, delikatnie pociągając ścianę brzuszną do góry, aby uniknąć przebicia narządów wewnętrznych. A następnie wstrzyknąć roztwór.

Po wstrzyknięciu należy umieścić rybę w zbiorniku, aby wyzdrowiała ze znieczulenia i poczekać na oznaki wyzdrowienia, takie jak pływanie i odpowiednie ruchy. Monitoruj pod tym kątem ryby dwa razy dziennie przez następne dni. W tej dawce cisplatyna wywołuje około 30% śmiertelności w ciągu pierwszych 24 godzin.

Rybę poddać eutanazji i osuszyć nadmiar wody ręcznikiem papierowym. Po usunięciu głowy i narządów wewnętrznych użyj igieł preparacyjnych, aby przypiąć ściany ciała. Zlokalizuj nerkę w ścianie grzbietowej ryby i użyj kleszczy, aby odłączyć nerkę.

Umieść nerkę w sześciodołkowej płytce z chłodnym roztworem jednego 1X PBS, 2% FBS i trzymaj na lodzie. Następnie podnieś tkankę z odrobiną płynu i przepuść ją przez sitko do komórek o wielkości 40 mikronów, a następnie delikatnie maceruj tkankę za pomocą tłoka strzykawki. Umyj dwa razy jednym 1X PBS, 2%FBS.

I zbierz komórki w probówce sokoła o mocy 50 milsów. Następnie odwirować przez pięć minut w temperaturze 400 G. Ostrożnie pobrać supernatant za pomocą pipety i wyrzucić go. Dodaj 500 mikrolitrów zimnego 1X PBS, aby ponownie zawiesić komórki i umieścić je w probówce do cytometrii przepływowej o mocy pięciu milicali.

Trzymaj je na lodzie. Weź 10 mikrolitrów próbki i wymieszaj ją z 90 mikrolitrami błękitu trypanowego w probówce Eppendorfa. Dodać 10 mikrolitrów mieszaniny do komory Neobauera i policzyć komórki w mikroskopie.

Weź komórki, które mają być odczytane przez cytometr, a następnie przeanalizuj wyniki, wybierając populację swoich zainteresowań. W celu przeprowadzenia tej procedury należy poddać rybę eutanazji i usunąć narządy wewnętrzne, pozostawiając nerkę przyczepioną do ciała. Następnie przypnij ścianki korpusu do powierzchni korka i umieść je stopniowo w dół na roztworze utrwalającym.

Utrzymuj go w temperaturze czterech stopni przez noc. Następnego dnia wypreparuj nerkę drobnym kleszkiem. Staraj się go nie zakłócać.

Umieść go na małej szalce Petriego lub probówce Eppendorfa z 1X PBS do spłukania. Zmień PBS i przygotuj 2% agarozę, aby wytworzyć macierz podporową dla nerek, zanim zostaną one solidnie przetworzone. Wyrzuć wszystkie pozostałe PBS i powoli wlewaj agarozę.

Następnie ustaw nerkę za pomocą cienkich kleszczyków, aby zapobiec jej złożeniu. Niech agaroza zestali się w temperaturze pokojowej. Po zestaleniu agarozy za pomocą skalpela pokrój agarozę wokół nerek, tworząc małe kostki.

Umieść kostki agarozy w kasecie histologicznej i wyślij ją do obróbki histologicznej w celu zatopienia tkanki w parafinie. Bloki parafiny następnie pokroimy na odcinki o grubości pięciu mikronów. Odwoskuj szkiełka i przechowuj je w wodzie destylowanej.

Przygotuj ciemną komorę inkubatora, kładąc na dnie mokre ręczniki papierowe. Umieść szkiełka w ciemnej komorze i dodaj proteinazę K w celu przepuszczalności tkanki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Podczas inkubacji próbek należy przygotować mieszaninę reakcyjną TUNEL, dodając 50 mikrolitrów roztworu enzymatycznego na 450 mikrolitrów roztworu etykietowego. I chroń przed światłem. Podnieś ciemną komorę i umyj plasterek dwa razy jednym 1X PBS.

Następnie wysuszyć szkiełka i mieszaninę reakcyjną TUNEL. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po inkubacji ponownie umyj te szkiełka jednym 1X PBS.

I dodaj DAPI do barwienia przeciw jądrom. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut, chronić przed światłem. Spłucz trzy razy jednym 1X PBS.

A następnie uformuj szkiełka za pomocą hydrofilowego środka zapobiegającego blaknięciu. Umieść szkiełko nakrywkowe. I uszczelnij lakierem do paznokci.

Wizualizacja próbek w mikroskopie fluorescencyjnym. Na tym wykresie można zobaczyć, że cisplatyna ma wpływ na przeżycie ryb w odpowiedzi na dawkę, w porównaniu z kontrolą, której wstrzyknięto tylko 0,9% chlorek sodu. Czerwona linia na tym wykresie reprezentuje dawkę 120 mikrogramów na gram użytą w tym filmie.

Dawki te mogą być stosowane u mężczyzn i kobiet, ponieważ nie stwierdzono między nimi różnic statystycznych. Cytometria przepływowa pozwala na ilościowe określenie różnych komórek obecnych w tkance. Populacje komórek krwiotwórczych są identyfikowane w nerkach kilku ryb na podstawie wielkości lub rozproszenia do przodu oraz ziarnistości lub rozrzutu wielkości.

W ten sposób możliwe jest rozdzielenie populacji w erytrocytach, limfocytach, granulocytach i prekursorach hematopoetycznych. W tym przypadku obecna strategia bramek selekcjonująca granulocyty, singlety i komórki MPO dodatnie pozwala znaleźć populację neutrofili w nerkach charakteryzującą się fluorescencyjną ekspresją mieloperoksydazy. W tym przypadku wstrzyknięcie cisplatyny spowodowało wzrost odsetka neutrofili obecnych w nerce.

Test TUNEL pozwala na wykrycie komórek apoptotycznych w tkance poprzez obserwację szkiełka tkankowego nerki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, możliwe jest zobaczenie sygnału apoptotycznego wewnątrz jąder niektórych komórek, tutaj na czerwono. Kontrastuje z plamą jądrową w takim DAPI tutaj w kolorze niebieskim. Wstrzyknięcie cisplatyny zwiększyło obecność komórek apoptotycznych w nerkach, które można określić ilościowo ręcznie lub za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Na końcu tego filmu powinieneś być w stanie wiedzieć, jak wstrzykiwać i dostosowywać dawkę cisplatyny, aby wywołać ostre uszkodzenie nerek u dorosłych ryb danio pręgowanego. I jak wypreparować nerkę do różnych celów. Cytometria przepływowa jest doskonałym narzędziem, które pomoże Ci zrozumieć profil różnych typów komórek w zależności od dostępności linii tragenklaw w Twoim laboratorium.

Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę kolor linii transporterów, jeśli chcesz użyć przeciwciała do oznaczenia wszystkich ich typów komórek. Test TUNEL jest prostym narzędziem, które pozwala nam wykryć apoptozę komórek i tkanek i może być analizowane nie tylko za pomocą mikroskopii, ale także cytometrii przepływowej. Pamiętaj, aby podczas całego zabiegu zawsze używać środków ochrony osobistej.