Name: Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu biodrukowanych łat sercowych w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. Technika obejmuje bioprinting komórek sercowych oraz chirurgiczne umieszczenie łaty na powierzchni serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z podziękowaniami dla Natalie Johnston za nagranie materiału filmowego z niechirurgii i całą edycję wideo.

Wszystkie procedury opisane w tym eksperymencie zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Zwierząt w Lokalnym Okręgu Zdrowia Północnego Sydney, NSW, Australia (numer projektu RESP17/55).
1. Znieczulenie i intubacja
UWAGA: Włącz i ustaw stereomikroskop, poduszkę grzewczą (pokrytą arkuszem absorbantu) i system wentylatora.
<ol>
	<li>Oczyść rękawice, obszar operacyjny i narzędzia 70% etanolem.</li>
	<li>Zważyć mysz, aby obliczyć dawkę znieczulenia wstrzykiwanego drogą dootrzewnową (ketamina 40 mg/kg, ksylazyna 5 mg/kg, atropina 0,15 mg/kg) i wykonać wstrzyknięcie.</li>
	<li>Gdy mysz osiągnie głęboką płaszczyznę znieczulenia, ogol brzuszną lewą stronę klatki piersiowej za pomocą trymera.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze zawierającej 2% izofluranu (zapewniającej odpowiednią wentylację wyciągową w pomieszczeniu). 
	UWAGA: Stosunkowo niska dawka zastrzyku ketaminy/ksylazyny wraz z 2% inhalacją izofluranu zmniejsza ryzyko śmierci myszy, umożliwiając jednocześnie optymalną intubację bez budzenia myszy.</li>
	<li>Umieść mysz na wznak i unieruchamiaj ją od górnych siekaczy za pomocą szwu 3.0 przyklejonego do ławki, jak pokazano na filmie. Potwierdź sedację, wykonując szczypanie palca u nogi. Umieść oświetlacz o dużej intensywności nad szyjką myszy, aby można było uwidocznić część ustno-gardłową. 
	UWAGA: Alternatywnie mysz można umieścić na stojaku z zestawu do intubacji (np. Zestaw do intubacji myszy Kent) za pomocą elastycznej opaski przymocowanej pod górnymi siekaczami, aby utrzymać usta otwarte w celu identyfikacji tchawicy.</li>
	<li>Użyj zakrzywionej szpatułki, aby otworzyć szczękę i kolejnej pary szpatułek/kleszczy, aby delikatnie podnieść język. Pamiętaj, aby zaintubować, gdy znajduje się na poziomie oczu lub nieco poniżej ciała myszy.</li>
	<li>Wizualizuj otwieranie i zamykanie strun głosowych. Po otwarciu włóż plastikowy cewnik 20 G dostarczony z zestawem do intubacji.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś zaintubowaną mysz na powierzchnię roboczą wyposażoną w poduszkę grzewczą. Podłącz mysz do wentylatora (np. MouseVent), który automatycznie ustawia docelową głośność na podstawie wagi myszy.</li>
	<li>Dostarczyć 1,5-2% izofluranu z tlenem (który jest automatycznie regulowany przez respirator: upewnij się, że jest połączenie między butlą tlenową a respiratorem automatycznym przy natężeniu przepływu 1-2 l/min do respiratora). Sprawdź intubację, sprawdzając, czy nie ma obustronnego uniesienia klatki piersiowej. Sprawdź znieczulenie, wykonując szczypanie palca u nogi.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną (np. maść okulistyczną Puralube Vet) na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
	<li>Zabezpieczyć rurkę intubacyjną taśmą w miejscu połączenia między respiratorem a rurką oddechową/cewnikiem.</li>
	<li>Wytnij dłuższy kawałek taśmy i przymocuj lewą przednią stopę do powierzchni roboczej w lekko uniesionej pozycji. Zaklej również taśmą pozostałe kończyny.</li>
	<li>Oczyść klatkę piersiową sterylnym 70% roztworem izopropanolu i jodu powidonu, czyszcząc okrężnymi ruchami, przesuwając się od środka do obrzeży.</li>
	<li>Sprawdź znieczulenie jeszcze raz za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.</li>
	<li>Podawać 0,08 mg/kg mc. leku Temvet (buprenorfina) w 0,1 ml 0,9% soli fizjologicznej we wstrzyknięciu podskórnym.</li>
</ol>
3. Torakotomia boczna lewa
<ol>
	<li>Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby delikatnie unieść skórę w punkcie około 5 mm na lewo od wystającej chrząstki mieczykowatej. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nadprzyśrodkowe nacięcie w skórze od tego punktu w górę i w kierunku linii środkowej, do poziomu brzucha.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie oddzielić warstwę skóry i mięśni. Otwórz warstwę mięśniową, podążając za nacięciem skóry.</li>
	<li>Zidentyfikuj i wykonaj nacięcie w trzeciej przestrzeni międzyżebrowej, zgodnie z naturalnym kątem klatki piersiowej.</li>
	<li>Użyj retraktora, aby delikatnie rozsunąć 3. i 4. żebro.</li>
	<li>Delikatnie usuń cienkie osierdzie za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Jeśli LAD nie jest uwidoczniony, delikatnie popchnij lewe małżowiny uszne (patrz rysunek uzupełniający 1) do góry i zlokalizuj tętnice wieńcowe pod spodem.</li>
</ol>
4. Stałe podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej przednią zstępującą (LAD)
<ol>
	<li>Wytnij jedwabny szew 3-0 o długości ~ 3 mm i umieść ten wzmacniający jedwabny szew 3-0 na wierzchu LAD w tym samym kierunku co LAD (jak pokazano na filmie w punkcie czasowym 02:12 – 02:20).</li>
	<li>Zidentyfikuj LAD i przełóż jedwabny szew 7-0 pod LAD. Jeśli LAD nie jest wyraźnie widoczny, włóż igłę o 1 mm niżej i przyśrodkowo do najniższego punktu, do którego dociera końcówka lewej małżowiny usznej podczas dynamicznego ruchu serca. 
	UWAGA: Ta struktura ma jaśniejszy kolor czerwony w stosunku do komór serca, ale ciemniejsza niż sąsiednie płuco i jest najlepiej uwidoczniona na filmie w punkcie czasowym 01:54 – 01:55, gdzie jest widoczna tuż poniżej górnego ramienia retraktora, powyżej lewego płuca (patrz rysunek uzupełniający 1 dla nieruchomego obrazu wideo z adnotacjami).</li>
	<li>Wykonaj dwa rzuty jedwabnym szwem 7-0 i zamknij go, ściśle przechodząc na podtrzymujący jedwabny szew 3-0, aby zabezpieczyć LAD. Jeśli podwiązanie się powiedzie, obszar przedniej komory dystalny od więzadła zblednie.</li>
	<li>Zakończ węzeł trzecim rzutem w przeciwnym kierunku, aby go zabezpieczyć, upewniając się, że żadna siła pociągowa w górę nie jest przenoszona na szew. Dodatkowe rzuty nie są wymagane, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia mięśnia sercowego lub LAD przez przecięcie szwu.</li>
</ol>
5. Przeszczepienie biodrukowanego plastra na nasierdzie
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieś biodrukowany plaster z płytki sześciodołkowej do obszaru zawału, używając sterylnej wewnętrznej powierzchni otwartego pakietu skalpela chirurgicznego.</li>
	<li>Ostrożnie umieść biodrukowany plaster na przedniej powierzchni nasierdzia, gdzie powinien pokrywać całą powierzchnię i układać się na dolnej i bocznej krawędzi, zakrywając lewą komorę i strefę zawału (obszar zblanszowany).</li>
	<li>Delikatnie zamknij i wyjmij retraktor, nie kierując ostrych krawędzi w stronę serca.</li>
	<li>Użyj szwów prolenowych 6-0 w prostym, przerywanym wzorze, aby zamknąć klatkę piersiową i warstwy mięśniowe.</li>
	<li>Dzięki funkcji Sigh Breath podczas zamykania klatki piersiowej za pomocą szwów prolenowych 6-0, napompuj płuca, aby usunąć nadmiar powietrza z jamy opłucnej, które w przeciwnym razie zostałoby uwięzione w jamie klatki piersiowej i spowodowałoby odmę opłucnową.</li>
	<li>Upewnij się, że skrzynia jest szczelnie zamknięta.</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,0%. Zamknij skórę szwami prolenowymi 6-0 w prostym, przerywanym wzorze. Wyłącz waporyzator izofluranu.</li>
</ol>
6. Odzyskiwanie myszy
<ol>
	<li>Miejscowo nanieść 2 mg/ml bupiwakainy w 0,9% soli fizjologicznej na nacięcie. Podawać również: i) Antysedan (atipamezol) 1 mg/kg; ii) Lasix (furosemid) 8 mg/kg; iii) 600 μl 0,9% roztworu soli fizjologicznej we wstrzyknięciu podskórnym. 
	UWAGA: Antysedan ma na celu szybsze odwrócenie znieczulenia; Furosemid ma na celu usunięcie nadmiaru płynu z powodu zaburzenia pojemności minutowej serca i dodatkowego płynu podawanego w zastrzykach z leków.</li>
	<li>Monitoruj mysz i poczekaj, aż zaobserwuje się niezależny oddech, aby wyjąć mysz z rurki intubacyjnej.</li>
	<li>Gdy mysz wykaże odpowiednią obustronną częstość i głębokość oddychania oraz zareaguje na uszczypnięcie palca u nogi, umieść mysz w czystej klatce regeneracyjnej umieszczonej na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Zapewnij myszce wilgotny pokarm (zwilżony w celu żucia), butelkę z wodą i odżywkę/żel nawilżający. Monitoruj nadmierny wysiłek oddechowy, nadmierne krwawienie lub inne potencjalnie zagrażające życiu powikłania.</li>
	<li>Przez następne trzy dni należy podawać 0,08 mg/kg Temvet (buprenorfiny) w 0,1 ml 0,9% soli fizjologicznej we wstrzyknięciu podskórnym lub dootrzewnowym, dwa razy dziennie, a następnie raz na dobę do piątego dnia po zabiegu.</li>
	<li>Myszy domowe w parach oddzielone przegrodami klatkowymi, aby zapobiec izolacji, jednocześnie zapobiegając zachowaniom bojowym. Monitoruj myszy co najmniej codziennie do końca eksperymentów (28 dni), zwracając szczególną uwagę na ich dobrostan i zwiększając częstotliwość monitorowania, jeśli istnieją jakiekolwiek obawy.</li>
</ol>

<ol><li>Lund, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation%3A+thirty-fourth+adult+heart+transplantation+report-2017%3B+focus+theme%3A+allograft+ischemic+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-fourth adult heart transplantation report-2017; focus theme: allograft ischemic time.</a> Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (10), 1037-1046 (2017).</li>
<li>Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+in+three-dimensional+bioprinting+heart+tissues+for+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 58 (3), 500-510 (2020).</li>
<li>Wang, H., Roche, C. D., Gentile, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+support+for+cardiac+regeneration+in+ischaemic+cardiomyopathy+models%3A+a+systematic+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Omentum support for cardiac regeneration in ischaemic cardiomyopathy models: a systematic scoping review.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , Epub ahead of print. ezaa205(2020).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+of+cardiomyocytes+derived+from+human-induced+pluripotent+stem+cells+improve+recovery+from+myocardial+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spheroids of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells improve recovery from myocardial injury in mice.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 315 (2), 327-339 (2018).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+cardiac+muscle+patches+engineered+from+human+induced-pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+cells+improve+recovery+from+myocardial+infarction+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Large cardiac muscle patches engineered from human induced-pluripotent stem cell-derived cardiac cells improve recovery from myocardial infarction in swine.</a> Circulation. 137 (16), 1712-1730 (2018).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+net+mold-based+method+of+biomaterial-free+three-dimensional+cardiac+tissue+creation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Methods+%28Part+C%29%22%5BJournal%5D)">A net mold-based method of biomaterial-free three-dimensional cardiac tissue creation.</a> Tissue Engineering Methods (Part C). 25 (4), 243-252 (2019).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment%3A+first+clinical+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report.</a> European Heart Journal. 36 (30), 2011-2017 (2015).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiovascular+progenitors+for+severe+ischemic+left+ventricular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiovascular progenitors for severe ischemic left ventricular dysfunction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (4), 429-438 (2018).</li>
<li>Beyersdorf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+bioprinting%3A+new+horizon+for+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional bioprinting: new horizon for cardiac surgery.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 46 (3), 339-341 (2014).</li>
<li>Noor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+personalized+thick+and+perfusable+cardiac+patches+and+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts.</a> Advanced Science. 6 (11), 1900344(2019).</li>
<li>Maiullari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-cellular+3D+bioprinting+approach+for+vascularized+heart+tissue+engineering+based+on+HUVECs+and+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A multi-cellular 3D bioprinting approach for vascularized heart tissue engineering based on HUVECs and iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13532(2018).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+3D+microfibrous+scaffolds+for+engineering+endothelialized+myocardium+and+heart-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioprinting 3D microfibrous scaffolds for engineering endothelialized myocardium and heart-on-a-chip.</a> Biomaterials. 110, 45-59 (2016).</li>
<li>Chachques, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+assistance+by+grafting+a+new+bioartificial+upgraded+myocardium+%28MAGNUM+clinical+trial%29%3A+one+year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Myocardial assistance by grafting a new bioartificial upgraded myocardium (MAGNUM clinical trial): one year follow-up.</a> Cell Transplant. 16 (9), 927-934 (2007).</li>
<li>Chachques, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastomeric+cardiopatch+scaffold+for+myocardial+repair+and+ventricular+support%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Elastomeric cardiopatch scaffold for myocardial repair and ventricular support.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 57 (3), 545-555 (2020).</li>
<li>Reichert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+left+anterior+descending+%28LAD%29+coronary+artery+ligation%3A+an+improved+and+simplified+model+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: an improved and simplified model for myocardial infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55353(2017).</li>
<li>van den Borne, S. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+determines+the+outcome+of+wound+healing+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse strain determines the outcome of wound healing after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 84 (2), 273-282 (2009).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li>
<li>Walker, R. L., Eggel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+monkeys%3F+Beyond+orthodox+approaches+to+the+ethics+of+animal+model+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">From mice to monkeys? Beyond orthodox approaches to the ethics of animal model choice.</a> Animals. 10 (1), 77(2020).</li>
<li>Vagnozzi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acute+immune+response+underlies+the+benefit+of+cardiac+stem-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem-cell therapy.</a> Nature. 577, 405-409 (2019).</li>
<li>Waters, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-inspired+secretome-rich+injectable+hydrogel+to+repair+injured+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Stem cell-inspired secretome-rich injectable hydrogel to repair injured cardiac tissue.</a> Acta Biomaterialia. 69, 95-106 (2018).</li>
<li>Cossu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lancet+Commission%3A+stem+cells+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Lancet Commission: stem cells and regenerative medicine.</a> Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).</li>
<li>Kawamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+therapeutic+effects+of+human+iPS+cell+derived-cardiomyocyte+by+combined+cell-sheets+with+omental+flap+technique+in+porcine+ischemic+cardiomyopathy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced therapeutic effects of human iPS cell derived-cardiomyocyte by combined cell-sheets with omental flap technique in porcine ischemic cardiomyopathy model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8824(2017).</li>
<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%3A+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li>
<li>Kainuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-sheet+therapy+with+omentopexy+promotes+arteriogenesis+and+improves+coronary+circulation+physiology+in+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cell-sheet therapy with omentopexy promotes arteriogenesis and improves coronary circulation physiology in failing heart.</a> Molecular Therapy. 23 (2), 374-386 (2015).</li>
<li>Suzuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentopexy+enhances+graft+function+in+myocardial+cell+sheet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Omentopexy enhances graft function in myocardial cell sheet transplantation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 353-359 (2009).</li>
<li>Zhou, Q., Zhou, J. Y., Zheng, Z., Zhang, H., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+vascularized+patch+enhances+cell+survival+and+modifies+ventricular+remodeling+in+a+rat+myocardial+infarction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">A novel vascularized patch enhances cell survival and modifies ventricular remodeling in a rat myocardial infarction model.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (6), 1388-1396 (2010).</li>
<li>Lilyanna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+lining-mesenchymal+stem+cells+graft+supplemented+with+an+omental+flap+induces+myocardial+revascularization+and+ameliorates+cardiac+dysfunction+in+a+rat+model+of+chronic+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+%28Part+A%29%22%5BJournal%5D)">Cord lining-mesenchymal stem cells graft supplemented with an omental flap induces myocardial revascularization and ameliorates cardiac dysfunction in a rat model of chronic ischemic heart failure.</a> Tissue Engineering (Part A). 19 (11-12), 1303-1315 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+scaffold+with+built-in+vasculature+for+organ-on-a-chip+engineering+and+direct+surgical+anastomosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Biodegradable scaffold with built-in vasculature for organ-on-a-chip engineering and direct surgical anastomosis.</a> Nature Materials. 15 (6), 669-678 (2016).</li>
</ol>

Żaden.
OŚWIADCZENIE O FINANSOWANIU:
Christopher D. Roche był wspierany przez stypendium Sir Johna Loewenthala 2019 (University of Sydney), Le Gros Legacy Fund New Zealand (PhD012019) oraz stypendium doktoranckie Heart Research Australia (2019-02). Carmine Gentile był wspierany przez University of Sydney Kick-Start Grant, University of Sydney Chancellor's Doctoral Incentive Programme Grant, UTS Seed Funding, Catholic Archdiocese of Sydney Grant for Adult Stem Cell Research oraz Sydney Medical School Foudation Cardiothoracic Surgery Research Grant.

Metoda ta ułatwia operatorowi skuteczne przeszczepienie biodrukowanego plastra poprzez nałożenie go na powierzchnię nasierdzia serca myszy po zawale po trwałym podwiązaniu LAD. W tej metodzie skoncentrowanej na wykonalności jesteśmy w stanie wykonać tę procedurę na ośmiu myszach na dzień roboczy (łącznie z przygotowaniem pomieszczenia przed i po). Seria biodruku polegająca na wytworzeniu ośmiu plastrów o średnicy 1 cm2 w studzienkach z sześciodołkowymi płytkami trwa 2-3 godziny (wliczając czas przygotowania przed i po). Użyliśmy sterylnego wnętrza opakowania skalpela chirurgicznego jako miarki do naszego plastra, który jest łatwo dostępny i generalnie wiąże się z minimalnymi kosztami, wykorzystując naturalne właściwości adhezyjne plastra hydrożelowego z alginianem / żelatyną, aby ułożyć plaster na przedniej powierzchni zawału serca. Z naszego doświadczenia wynika, że protokół ligacji LAD u myszy jest zależny od operatora, a niższą śmiertelność po 28 dniach można osiągnąć dzięki doświadczonym operatorom specjalizującym się w jednym modelu. Van den Borne i wsp.16 stwierdzili, że myszy C57BL6 wykazują 44% śmiertelność po trwałym podwiązaniu LAD po 28 dniach bez aplikacji plastra, co jest wyższe niż górna granica 30%, którą zaobserwowaliśmy za pomocą tej metody.
Etap intubacji ma kluczowe znaczenie i sam w sobie może być źródłem śmiertelności myszy, chyba że zostanie wykonany przez wykwalifikowanego operatora. Jest to utrudnione ze względu na niewielki rozmiar tchawicy, dlatego na tym etapie operator nosi szkła powiększające. Używamy wstrzykiwanej ketaminy/ksylazyny, a także wziewnego izofluoranu do indukcji znieczulenia, tak aby mysz była głęboko znieczulona przy stosunkowo niskich dawkach każdego leku. Dlatego nie ma ryzyka, że mysz obudzi się podczas tego etapu intubacji, ale unika się wysokiej śmiertelności związanej z wysokimi dawkami pojedynczego leku. Atropinę podawano również w celu przeciwdziałania skutkom ubocznym, takim jak bradykardia i nadmierne ślinotok. Użycie reflektora przyłożonego do gardła zewnętrznie oświetla tchawicę wewnętrznie, dzięki czemu jest bardziej widoczna, a struny głosowe muszą być uwidocznione otwierające się i zamykające wraz z częstością oddechów myszy (zwykle ~120 oddechów na minutę). Bardzo ważne jest, aby idealnie ustawić mysz (dlatego na tym etapie preferowana jest twarda powierzchnia, a nie mata ocieplająca pod myszą), z dwoma siekaczami przytrzymywanymi przez zapętloną nić i językiem bardzo delikatnie cofniętym za pomocą kleszczy/szpatułek, aby otworzyć usta i uwidocznić tchawicę. Po zakończeniu intubacji operator musi uważać, aby nie przesunąć rurki w transporcie z obszaru intubacji do stołu operacyjnego (pod którym znajduje się mata grzewcza, aby zapobiec hipotermii). Podczas podłączania rurki oddechowej do aparatu respiratora bardzo ważne jest, aby jedną ręką ustabilizować rurkę, a drugą połączyć obwód respiratora, tak aby ruch rurki oddechowej był minimalny, np. Wciskanie jej głębiej do tchawicy podczas podłączania segmentu respiratora rurki.
W tym badaniu użyliśmy alginianu 4% (w/v)/żelatyny 8% (w/v) w Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Hydrożele alginianowo-żelatynowe są znane ze swojej biokompatybilności, niskich kosztów i właściwości biomechanicznych, co czyni je przydatnymi w strategiach inżynierii tkankowej3D. Te hydrożele mogą być sieciowane przez łagodne żelowanie poprzez dodanie jonów wapnia, co pozwala na zmianę lepkości. Po bioprintingu nałożyliśmy chlorek wapnia (CaCl2) 2% (w/v) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na plastry, a następnie hodowaliśmy je w DMEM na płytkach sześciodołkowych przez 7-14 dni przed ich przesadzeniem. Było to optymalne okno po tym, jak plastry zawierające komórki serca zaczęły bić w hodowli, ale zanim plastry zaczęły się rozpadać. Podczas gdy CaCl2 może być regularnie dodawany przez całą fazę po biodrukowaniu w celu zmniejszenia rozpadu plastrów, stwierdziliśmy, że wewnętrzna lepkość hydrożelu była wystarczająca, aby plastry zachowały swoją strukturę aż do przeszczepu przy użyciu tylko jednej początkowej dawki CaCl2.
Metoda pozwoliła na udany przeszczep bez szwów (które mogą uszkodzić serce) lub kleju (który może blokować granicę faz między plastrem a sercem). Przyszłe badania mogą potwierdzić hipotezę, że przeszczep bez szwów i kleju nie wpływa negatywnie na wszczepienie u myszy, ponieważ bardzo ważne jest, aby plaster nie zsunął się z serca ani nie ingerował w płuca. Inne badania oceniające wszczepianie plastrów w stałych modelach ligacji LAD z naprawą opartą na łatach3 mierzyły powierzchnię przeszczepu (mm2) pozostałą w czasie24, grubość przeszczepionego plastra (μm) ponownie wydobywanego w czasie25, ilościowe oznaczanie przeszczepionych komórek za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)26 lub strumień emisji fotonów bioluminescencyjnych znakowanych żywych komórek dawcy (miara fotonów emitowanych na sekundę, która może określić ilościowo znakowane przeszczepione komórki przeżywalność u żywych zwierząt w czasie)27. Przyszłe badania mogą wykorzystywać te metody do dalszej oceny, czy przeszczep bez szwów i bez kleju wpływa na wszczepienie plastra (a także na strukturalne i funkcjonalne skutki dla mięśnia sercowego gospodarza). Niemniej jednak, makroskopowo po 28 dniach in vivo u naszych immunokompetentnych myszy, przednie śródpiersie wykazywało zmienny materiał włóknisty i zrosty. Mechanizm regeneracji serca za pomocą plastrów może wynikać ze stymulacji odpowiedzi zapalnych makrofagów gospodarza19 lub wydzielanych czynników immunologicznych20, a nie z numerycznego uzupełniania komórek. Jeśli stan zapalny odgrywa pozytywną rolę, obecność obcego materiału hydrożelowego może być korzystna. Alternatywnie, aby zmniejszyć obecność ciał obcych, korzystne może być to, że składnik hydrożelowy rozpadnie się z czasem. W rzeczywistości niektóre podejścia wykorzystują biomateriały, które początkowo podtrzymują komórki, a następnie rozpadają się, pozostawiając tylko tkankę28,29. Przyszłe badania mające na celu pełną analizę wszczepienia plastrów i lepsze zrozumienie mechanizmów stojących za regeneracją serca za pomocą plastrów mogą doprowadzić do zoptymalizowania projektów eksperymentalnych przed translacją do badań klinicznychna ludziach 2.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten prawdopodobnie będzie szeroko wykonalny, a także odpowiedni do testowania wielu grup biodrukowanych plastrów 3D, na przykład z różną zawartością komórkową. Przyszłe kierunki tej metody obejmują biodrukowanie plastrów zawierających zaawansowane hydrożele, które nie były wcześniej testowane in vivo, lub testowanie wpływu różnych autologicznych lub allogenicznych komórek pochodzących z komórek macierzystych, w celu optymalizacji przed przejściem do dużych modeli zwierzęcych.

Przeszczep serca jest złotym standardem leczenia dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością serca, ale brakuje organów od dawców. Wymaga supresji układu odpornościowego, aby zapobiec odrzuceniu przeszczepu, a roczna śmiertelność wynosi 15% na całym świecie1. W związku z tym istnieje długotrwała zachęta do regeneracji mięśnia sercowego w przedklinicznych modelach zwierzęcych w celu przełożenia na badania na ludziach2,3,4,5,6,7,8,9. Ostatnie postępy w biodrukowaniu 3D komórek macierzystych lub komórek serca pochodzących z komórek macierzystych zyskały uwagę jako obiecujące podejście do regeneracji mięśnia sercowego2,3,9,10,11,12.
Pierwsze próby bezpieczeństwa na ludziach z zastosowaniem plastrów do regeneracji serca zostały zgłoszone, z autologicznymi komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego zawieszonymi w kolagenie lub embrionalnymi komórkami progenitorowymi serca pochodzącymi z komórek macierzystych w fibrynie, przeszczepionymi do nasierdzia7,8,13. Jednak w celu uzyskania bardziej precyzyjnej, skalowalnej, zautomatyzowanej i powtarzalnej metody, biodrukowanie 3D zoptymalizowanych plastrów hydrożelowych, które mają być nakładane na powierzchnię nasierdzia serca, jest obiecującym podejściem do regeneracji mięśnia sercowego dla pacjentów, którzy w przeciwnym razie potrzebowaliby przeszczepu serca2,10,11,12.
Zanim będzie można przeprowadzić translację na badania na ludziach, potrzebne są przedkliniczne badania na zwierzętach. Przedkliniczne modele in vivo dążące do regeneracji mięśnia sercowego zostały opisane u świń5, sheep14, rats6 i myszy4. Powszechny model zawału mięśnia sercowego (MI) u myszy wykorzystuje trwałe podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej zstępującej przednią (LAD)15,16. Wśród różnych szczepów myszy, trwała ligacja LAD u myszy C57BL6 ma akceptowalny wskaźnik przeżycia i zazwyczaj przedstawia konsekwentną przebudowę i zmiany sercowe po MI16. W modelach gryzoni opisano kilka podejść, w których tkanka serca została zastosowana do serca w celu skutecznej regeneracji uszkodzonego mięśnia sercowego4,6,17. Podczas gdy duże zwierzęta nadal stanowią bardziej istotny klinicznie model do testowania właściwości regeneracyjnych serca5,14, wszechstronność i wykonalność modelu mysiego nadaje się do tego szybko zmieniającego się obszaru badań. Może to pozwolić uniknąć niektórych pułapek typowych dla badań na dużych zwierzętach, w tym (ale nie wyłącznie): 1) wysokiej śmiertelności zwierząt (chyba że ukośne tętnice wieńcowe są podwiązane, co prowadzi do nieprzewidywalnych zawałów segmentowych14, lub dystalny koniec LAD jest niedrożny, a następnie następuje reperfuzja zamiast trwałego podwiązania5); 2) kwestie etyczne związane ze stosunkowo zwiększonymi szkodami powodowanymi przez protokoły dla dużych zwierząt w porównaniu z myszami18; 3) zwiększone koszty i/lub problemy z wykonalnością, na przykład względna niedostępność sprzętu dla dużych zwierząt, takiego jak skanery MRI14. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że biorąc pod uwagę długi czas trwania i zaangażowanie typowe dla badań na dużych zwierzętach, mogą one stać się przestarzałe przed ich zakończeniem, zwłaszcza w obliczu szybkiego rozwoju typowego dla tej dziedziny. Na przykład dopiero niedawno pojawiła się kluczowa rola, jaką odgrywają komórki zapalne i mediatory w regulacji regeneracji serca19,20. Co więcej, kluczowa rola badań przedklinicznych, takich jak modele na małych zwierzętach, została podkreślona przez Komisję Lancet jako niezbędny krok w kierunku zdobycia solidnej wiedzy przed przejściem do badań klinicznych na ludziach21.
Aby ułatwić postęp w zrozumieniu mechanizmów i optymalizacji warunków dla metod regeneracji serca in vivo opartych na łatach, prezentujemy nowatorskie podejście opisujące metodę "scoop and rappe" polegającą na nałożeniu biodrukowanej w 3D plastry hydrożelowej alginian/żelatynowej na powierzchnię serc z zawałem u myszy C57BL6. Celem tego podejścia jest dostarczenie wszechstronnego modelu in vivo do testowania biodrukowanych plastrów 3D, które prawdopodobnie będą wykonalne w szerokich kontekstach badawczych dla szybko rozwijającej się dziedziny regeneracji serca2. Metodę tę można zaadaptować do testowania plastrów generowanych metodami innymi niż biodrukowanie, różnych hydrożeli oraz autologicznych lub allogenicznych komórek macierzystych pochodzących z plastrów in vivo. Jednak szczegółowe rozważania na temat biodruku, hydrożeli lub typów komórek wykraczają poza zakres tego badania, które koncentruje się na metodzie przeszczepu chirurgicznego.
Zalety protokołu obejmują to, że zawał mięśnia sercowego i aplikacja biodrukowanego plastra są wykonywane w jednym zabiegu chirurgicznym, który można wykonać szybko, przy użyciu łatwo dostępnych, opłacalnych narzędzi laboratoryjnych i przy stosunkowo niskiej śmiertelności. Zazwyczaj pozwala również na większą liczbę zwierząt niż duże modele zwierzęce na mniejszej przestrzeni, co pozwala na solidne porównanie wielu grup eksperymentalnych, co jest szczególnie przydatne w przypadku porównywania wielu grup in vivo. Z drugiej strony, protokół ten ma następujące wady, że: 1) model mysi jest bardziej odległy od wielkości ludzkiego serca, anatomii i fizjologii niż w dużych modelach zwierzęcych i nie przekłada się bezpośrednio na ludzi; 2) mysi LAD rozgałęzia się proksymalnie, ze znaczną zmiennością między poszczególnymi myszami, co prowadzi do zmienności wielkości zawału (problem wspólny dla dużych modeli zwierzęcych); 3) plaster musi być nałożony na całą przednią powierzchnię serca, co jest mniej precyzyjne niż nałożenie na określony obszar zawału; oraz 4) plaster jest nakładany natychmiast w momencie zawału mięśnia sercowego (w przypadku stosowania u ludzi prawdopodobnie bardziej przydatne klinicznie będzie opracowanie plastra do stosowania na przewlekle zawałowe niewydolność serca kilka miesięcy po początkowym MI14).
Niemniej jednak, jeśli zostanie odpowiednio dobrany zgodnie z testowaną hipotezą, ten protokół może szybko dostarczyć krytycznych danych in vivo, z wysokimi liczbami n, w sposób zgodny z materiałami, budżetem i wiedzą specjalistyczną dostępną w większości laboratoriów. W porównaniu z dużymi modelami zwierzęcymi jest to model in vivo, który jest wystarczająco wszechstronny, aby dostosować się do pojawiających się technologii biodruku 3D (na przykład dzięki względnej łatwości przeprowadzania badań pilotażowych w celu sprawdzenia wykonalności i bezpieczeństwa przed przejściem do większych modeli zwierzęcych). Byłby odpowiedni dla badaczy, którzy chcą generować dane in vivo wydajnie i niedrogo, być może przeprowadzając wielokrotne porównania biodrukowanych plastrów 3D z różnymi parametrami biodruku, komórkami lub hydrożelami w łatach. Byłoby to szczególnie przydatne do testowania interakcji różnych mieszanin komórek macierzystych i komórek pochodzących z komórek macierzystych z hydrożelami in vivo bez nadmiernego marnotrawstwa drogich linii komórkowych lub innych materiałów, które mogą wystąpić w przypadku stosowania plastrów na dużą skalę. Wykorzystanie modelu mysiego ułatwiłoby również testowanie plastrów zawierających zgodne gatunkowo linie komórek i komórek macierzystych pochodzących od myszy lub komórek pochodzących od ludzi, w przypadku których pożądane są jednolite myszy ze specyficznym niedoborem odporności. Ponadto testy na genetycznie zmodyfikowanych szczepach myszy mogą pozwolić naukowcom na wyizolowanie wpływu określonych genów na szlaki sygnałowe i na określone typy komórek istotne dla chorób sercowo-naczyniowych, co nie byłoby obecnie możliwe w dużym modelu zwierzęcym.

<table><tbody><tr><td>3-0 niewchłanialny pleciony jedwab impregnowany</td><td>Ethicon</td><td>232G</td><td></td></tr><tr><td>6-0, 24" (60 cm) Szew prolenowy (polipropylenowy), niebieski monofilament</td><td>Ethicon</td><td>8805H</td><td></td></tr><tr><td>7-0, 18" (45 cm) jedwabny pleciony</td><td>Ethicon</td><td>768G</td><td></td></tr><tr><td>Regulowany mikroskop stereoskopowy z powiększeniem 6,4x</td><td>Olympus</td><td>SZ 3060 STU1</td><td></td></tr><tr><td>Anitisedan (atipamezol)</td><td>Zoetis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan atropiny 0,6 mg, fiolki 1 mL, 10</td> sztuk <td>Symbion Pharmacy Services</td><td>ATRO S I2</td><td></td></tr><tr><td>Bupiwakaina, 20 mL, 5 fiolek</td><td>Baxter Heathcare</td><td>BUPI I C01</td><td></td></tr><tr><td>Temvet (buprenorfina), 300 &mikro; g/ml, butelka 10 ml</td><td>Troy Laboratories</td><td>TEMV I 10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki z zakrzywioną końcówką</td><td>Kent</td><td>Scientific INS650915-4</td><td>Kleszczyki opatrunkowe do irysów, zakrzywione kleszczyki opatrunkowe o długości 10 cm; końcówki ząbkowane 0,8 mm; stal nierdzewna.</td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne do cięcia mięśni/skóry</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600393-G</td><td>Nożyczki preparacyjne, proste, o długości 10 cm</td></tr><tr><td>Zestaw do intubacji dotchawiczej</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE</td><td>W zestawie cewnik/rurka do intubacji (20 G), światłowodowe źródło światła i szpatułka dentystyczna</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600124</td><td>Mikronożyczki McPherson-Vannas, długość 8 cm, proste, końcówki 0,1 mm, ostrza 5 mm; stal nierdzewna.</td></tr><tr><td>Lasix (furosemid) 20 mg, 2 mL, 5 sztuk</td><td>Sigma Company</td><td>LASI A 1</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka termiczna do regeneracji zwierząt po operacji</td><td>Passwell</td><td>PAD</td><td>Passwell Cosy Poduszka grzewcza dla zwierząt - 26 cm x 36 cm; 10 watów; Miękka osłona PVC</td></tr><tr><td>Ketamina 100 mg, 50 ml</td><td>CEVA Animal Heath</td><td>KETA I 1</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600137</td><td>Castroviejo uchwyt na igły, ząbkowany, długość 14 cm, szczęki 1,2 mm z zamkiem</td></tr><tr><td>PhysioSuite z automatycznym respiratorem MouseVent G500</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-MVG</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Maść okulistyczna (sterylny lubrykant do oczu)</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Samozabezpieczający się zwijacz myszy zębatej</td><td>Kent Scientific INS600240</td><td></td><td>ALM ząbkowany zwijacz samozabezpieczający, długość 7 cm</td></tr><tr><td>Kleszcze proste</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650908-4</td><td>Bardzo cienkie kleszcze opatrunkowe, 12,5 cm Długie, ząbkowane końcówki, 0,35 x 0,10 mm; stal nierdzewna.</td></tr><tr><td>Lupy chirurgiczne</td><td>Kent Scientific</td><td>SL-001</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator VetFlo</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1205S-M</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 100 mg, 50 ml</td><td>Randlab</td><td>XYLA I R01</td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczep biodrukowanego plastra 3d w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testowanie właściwości regeneracyjnych biodrukowanych w 3D plastrów serca in vivo przy użyciu mysich modeli niewydolności serca poprzez stałe podwiązanie lewego przedniego zstępującego (LAD) jest trudną procedurą i ma wysoką śmiertelność ze względu na swoją naturę. Opracowaliśmy metodę konsekwentnego przeszczepiania biodrukowanych plastrów komórek i hydrożeli na nasierdzie serca myszy po zawale w celu przetestowania ich właściwości regeneracyjnych w solidny i wykonalny sposób. Najpierw głęboko znieczulona mysz jest starannie intubowana i wentylowana. Po torakotomii bocznej lewej strony (chirurgiczne otwarcie klatki piersiowej) odsłonięty LAD jest trwale podwiązany, a biodrukowany plaster przeszczepiany na nasierdzie. Mysz szybko wraca do zdrowia po zabiegu po zamknięciu klatki piersiowej. Do zalet tego solidnego i szybkiego podejścia należy przewidywana 28-dniowa śmiertelność do 30% (niższa niż 44% zgłoszone w innych badaniach wykorzystujących podobny model trwałego podwiązania LAD u myszy). Co więcej, podejście opisane w tym protokole jest wszechstronne i może zostać zaadaptowane do testowania biodrukowanych plastrów przy użyciu różnych typów komórek lub hydrożeli, w przypadku gdy do optymalnego zasilania badań potrzebna jest duża liczba zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiamy to jako korzystne podejście, które może zmienić badania przedkliniczne w przyszłych badaniach w dziedzinie regeneracji serca i inżynierii tkankowej.

W momencie transplantacji lepkość łatki w temperaturze pokojowej (bez zastosowania dodatkowego sieciowania) pozwoliła jej „oblec” kontury serca (Rycina 1) i dynamicznie poruszać się zgodnie z cyklem pracy serca. Po operacji łatki pozostawiono in vivo na 28 dni, ponieważ badania wykazały, że jest to odpowiedni okres pozwalający na wystąpienie efektów działania łatki na funkcję serca biorcy3,4 (choć zgłaszano, że pełne efekty funkcjonalne mogą nie być widoczne aż do trzech miesięcy po transplantacji)2. Fotografia łatki pokazanej in situ na sercu myszy na Rycynie 1 została wykonana bezpośrednio po aplikacji, wykazując zdolność łatki do dopasowania się do kształtu serca podczas transplantacji. Ten reprezentatywny wynik pokazuje, że hydrożel pozwala łatce dopasować się do konturów serca, a w miejscach wystąpienia nadmiernego napięcia hydrożel uległ rozdarciu, co obrazuje pusty (wolny od hydrożelu) obszar trójkątny na Rycynie 1 (oznaczony na obrazie czarną gwiazdką). Dane dotyczące przeżywalności (krzywe przeżycia Kaplana-Meiera) przedstawiono na Rycynie 2 w porównaniu z myszami poddanymi procedurze pozorowanej (przeprowadzenie igły i szwy pod LAD bez podwiązania, a następnie zamknięcie klatki piersiowej myszy).
<img alt="Miejsce operacyjne z markerami prowadzącymi, zbliżenie jamy ustnej, badanie stomatologiczne, diagnoza patomorfologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61675/61675fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Biodrukowany płat sercowy aplikowany na osierdzie serca myszy C57BL6. Przedstawiono biodrukowany plaster o wymiarach 10 mm x 10 mm x 0,4 mm (bezpośrednio po transplantacji), zawierający hydrożel (alginian 4% (w/v)/żelatyna 8% (w/v) w pożywce), który obejmuje obszar zawałowy i przylega do powierzchni epikardium (białe groty strzałek i linie przerywane = krawędź plastra). Lepkość plastra pozwala mu dopasować się do konturów serca, a w miejscu wystąpienia nadmiernego napięcia w części górnej plaster pękł, tworząc trójkątny, niepokryty hydrożelem obszar odsłonięty (czarna gwiazdka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61675/61675fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres analizy przeżywalności, Sham vs. MI, 28 dni, % przeżywalności w czasie, wyniki statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61675/61675fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Analiza przeżywalności metodą Kaplana-Meiera przez 28 dni po zawale mięśnia sercowego. W grupie proceduralnej padło dziewięć myszy (n=38), co dało całkowity wskaźnik śmiertelności na poziomie 24%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61675/61675fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Klatka z filmu (punkt czasowy filmu 01:54 – 01:5) przedstawiająca lewe uszko (przedsionka lewego). Strzałka wskazuje dolno-przyśrodkowy wierzchołek lewego uszka, który jest widoczny jako struktura trójkątna na górnej lewej krawędzi serca. W przypadku, gdy LAD nie jest wyraźnie widoczna, wierzchołek lewego uszka może służyć jako punkt orientacyjny dla wprowadzenia igły w celu przeprowadzenia nici pod LAD. Punkt wejścia znajduje się 1 mm poniżej i przyśrodkowo w stosunku do najniższego punktu, którego osiąga wierzchołek lewego uszka podczas dynamicznych ruchów serca (czarna strzałka wskazuje dolno-przyśrodkowy wierzchołek lewego uszka). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61675/61675supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Co 10 minut ktoś w Australii dostaje zawału serca. Może to pozostawić ich z uszkodzonym mięśniem sercowym, co może prowadzić do niewydolności serca. Odkryliśmy, że możemy przekształcić komórki macierzyste z krwi lub skóry w komórki bijącego serca.Następnie, jeśli umieścimy te przeprogramowane komórki w naszej biodrukarce 3D, używając biotuszu, wierzymy, że możemy stworzyć plastry na serce z komórkami pasującymi do ludzkich komórek. Głęboko znieczulona mysz przy użyciu ketaminy ksylazyny jest intubowana za pomocą cewnika o rozmiarze 20. Po intubacji trackera mysz jest ostrożnie umieszczana na poduszce grzewczej, a następnie podłączana do respiratora, który automatycznie ustawia objętość docelową na podstawie wagi myszy.W lekkim znieczuleniu przy użyciu 2% fluorku ISO mysz jest po prostu czysta jodem i etanolem. Lewa torakotomia boczna jest wykonywana w celu odsłonięcia serca. Między trzecim a czwartym żebrem umieszcza się zwijacz.Osierdzie jest ostrożnie cięte. LAD zidentyfikowany pod mikroskopem. W przypadku etapu podwiązania LAD ważne jest, aby nie dopuścić do przecięcia szwu przez LAD.Dlatego na sercu umieszcza się wzmacniający kawałek jedwabnego szwu 3,06, jak pokazano, biegnący w tym samym kierunku i tuż nad LAD. Za pomocą jedwabnego szwu 7,06 LAD jest izolowany i trwale podwiązany. Pozwala to na zblednięcie serca, które otrzymuje zawał serca.Doprowadzi to do przebudowy, a lewa komora z czasem ulegnie awarii. Biodrukowana w 3D łatka na serce jest generowana w laboratorium za pomocą biodrukarki 3D. Pozwala to na odkładanie komórek serca warstwa po warstwie, przy użyciu kombinacji komórek i hydrożeli.Możesz zobaczyć jeden unoszący się w powietrzu na tym filmie, a teraz na tym obrazie. Oto obraz wyglądu plamy podczas obrazowania za pomocą mikroskopii światła epifluorescencyjnego w studzience z sześciodołkową płytką. Plaster został zabarwiony barwnikiem Hoechst na jądra komórkowe, a ta niebieska plama podkreśla również hydrożele autofluorescencyjne.Jest to nienaruszony plaster żelatynowy algenianowy nadający się do przeszczepu, podobny do tego pokazanego na filmie. Dzięki naszej metodzie, większość plastrów zaczęła się rozpadać między 14 a 28 dniem, w kulturze, jak pokazano na tym zdjęciu innego plastra, który się rozpadł. Stwierdziliśmy, że optymalny czas na przeszczepienie plastrów przypadał między siódmym a czternastym dniem po bioprintingu.To wtedy plamy zawierające komórki serca zaczęły bić, wykazując pewien stopień dojrzewania tkanek, ale zanim plamy zaczęły się rozpadać. Plaster jest przenoszony na salę operacyjną i powoli i ostrożnie umieszczany na sercu w części myszy. Ostrożnie jest również przenoszony do obszaru wnioskowania.Zwijacz jest powoli usuwany. Na koniec trzecie i czwarte żebro są zamykane razem za pomocą szwu z prolenu 6,0. Wraz z mięśniem żebra są zamykane, a następnie zamykana jest skóra.Po zamknięciu klatki piersiowej myszy wstrzykuje się Antisedan i furosemid. Powoli mysz odzyska niezależną aktywność oddechową i zareaguje na uszczypnięcie palca. Mysz jest ściśle monitorowana, a po wybudzeniu ze znieczulenia umieszcza się ją we własnej klatce.Ten obraz pokazuje, wraz z przyjętym obszarem, gdzie biodrukowany plaster będzie znajdował się na górze serca myszy. Podsumowując, wykazaliśmy, że biodrukowane w 3D plastry żelatyny algenowej można przeszczepić naszą metodą na nasierdzie, w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. W fazie biodruku hydrożele żelatynowe algenianowe mają doskonałą drukowność ze względu na swoje właściwości reologiczne, co pozwala na ekstruzję bez uszkadzania komórek, ale także ma wytrzymałość biomechaniczną, aby zachować swoją strukturę po biodruku 3D i podczas przeszczepu.Nasza metoda prawdopodobnie będzie szeroko wykonalna, a także odpowiednia do testowania wielu grup biodrukowanych plastrów 3D. Na przykład z różną zawartością komórkową.

transplantation-3d-bioprinted-patch-murine-model-myocardial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano sposób wykorzystania szybkiego i wiarygodnego modelu do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych niedokrwienia mięśnia sercowego.

Ligacja LAD: mysi model zawału mięśnia sercowego

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Ten protokół ma na celu złagodzenie ograniczeń związanych z nieprawidłowym przeszczepem komórek macierzystych w leczeniu zawałów mięśnia sercowego za pomocą systemu hydrożelowego i kleju na bazie fibryny. Dzięki takiemu podejściu można utrzymać kontakt komórka-tkanka po zawale choroby, zwiększając potencjał terapeutyczny korzystnych środków w miejscu urazu.

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Tutaj prezentujemy protokół indukcji kriouszkodzenia lewej komory, po którym następuje wszczepienie łaty mięśnia sercowego, pochodzącej z ludzkich kardiomiocytów komórek iPS w modelu świnki morskiej.

Implantacja plastrów sercowo-mięśniowych pochodzących z hiPSC po urazie mięśnia sercowego w modelu świnki morskiej

Terapia oparta na komórkach macierzystych pojawiła się jako skuteczna strategia naprawy uszkodzonych tkanek serca po zawale mięśnia sercowego. Zapewniamy optymalną aplikację in vivo do przeszczepu komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli żelatynowych, które mogą być sieciowane enzymatycznie.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Modele transplantacji serca u myszy stanowią cenne narzędzia badawcze do badania immunologii transplantacyjnej. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje heterotopowy przeszczep serca szyjki macicy u myszy, który polega na umieszczeniu mankietów na wspólnej tętnicy szyjnej biorcy i pniu tętnicy płucnej dawcy, aby umożliwić laminarny przepływ krwi.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem mankietów naczyniowych

Poznaj metodę przeszczepu biodrukowanych łat sercowych w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. Technika obejmuje bioprinting komórek sercowych oraz chirurgiczne umieszczenie łaty na powierzchni serca.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Przeglądaj więcej filmów