Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego
26 września 2020
Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.
Co 10 minut ktoś w Australii dostaje zawału serca. Może to pozostawić ich z uszkodzonym mięśniem sercowym, co może prowadzić do niewydolności serca. Odkryliśmy, że możemy przekształcić komórki macierzyste z krwi lub skóry w komórki bijącego serca.
Następnie, jeśli umieścimy te przeprogramowane komórki w naszej biodrukarce 3D, używając biotuszu, wierzymy, że możemy stworzyć plastry na serce z komórkami pasującymi do ludzkich komórek. Głęboko znieczulona mysz przy użyciu ketaminy ksylazyny jest intubowana za pomocą cewnika o rozmiarze 20. Po intubacji trackera mysz jest ostrożnie umieszczana na poduszce grzewczej, a następnie podłączana do respiratora, który automatycznie ustawia objętość docelową na podstawie wagi myszy.
W lekkim znieczuleniu przy użyciu 2% fluorku ISO mysz jest po prostu czysta jodem i etanolem. Lewa torakotomia boczna jest wykonywana w celu odsłonięcia serca. Między trzecim a czwartym żebrem umieszcza się zwijacz
.Osierdzie jest ostrożnie cięte. LAD zidentyfikowany pod mikroskopem. W przypadku etapu podwiązania LAD ważne jest, aby nie dopuścić do przecięcia szwu przez LAD.
Dlatego na sercu umieszcza się wzmacniający kawałek jedwabnego szwu 3,06, jak pokazano, biegnący w tym samym kierunku i tuż nad LAD. Za pomocą jedwabnego szwu 7,06 LAD jest izolowany i trwale podwiązany. Pozwala to na zblednięcie serca, które otrzymuje zawał serca.
Doprowadzi to do przebudowy, a lewa komora z czasem ulegnie awarii. Biodrukowana w 3D łatka na serce jest generowana w laboratorium za pomocą biodrukarki 3D. Pozwala to na odkładanie komórek serca warstwa po warstwie, przy użyciu kombinacji komórek i hydrożeli.
Możesz zobaczyć jeden unoszący się w powietrzu na tym filmie, a teraz na tym obrazie. Oto obraz wyglądu plamy podczas obrazowania za pomocą mikroskopii światła epifluorescencyjnego w studzience z sześciodołkową płytką. Plaster został zabarwiony barwnikiem Hoechst na jądra komórkowe, a ta niebieska plama podkreśla również hydrożele autofluorescencyjne.
Jest to nienaruszony plaster żelatynowy algenianowy nadający się do przeszczepu, podobny do tego pokazanego na filmie. Dzięki naszej metodzie, większość plastrów zaczęła się rozpadać między 14 a 28 dniem, w kulturze, jak pokazano na tym zdjęciu innego plastra, który się rozpadł. Stwierdziliśmy, że optymalny czas na przeszczepienie plastrów przypadał między siódmym a czternastym dniem po bioprintingu.
To wtedy plamy zawierające komórki serca zaczęły bić, wykazując pewien stopień dojrzewania tkanek, ale zanim plamy zaczęły się rozpadać. Plaster jest przenoszony na salę operacyjną i powoli i ostrożnie umieszczany na sercu w części myszy. Ostrożnie jest również przenoszony do obszaru wnioskowania.
Zwijacz jest powoli usuwany. Na koniec trzecie i czwarte żebro są zamykane razem za pomocą szwu z prolenu 6,0. Wraz z mięśniem żebra są zamykane, a następnie zamykana jest skóra.
Po zamknięciu klatki piersiowej myszy wstrzykuje się Antisedan i furosemid. Powoli mysz odzyska niezależną aktywność oddechową i zareaguje na uszczypnięcie palca. Mysz jest ściśle monitorowana, a po wybudzeniu ze znieczulenia umieszcza się ją we własnej klatce.
Ten obraz pokazuje, wraz z przyjętym obszarem, gdzie biodrukowany plaster będzie znajdował się na górze serca myszy. Podsumowując, wykazaliśmy, że biodrukowane w 3D plastry żelatyny algenowej można przeszczepić naszą metodą na nasierdzie, w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. W fazie biodruku hydrożele żelatynowe algenianowe mają doskonałą drukowność ze względu na swoje właściwości reologiczne, co pozwala na ekstruzję bez uszkadzania komórek, ale także ma wytrzymałość biomechaniczną, aby zachować swoją strukturę po biodruku 3D i podczas przeszczepu.
Nasza metoda prawdopodobnie będzie szeroko wykonalna, a także odpowiednia do testowania wielu grup biodrukowanych plastrów 3D. Na przykład z różną zawartością komórkową.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół transplantacji biodrukowanego w 3D patcha na epikardium myszy po zawale, służący do modelowania niewydolności serca. Metoda obejmuje szczegółowe etapy chirurgiczne oraz zastosowanie biodrukowanych patchy wykonanych z komórek serca.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa serca
- Biodruk 3D
- Modele zawału mięśnia sercowego
Wstęp
- Zawały serca mogą prowadzić do uszkodzenia mięśnia sercowego i niewydolności serca.
- Komórki macierzyste mogą zostać przeprogramowane w bijące komórki serca.
- Biodruk 3D umożliwia tworzenie łat serca przy użyciu bioatramentu.
- Kluczowym czynnikiem sukcesu jest optymalny moment przeszczepienia łaty.
Cel badania
- Opracowanie metody transplantacji biodrukowanych łat serca.
- Ocena wykonalności wykorzystania komórek dopasowanych do pacjenta do wytworzenia łat.
- Ocena skuteczności łat w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.
Zastosowane metody
- Stosowanie ketaminy i ksylazyny do znieczulania myszy.
- Lewostronna boczna torakotomia w celu odsłonięcia serca.
- Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej.
- Transplantacja biodrukowanych łat 3D na serce.
Główne wyniki
- Biodrukowane w technologii 3D łaty wykazały dobrą drukowalność oraz wytrzymałość biomechaniczną.
- Łaty zaczęły ulegać dezintegracji między 14. a 28. dniem hodowli.
- Optymalny moment transplantacji przypadał między 7. a 14. dniem po biodrukowaniu.
- Metoda ta jest odpowiednia do testowania różnych składów biodrukowanych łat.
Wnioski
- Biodrukowane w technologii 3D łaty z alginianu i żelatyny mogą zostać z powodzeniem przeszczepione.
- Technika ta prawdopodobnie znajdzie szerokie zastosowanie w badaniach nad sercem.
- Przyszłe badania mogą analizować różne składy komórkowe w celu uzyskania lepszych rezultatów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół odnosi się do krytycznego wąskiego gardła w badaniach nad regeneracją serca: wiarygodnego testowania in vivo bioprintowanych w 3D łatek terapeutycznych w mysich modelach zawału mięśnia sercowego. Poprzez ograniczenie zmienności proceduralnej i śmiertelności związanej z transplantacją chirurgiczną, umożliwia on bardziej statystycznie istotną ocenę przedkliniczna tkanek inżynieryjnych. Postęp ten wspiera minimalizację ryzyka wczesnych faz opracowywania leków biologicznych i biomateriałów poprzez poprawę powtarzalności w badaniach walidacji funkcjonalnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę funkcjonalną biodrukowanych łat w istotnym dla choroby niedokrwiennym mikrośrodowisku w celu walidacji hipotez mechanistycznych dotyczących przyjęcia tkanki i sygnalizacji parakrynnej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje chirurgiczne podawanie złożonych produktów biologicznych, redukując zmienność międzyosobniczą w zakresie wydajności przyjęcia przeszczepu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia powtarzalną platformę do porównywania formulacji łatek (np. typów komórek, proporcji hydrożeli) w oparciu o wskaźniki utrzymania struktury i integracji.
- Wartość operacyjna: Wspiera średnioprzepustowe przesiewanie kandydatów na biomateriały, umożliwiając spójne dostarczanie chirurgiczne we wszystkich kohortach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia podłużną ocenę przebudowy komory serca oraz powrotu funkcji serca indukowanych za pomocą łatek w klinicznie istotnym modelu niedokrwiennego uszkodzenia.
- Wartość operacyjna: Pozwala na przeprowadzenie badań o odpowiedniej mocy z ograniczoną utratą osobników, co poprawia wykonalność eksperymentów dotyczących optymalizacji dawki i czasu podania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając standaryzowane dostarczanie zmodyfikowanych tkanek po walidacji celu i przed badaniem skuteczności w modelach chorobowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących przeżywalności komórek, ich wszczepienia oraz sekrecji czynników bioaktywnych w obrębie zawałowanego mięśnia sercowego.
- Przesiew: Umożliwia ilościowe porównanie konstrukcji łatki poprzez standaryzowaną implantację chirurgiczną i monitorowanie po przeszczepie.
- Analityka: Generuje odczyty histopatologiczne i funkcjonalne (np. wielkość zawału, grubość ściany), aby uszeregować wydajność łatki.
- Badania translacyjne: Łączy wskaźniki dojrzewania in vitro z wynikami funkcjonalnymi in vivo, aby dostarczyć podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę chirurgiczną do oceny różnych kandydatów do regeneracji serca w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez redukcję zmiennych zakłócających wynikających z zabiegów chirurgicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność złożonych procedur transplantacji tkanek.
- Wartość strategiczna: Redukuje szum biologiczny w ocenach skuteczności, wspierając podejmowanie bardziej jednoznacznych decyzji go/no-go we wczesnej fazie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do regeneracji serca z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o bardziej wiarygodne dane przedkliniczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii serca myszy, anestezjologii oraz opieki pooperacyjnej.
- Zależność od dostępu do narzędzi do mikroszycia, respiratorów oraz stereomikroskopów w celu precyzyjnego podwiązania LAD.
- Konieczność standaryzacji protokołów obsługi i pozycjonowania łatek przez wszystkich operatorów.
- Należy uwzględnić zmienność czasu dojrzewania łatek w zależności od źródła komórek i składu hydrożelu.
- Ograniczenie do modeli urazu ostrego i podostrego; nieprzydatność do badań nad przewlekłym niedokrwieniem bez adaptacji modelu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
