Name: Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Naucz się technik zastrzyków u poczwarek i dorosłych osobników Nasonia vitripennis do edycji genów RNAi i CRISPR. Ta metoda umożliwia funkcjonalne badania genetyczne bez konieczności mikroiniekcji embriogenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze startowe UCSD skierowane do O.S.A. i granty NSF/BIO 1645331 dla J.L.R.

<ol><li>Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+control+of+haplodiploid+sex+determination+in+the+wasp+Nasonia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia.</a> Science. 328 (5978), 620-623 (2010).</li>
<li>Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+component+of+the+Nasonia+sex+determining+cascade+is+maternally+silenced+and+regulates+transformer+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression.</a> PloS One. 8 (5), 63618(2013).</li>
<li>Dalla Benetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+elimination+mediated+by+gene+expression+from+a+selfish+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome.</a> Science Advances. 6 (14), (2020).</li>
<li>Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22selfish%22+B+chromosome+induces+genome+elimination+by+disrupting+the+histone+code+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis.</a> Scientific Reports. 7, 42551(2017).</li>
<li>Ferree, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+uniquely+expressed+in+the+germ-line+tissues+of+the+jewel+wasp+Nasonnia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis.</a> G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).</li>
<li>Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+Nasonia+vitripennis+testis+reveals+novel+transcripts+expressed+from+the+selfish+B+chromosome%2C+paternal+sex+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio.</a> G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).</li>
<li>Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+differences+in+circadian+clock+gene+expression+patterns+and+photoperiodic+diapause+induction+in+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis.</a> The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).</li>
<li>Paolucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latitudinal+variation+in+circadian+rhythmicity+in+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Sciences%22%5BJournal%5D)">Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis.</a> Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).</li>
<li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parasitoid+wasp+Nasonia%3A+an+emerging+model+system+with+haploid+male+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li>
<li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 901(2017).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+microinjection+and+transplantation+technique+for+Nasonia+vitripennis+genome+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li>
<li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+Sarcophaga+bullata+fly+hosts+for+Nasonia+%28Parasitoid+Wasp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li>
<li>Werren, J. H., Loehlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+maintenance+of+Nasonia+vitripennis+%28Parasitoid+Wasp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).</li>
<li>Beukeboom, L. W., van de Zande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+sex+determination+in+the+haplodiploid+wasp+Nasonia+vitripennis+%28Hymenoptera%3A+Chalcidoidea%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea).</a> Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).</li>
<li>Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-history+traits+of+the+Whiting+polyploid+line+of+the+parasitoid%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+experimentalis+et+applicata%22%5BJournal%5D)">Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid.</a> Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).</li>
<li>Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+different+methods+for+dsrna+delivery+in+cotton+bollworm+%28Helicoverpa+armigera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera).</a> Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).</li>
<li>Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Tribolium+Deformed+ortholog+and+its+ability+to+directly+regulate+Deformed+target+genes+in+the+rescue+of+a+Drosophila+Deformed+null+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant.</a> Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).</li>
<li>Hughes, C. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+analysis+of+Deformed%2C+proboscipedia+and+Sex+combs+reduced+in+the+milkweed+bug+Oncopeltus+fasciatus%3A+novel+roles+for+Hox+genes+in+the+hemipteran+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head.</a> Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA+into+anesthetized+adult+Drosophila+triggers+RNA+interference+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system.</a> Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+gene-editing+in+the+malaria+mosquito+anopheles+stephensi+by+ReMOT+control%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control.</a> G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+in+the+silverleaf+whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Shirai, Y., Daimon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+cardinal+are+responsible+for+the+red-1+and+peach+eye+color+mutants+of+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).</li>
<li>Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAPC-assisted+CRISPR%2FCas9+system%3A+targeted+delivery+into+adult+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing+%28Arthropoda%3A+Hemiptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera).</a> bioRxiv. , 478743(2018).</li>
<li>Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+genetic+tools+to+control+ACP%5BTitle%5D)+AND+%22Citrus+Research+Board+Citrograph+Magazine%22%5BJournal%5D)">Developing genetic tools to control ACP.</a> Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).</li>
</ol>

JLR i DCR złożyły wniosek o tymczasową ochronę patentową na technologię ReMOT Control. O.S.A. jest założycielem Agragene, Inc., posiada udziały w kapitale zakładowym i zasiada w Naukowej Radzie Doradczej firmy. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Wraz z niedawnym zwiększonym wykorzystaniem Nasonia vitripennis jako organizmu modelowego dla różnych pytań biologicznych 2,3,7,17, istnieje potrzeba opracowania i optymalizacji metod iniekcji, aby umożliwić uproszczony i wydajny protokół analizy funkcjonalnej genów N. vitripennis. Obecne metody polegające na mikrowstrzykiwaniu embrionalnych odczynników do edycji genów są trud...

Edycja genów CRISPR/Cas9 to potężna technologia do funkcjonalnych badań genetycznych, szczególnie w wielu rozwijających się organizmach modelowych, takich jak osa biżuteryjna, Nasonia vitripennis. Łatwość hodowli i dostępność kompletnego genomu sprawiają, że osa biżuteryjna jest ważnym systemem eksperymentalnym do wyjaśniania mechanizmów molekularnych różnych procesów biologicznych. Na przykład, N. vitripennis został ostatnio wykorzystany do rozwikłania epigenetycznych podstaw haplodiploidalnego systemu determinacji płci1,2, biologia chromosomów B3,4,5,6, oraz genetyczne podstawy regulacji okołodobowej i sezonowej7,8. Niektóre z cech, które sprawiają, że N. vitripennis jest podatny do pracy, obejmują krótki czas generacji (~ 2 tygodnie w temperaturze 25 °C), wysokie wskaźniki reprodukcji, łatwą separację płci w stadium poczwarki oraz zdolność do diapauzy i przechowywania szczepów w temperaturze 4 °C. Cykl życiowy rozpoczyna się od samic os pasożytujących na poczwarkach plujki, Sarcophaga bullata. Za pośrednictwem pokładełka samice składają do 50 jaj w poczwarce muchówki. Z jaj rozwijają się larwy, które żywią się poczwarką S. bullata, rozwijają się przez kilka następnych dni, a następnie przepoczwarzają się, po czym następuje dorosły eklozja i wyłonienie się z poczwarki żywiciela9.
Narzędzia molekularne do przeprowadzania funkcjonalnych badań genetycznych u N. vitripennis, takie jak interferencja RNA (RNAi)10 i CRISPR/Cas911,12, są dostępne, ale są ograniczone, głównie z powodu trudności w wykonywaniu mikroiniekcji embrionalnych13. Ponieważ jaja N. vitripennis wymagają do rozwoju żywiciela poczwarkowego, manipulacja jajami jest bardzo trudna. Zarodki w stadium preblastoderm muszą zostać pobrane od poczwarki muchówki gospodarza, szybko wstrzyknięte mikroiniekcją i natychmiast przeniesione z powrotem do gospodarza w celu rozwoju13. Kroki te wymagają precyzji i specjalistycznego treningu, aby uniknąć uszkodzenia mikrowstrzykniętych zarodków lub gospodarzy poczwarki13. Co więcej, jaja są bardzo małe i kruche, zwłaszcza po mikroiniekcjach, z bardzo lepką cytoplazmą powodującą ciągłe zatykanie igły iniekcyjnej13. Cechy te sprawiają, że mikroiniekcje embrionalne są wyjątkowo trudne, wymagają wysoko wykwalifikowanych operatorów i specjalistycznego sprzętu, którego nie ma w większości laboratoriów N. vitripennis.
Optymalizacja alternatywnych metod iniekcji dla dostarczania odczynników CRISPR przyczyniłaby się do konsolidacji N. vitripennis jako organizmu modelowego. Manipulacja poczwarkami i dorosłymi osobnikami jest mniej trudna niż manipulowanie zarodkami i można ją wykonać za pomocą podstawowego zestawu do wstrzykiwań. W tym miejscu opisano dwa protokoły wstrzykiwania poczwarek i osobników dorosłych: jeden obejmujący specjalistyczny sprzęt do wstrzykiwań, a drugi polegający na użyciu zespołu rurki aspiratora wyposażonej w szklaną igłę kapilarną. Zastosowanie rurki aspiratora jest szczególnie przydatne w laboratoriach, które nie mają dostępu do specjalistycznego sprzętu do mikroiniekcji zarodków. Wykazano skuteczne iniekcje różnym etapom rozwojowym N. vitripennis, w tym białym lub czarnym poczwarkom i dorosłym osom. Osy w stadium białej poczwarki są szczególnie odpowiednie do eksperymentów z nokautem za pośrednictwem RNAi. Chociaż RNAi w Nasonia zostało po raz pierwszy opisane przez Lyncha i Desplana w 2006 roku10, nie ma dostępnej procedury wizualnej dotyczącej sposobu wykonywania iniekcji RNAi. RNAi został niedawno wykorzystany do odkrycia genu haploidyzatora chromosomu B PSR (Paternal Sex Ratio)3 oraz do zbadania udziału genu zegara, kropka, w rytmach biologicznych N. vitripennis 7.
Czarne poczwarki i dorosłe osy mogą być używane do indukowania edycji genów linii zarodkowej CRISPR/Cas9 za pomocą protokołów ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) i BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Te dwie metody dostarczania jajników zostały niedawno opisane jako skuteczne w Nasonia w generowaniu mutacji linii zarodkowej w genie docelowym, cinnabar7,12. W tym przypadku zapewniony jest uproszczony protokół dla zastrzyków, w tym procedura wizualna metodologii krok po kroku zarówno dla zastrzyków poczwarkowych, jak i dorosłych, które można wykorzystać do generowania funkcjonalnych badań genetycznych w Nasonia i prawdopodobnie u innych pasożytniczych os, bez konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu i omijania mikroiniekcji embrionalnych.

<table><tbody><tr><td>100 x 15 mm Szalki Petriego do układania w stosy, polistyren, mono, sterylne</td><td>Sigma</td><td>960-97693-083</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna ze szkła glinokrzemianowego 1 mm (średnica zewnętrzna) x 0,58 mm (średnica wewnętrzna)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Może również używać zespołów probówek aspiratora borokrzemianowego lub kwarcowego</td></tr><tr><td>do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>BAPC</td><td>phoreus biotech</td><td>BAPtofect-25 0,5 mg Zestaw</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Białko z NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Igła preparcyjna</td><td>VWR</td><td>10806-330</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana bez DNazy/RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Programowalny mikrowtryskiwacz Femtojet Express</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Końcówki do mikroładowarek</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel z cienką końcówką</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Poczwarki muchy mięsnej,&nbsp; Sarcophaga bullata</td><td>Ward's Science</td><td>470180-392</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik</td><td></td><td></td><td></td>spożywczy</tr><tr><td>Szklane probówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>Klej</td><td>Zmywalny, nietoksyczny</td><td></td> klej szkolny <td>Elmera</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td> Szkiełka mikroskopowe <td>P-1000 lub P-2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr></tbody></table>

zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów rnai i crispr w nosonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Osa klejnotowa, Nasonia vitripennis, stała się efektywnym modelowym systemem do badania epigenetyki haplo-diploidalnej determinacji płci, biologii chromosomu B, interakcji gospodarz-symbiont, specjacji i syntezy jadu. Pomimo dostępności kilku narzędzi molekularnych, w tym CRISPR/Cas9, badania genetyki funkcjonalnej w tym organizmie są nadal ograniczone. Główne ograniczenie w stosowaniu technologii CRISPR/Cas9 u N. vitripennis wynika z wyzwań związanych z mikroiniekcjami embrionalnymi. Wstrzykiwanie zarodków jest szczególnie trudne w tym organizmie i ogólnie u wielu os pasożytniczych, ze względu na mały rozmiar zarodka i konieczność posiadania poczwarki gospodarza do rozwoju embrionalnego. Aby sprostać tym wyzwaniom, zoptymalizowano dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 do jajników samic za pomocą iniekcji dla dorosłych, a nie mikroiniekcji embrionalnej, co doprowadziło zarówno do somatycznych, jak i dziedzicznych zmian w linii zarodkowej. Procedury iniekcji zostały zoptymalizowane u poczwarek i samic os przy użyciu ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) lub BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Wykazano, że metody te są skuteczną alternatywą dla iniekcji zarodków, umożliwiając specyficzne dla miejsca i dziedziczne mutacje linii zarodkowej.

Ten artykuł przedstawia dwie proste metody mikroiniekcji poczwarki i dorosłego osobnika, przy użyciu rurki do wstrzykiwania femtojet lub aspiratora. Pierwsza metoda pozwala na bardziej precyzyjne wstrzykiwanie płynu, co jest istotne dla konsystencji RNAi, natomiast druga pozwala na wstrzykiwanie większych ilości płynu do poczwarek Nasonia lub osobników dorosłych.
Reprezentatywne wyniki przedstawione w Tabeli 1</...

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Badania nad niekanonicznym modelem owadów, takich jak osa parazytoidowa, są ograniczone, ponieważ mikroiniekcja embrionalna jest bardzo trudna. Nasza metoda omija ten problem, umożliwiając specyficzne dla miejsca i dziedziczne mutacje linii zarodkowej. Wstrzykiwanie poczwarek lub dorosłych samic jest szybkie i eliminuje konieczność stosowania drogiego sprzętu lub specjalistycznego szkolenia wymaganego do osiągnięcia udanych mikroiniekcji embrionalnych.Technika ta nie pozwoli żadnym specjalistycznym laboratoriom, które nie mają dostępu do drogiego sprzętu, na przeprowadzenie badań funkcjonalnych na dowolnym gatunku owadów, którego używają jako modelu. Po optymalizacji metoda ta może być wykorzystana do badania genetyki funkcjonalnej wielu innych genów w Nasonii. Uważamy również, że ta metoda może być wykorzystana do dostarczania kwasów nukleinowych do transformacji genetycznej Nasonii lub innych owadów.Zacznij od ustawienia około 20 pokrytych samic pojedynczo w małych szklanych probówkach zatkanych bawełną. Dodaj dwóch żywicieli S.bullata na probówkę i utrzymuj osy w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 30% z cyklem światła i ciemności 12:12 przez dwa do trzech d

pupal-adult-injections-for-rnai-crispr-gene-editing-nasonia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W organizmach modelowych transgeneza pozwala na manipulowanie funkcjami genów, podczas gdy RNAi umożliwia wyciszenie specyficznych transkryptów mRNA 1-2. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie technik niezbędnych do wprowadzenia stabilnie dziedziczonego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus na potrzeby badań w dziedzinie biologii ewolucyjnej, rozwojowej i behawioralnej.

Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Naucz się technik zastrzyków u poczwarek i dorosłych osobników Nasonia vitripennis do edycji genów RNAi i CRISPR. Ta metoda umożliwia funkcjonalne badania genetyczne bez konieczności mikroiniekcji embriogenicznych.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

Przeglądaj więcej filmów