Name: Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę przezźrenicowego dwufotonowego obrazowania siatkówki myszy in vivo. Technika ta umożliwia badanie funkcji komórek siatkówki oraz mechanizmów chorób oczu w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Research to Prevent Blindness (Nagroda za Rozwój Kariery dla P.R.W. oraz nieograniczony grant dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych w Washington University School of Medicine w St. Louis), National Glaucoma Research (program Fundacji BrightFocus) oraz McDonnell Center for Cellular and Molecular Neurobiology. Z.W. jest wspierany przez Institutional National Research Service Award T32 EY013360. Prace te były również wspierane przez Hope Center Viral Vectors Core w Washington University School of Medicine.

<ol><li>Smith, C. A., Chauhan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+adeno-associated+viral+vector+labelled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1490(2018).</li>
<li>Liu, H., Ding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+experimental+glaucoma+animal+model%3A+A+comparison+of+microbead+injection+with+or+without+hydroxypropyl+methylcellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishment of an experimental glaucoma animal model: A comparison of microbead injection with or without hydroxypropyl methylcellulose.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (3), 1953-1960 (2017).</li>
<li>Chauhan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+imaging+of+retinal+ganglion+cells+and+retinal+thickness+changes+following+optic+nerve+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo imaging of retinal ganglion cells and retinal thickness changes following optic nerve injury in mice.</a> PLoS One. 7 (6), 40352(2012).</li>
<li>Leung, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+profile+of+retinal+ganglion+cell+damage+after+optic+nerve+crush+with+blue-light+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4898-4902 (2008).</li>
<li>Murata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+retinal+ganglion+cells+and+their+loss+in+vivo+by+a+fundus+camera+in+the+normal+and+ischemia-reperfusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse retinal ganglion cells and their loss in vivo by a fundus camera in the normal and ischemia-reperfusion model.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (12), 5546-5552 (2008).</li>
<li>Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+retinal+microglial+activation+during+neurodegeneration%3A+confocal+ophthalmoscopic+imaging+and+cell+morphometry+in+mouse+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52731(2015).</li>
<li>Bremer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Intravital+Imaging+of+the+Retina+Reveals+Long-term+Dynamics+of+Immune+Infiltration+and+Its+Effects+on+the+Glial+Network+in+Experimental+Autoimmune+Uveoretinitis%2C+without+Evident+Signs+of+Neuronal+Dysfunction+in+the+Ganglion+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Intravital Imaging of the Retina Reveals Long-term Dynamics of Immune Infiltration and Its Effects on the Glial Network in Experimental Autoimmune Uveoretinitis, without Evident Signs of Neuronal Dysfunction in the Ganglion Cell Layer.</a> Frontiers in Immunology. 7, 642(2016).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+two-photon+microscopy+enables+near-diffraction-limited+and+functional+retinal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo.</a> Light: Science & Applications. 9, 79(2020).</li>
<li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li>
<li>Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+cells+in+the+living+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging single cells in the living retina.</a> Vision Research. 51 (13), 1379-1396 (2011).</li>
<li>Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+photoreceptor+loss+revealed+with+adaptive+optics%3A+an+alternate+cause+of+color+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics: an alternate cause of color blindness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (22), 8461-8466 (2004).</li>
<li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retinal+mosaics+in+the+living+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Imaging retinal mosaics in the living eye.</a> Eye. 25 (3), 301-308 (2011).</li>
<li>Rossi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+retinal+pigment+epithelium+cells+in+age+related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of retinal pigment epithelium cells in age related macular degeneration.</a> Biomedical Optics Express. 4 (11), 2527-2539 (2013).</li>
<li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+retinal+imaging+in+the+living+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics retinal imaging in the living mouse eye.</a> Biomedical Optics Express. 3 (4), 715-734 (2012).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Takeda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+non-cell-autonomous+cell+death+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells.</a> Glia. 66 (11), 2366-2384 (2018).</li>
<li>Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract-preventing+contact+lens+for+in+vivo+imaging+of+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina.</a> Biotechniques. 65 (2), 101-104 (2018).</li>
<li>Palczewska, G., Kern, T. S., Palczewski, K. Noninvasive two-photon microscopy imaging of mouse retina and retinal pigment epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalczewska%2C+G+%22Retinal+Degeneration.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Retinal Degeneration. Methods in Molecular Biology</a>. Weber, B. H. F., Langmann, T. 1834, Humana. New York, NY, USA. 333-343 (2019).</li>
<li>Wahl, D. J., Jian, Y., Bonora, S., Zawadzki, R. J., Sarunic, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavefront+sensorless+adaptive+optics+fluorescence+biomicroscope+for+in+vivo+retinal+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Wavefront sensorless adaptive optics fluorescence biomicroscope for in vivo retinal imaging in mice.</a> Biomedical Optics Express. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53030(2015).</li>
<li>Biss, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescent+imaging+of+the+mouse+retina+using+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescent imaging of the mouse retina using adaptive optics.</a> Optics Letters. 32 (6), 659-661 (2007).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+laser-induced+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A mouse model for laser-induced choroidal neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).</li>
<li>Palczewska, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+infrared+vision+is+triggered+by+two-photon+chromophore+isomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human infrared vision is triggered by two-photon chromophore isomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 5445-5454 (2014).</li>
<li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive-European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pflügers Archive-European Journal of Physiology. 457 (6), 1393-1414 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevating+Growth+Factor+Responsiveness+and+Axon+Regeneration+by+Modulating+Presynaptic+Inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Elevating Growth Factor Responsiveness and Axon Regeneration by Modulating Presynaptic Inputs.</a> Neuron. 103 (1), 39-51 (2019).</li>
<li>Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transgenic+mouse+lines+expressing+Cre+recombinase+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina.</a> Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).</li>
<li>Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axons+and+dendrites+originate+from+neuroepithelial-like+processes+of+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells.</a> Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+Cre-recombinase+specifically+in+M-+or+S-cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing Cre-recombinase specifically in M- or S-cone photoreceptors.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (1), 42-47 (2004).</li>
<li>Brightman, D. S., Razafsky, D., Potter, C., Hodzic, D., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrl-Cre+transgenic+mouse+mediates+loxP+recombination+in+developing+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Nrl-Cre transgenic mouse mediates loxP recombination in developing rod photoreceptors.</a> Genesis. 54 (3), 129-135 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy%3A+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).</li>
<li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-expressing+retinal+ganglion-cell+photoreceptors%3A+cellular+diversity+and+role+in+pattern+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li>
<li>Kim, I. J., Zhang, Y., Yamagata, M., Meister, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452 (7186), 478-482 (2008).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> Journal of Neurophysiology. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Zhu, Y., Xu, J., Hauswirth, W. W., DeVries, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+binary+labeling+of+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted binary labeling of retinal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 34 (23), 7845-7861 (2014).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+transduction+and+targeting+of+retinal+bipolar+cells+with+improved+mGluR6+promoters+in+rodents+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated transduction and targeting of retinal bipolar cells with improved mGluR6 promoters in rodents and primates.</a> Gene Therapy. 23 (8-9), 680-689 (2016).</li>
<li>Surace, E. M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+AAV+vectors+for+retinal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer.</a> Vision Research. 48 (3), 353-359 (2008).</li>
<li>Yao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+proliferation+and+neurogenic+potential+of+Muller+glial+cells+via+a+Lin28%2Flet-7+miRNA-dependent+pathway+in+adult+mammalian+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates proliferation and neurogenic potential of Muller glial cells via a Lin28/let-7 miRNA-dependent pathway in adult mammalian retinas.</a> Cell Reports. 17 (1), 165-178 (2016).</li>
<li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recoverable+state+of+axon+injury+persists+for+hours+after+spinal+cord+contusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A recoverable state of axon injury persists for hours after spinal cord contusion in vivo.</a> Nature Communications. 5, 5683(2014).</li>
<li>Cheung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+network+alterations+in+the+retina+of+patients+with+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Microvascular network alterations in the retina of patients with Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's & Dementia. 10 (2), 135-142 (2014).</li>
<li>Kerrison, J. B., Flynn, T., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+pathologic+changes+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Retinal pathologic changes in multiple sclerosis.</a> Retina. 14 (5), 445-451 (1994).</li>
<li>Sung, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+retinal+thinning+as+a+biomarker+for+cognitive+impairment+in+de+novo+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inner retinal thinning as a biomarker for cognitive impairment in de novo Parkinson's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11832(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w niniejszym dokumencie procedura obrazowania dwufotonowego umożliwia podłużne obrazowanie in vivo siatkówki myszy. Powtarzalne obrazy tego samego obszaru siatkówki można uzyskać przez ciągły okres do 6 lub więcej godzin przy izofluranie. Mysz można również obrazować w różnych dniach za pomocą komórkowych i naczyniowych punktów orientacyjnych w celu zlokalizowania tego samego obszaru obrazowania (ryc. 3). Zastosowanie w tym celu przezroczystego żelu zanurzeniowego w połączeniu ze szkłem nakrywkowym było wcześniej stosowane w wielu procedurach, w tym w wizualizacji siatkówki do iniekcji podsiatkówkowej, modelach uszkodzeń siatkówki wywołanych laserem i obrazowaniu dna oka 20,21,22.
Anatomia oka stanowi wyjątkowe wyzwanie dla obrazowania in vivo, ponieważ wysoka moc optyczna rogówki i soczewki myszy utrudnia bezpośrednie obrazowanie przez źrenicę bez korekcji. Kilka innych metod obrazowania in vivo opiera się na użyciu płaskio-wklęsłej soczewki kontaktowej do korekcji przedniej optyki oka myszy 7,17,18,19. Przy tylko korekcji optycznej na rogówce, wysoka moc optyczna soczewki myszy powoduje nieuniknioną ilość paralaksy, szczególnie struktur w polu skanowania obwodowego, objawiający się jako rozciąganie i ruch translacyjny w wymiarze X-Y na różnych płaszczyznach Z. Aby zminimalizować zniekształcenia związane z paralaksą obrazu w wymiarach X i Y, ważne jest, aby oko myszy było zorientowane w taki sposób, aby płaszczyzna styczna do siatkówki w obszarze obrazowania była prostopadła do ścieżki światła mikroskopu. Opisana tutaj konfiguracja sprzyja precyzyjnej manipulacji kątem oka w celu uzyskania tego wyrównania. Regulowany uchwyt na głowicę myszy, który umożliwia obrót wzdłuż dwóch osi, pozwala na łatwą ręczną regulację kąta oka, gdy eksperymentator przewija wymiar Z, aby zminimalizować paralaksę. To nachylenie omija również efekt zatrzymania pola źrenicy, aby umożliwić obrazowanie większych obszarów siatkówki. Ograniczenie uchwytu na głowę znacznie zmniejsza również artefakty ruchowe spowodowane oddychaniem.
Należy zachować ostrożność, aby zachować przejrzystość oka myszy, ponieważ jakość obrazu pogarsza się wraz z zmętnieniem podczas ciągłego obrazowania. Częste ponowne nakładanie lubrykantu w żelu podczas obrazowania oraz nakładanie maści po każdej sesji obrazowania pomaga zapobiegać wysuszeniu oka i powstawaniu zmętnień. Niektóre zmętnienia rogówki ustępują samoistnie po 24-48 godzinach. Zastosowanie przezroczystego żelu i szkła nakrokowego, jak opisano w niniejszym protokole, zapewnia podobną jakość obrazu i korekcję aberracji jak soczewki kontaktowe7, umożliwiając jednocześnie łatwiejszą regulację kąta widzenia bez konieczności ponownego ustawiania szkła nakrywkowego. Dodatkowo żel zapewnia ciągłe nawilżenie oka, dzięki czemu możliwe jest wykonywanie ostrych sesji obrazowania trwających nawet do kilku godzin. Wreszcie, ponieważ szkło nakrywkowe nie styka się z rogówką, powoduje minimalne podrażnienie oka, co może zmniejszyć przejrzystość optyczną przy powtórnych sesjach obrazowania.
Ograniczeniem tego podejścia jest fakt, że aberracje optyczne nie są w pełni korygowane. Chociaż znacznie zmniejsza to rozdzielczość osiową ze względu na dużą paralaksę, ilościowe pomiary somy można uzyskać w płaszczyznach pojedynczego obrazu. Należy zauważyć, że ponieważ intensywność sygnału fluorescencji neuronów siatkówki zależy od wyrównania próbki tą metodą, czujniki oparte na wskaźnikach wskaźnika wzbudzenia i emisji są bardziej odpowiednie do eksperymentów porównujących próbki przewlekle w różnych sesjach obrazowania. Podejściem do korekcji aberracji optycznych na poziomie systemu jest optyka adaptatywna, która pozwala na subkomórkową rozdzielczość w siatkówce 8,9,14,21. Jednak optyka adaptatywna wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu i rozległej wiedzy specjalistycznej do wdrożenia.
Alternatywnymi podejściami do dwufotonowego obrazowania siatkówki in vivo są mikroskopia konfokalna lub oftalmoskopia6. Przedstawione tutaj podejście powinno być łatwe do przełożenia na mikroskopię szerokokątną lub konfokalną. Obrazowanie pojedynczych fotonów jest być może bardziej niezawodne i stwarza mniejsze ryzyko uszkodzenia siatkówki ze względu na wysoką energię lasera dwufotonowego, niezbędną do uzyskania skutecznego efektu dwufotonowego przez rogówkę i soczewkę oka. Aby uniknąć uszkodzenia lasera dwufotonowego, próg maksymalnej mocy lasera powinien być empirycznie określony poprzez badanie całych siatkówk po zakończeniu eksperymentów obrazowych i barwieniu immunologicznym dla typów komórek w obrazowanych warstwach. W prezentowanym tutaj systemie RGC były oznaczane markerem pan-RGC, Rbpms, a gęstości były normalne do 45 mW mocy obrazowania, podczas gdy 55 mW powodowało znaczną utratę RGC (nie pokazano).
Wadą obrazowania pojedynczych fotonów jest fakt, że takie podejście będzie bardzo mocno stymulować natywne obwody wzrokowe siatkówki w porównaniu do obrazowania dwufotonowego23. Wcześniejsze eksperymenty z użyciem całych wierzchowców siatkówki lub preparatów muszli ocznych wykazały, że dwufotonowe skanowanie laserowe wywołuje aktywację obwodu, która jest w dużej mierzeprzejściowa. W tym przypadku obrazowanie aktywności RGC za pomocą czujnika Ca2+ Twitch2b pokazuje, że początek skanowania laserowego indukuje wzrost Ca2 + , który powraca do wartości wyjściowej w ciągu 5-20 s w większości RGC (Figura 8). Biorąc pod uwagę, że moc lasera w tym protokole mieści się w zakresie poprzednich eksperymentów opisujących reakcję na światło siatkówki in vivo8, obecnie opisana metoda jest prawdopodobnie podatna na zapisy aktywności obwodów w siatkówce. Takie rozważania są ważne w przypadku eksperymentów, na które może mieć wpływ aktywność obwodu.
Protokół ten demonstruje obrazowanie in vivo dwóch typów neuronów siatkówki, RGC i komórek amakrynowych. Podobne znakowanie można osiągnąć innym głównym typom komórek, w tym komórkom poziomym (Cx57-Cre25), komórkom dwubiegunowym (Chx10-Cre26; mGluR6-GFP27), fotoreceptorom czopków (S- lub M-opsyn-Cre28), fotoreceptorom pręcikowym (Nrl-Cre29), glejowi Müllera (Foxg1-Cre26) i perycytom (NG2-DsRed9). Myszy transgeniczne są również dostępne do znakowania dyskretnych podzbiorów RGC (np. KCNG4-Cre dla αRGCs30; OPN4-Cre dla ipRGC31; JAM-B-CreER dla J-RGC32) i komórek amakrynowych (np. ChAT-Cre dla komórek amakrynowychgwiazdotwórczych 26 i sterowniki promotora neuropeptydu dla różnych podtypów komórek amakrynowych 3,34). Wektory wirusowe mogą być używane do celowania w określone populacje komórek zamiast myszy transgenicznych. Wstrzyknięcia doszklistkowe AAV2 z wszechobecnym elementem promotorowym CAG oznaczają prawie wyłącznie RGC, komórki amakrynowe i komórki poziome25. Połączenie zmodyfikowanego kapsydu AAV2.7m8-Y444F z zaprojektowanym konstrukcją promotora mGluR6 pozwala na szerokie znakowanie komórek bipolarnych ON35. Iniekcje podsiatkówkowe AAV prowadzą do wzbogacenia fotoreceptorów, przy czym serotyp AAV2/5 ma najwyższą skuteczność transdukcji36. Shh10, zmodyfikowane białko kapsydu AAV6 w połączeniu z fibrylarnymi elementami promotora białka glejowego wykazano specyficzne dla gleju Müllera37.
Możliwość obserwacji komórek w ośrodkowym układzie nerwowym z całkowicie nieinwazyjnym podejściem może być wykorzystana do badania zarówno podstawowych właściwości obwodów nerwowych8, jak i mechanizmów neurodegeneracji 3,4,5,6,38. Wiele chorób powodujących ślepotę atakuje populacje komórkowe siatkówki, a metody obrazowania in vivo u myszy zastosowano do badania uszkodzenia nerwu wzrokowego 1,3,4, zwyrodnienia plamki żółtej13, udaru5, jaskry 2,6 i zapalenia błony naczyniowej oka7. Ponadto wiele schorzeń neurodegeneracyjnych ośrodkowego układu nerwowego objawia się w siatkówce, w tym choroba Alzheimera39, stwardnienie rozsiane40 i choroba Parkinsona41. Dlatego ta łatwo dostępna technika obrazowania siatkówki in vivo może być stosowana jako narzędzie do badania szerokiego zestawu schorzeń neurodegeneracyjnych.

Wizualizacja in vivo ośrodkowego układu nerwowego zazwyczaj wymaga inwazyjnych procedur, takich jak przerzedzenie czaszki i instalacja szklanych okien lub optycznych soczewek przekaźnikowych. Siatkówka jest jedyną strukturą w układzie nerwowym, którą można bezpośrednio obserwować bez konieczności inwazyjnego przygotowania, ponieważ natywnie odbiera światło z otoczenia. Łatwość optycznego dostępu do siatkówki sprawia, że jest to atrakcyjny system modelowy do badania ośrodkowego układu nerwowego.
Obrazowanie fluorescencyjne siatkówki na żywo u myszy zostało wykorzystane do śledzenia zgonu RGC w modelach jaskry1,2, uszkodzenie nerwu wzrokowego1,3,4, and stroke5, a także zmiany w aktywacji mikrogleju6,7,8 i vasculature9 w stanach zwyrodnieniowych. Sygnały wewnętrzne mogą być również wykorzystywane do wizualizacji fotoreceptorów10,11,12 i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki13. Wiele podejść do obrazowania siatkówki in vivo wykorzystuje albo wysoce specjalistyczne urządzenia zaprojektowane specjalnie do celów okulistycznych6, albo wysoce zmodyfikowane systemy optyczne w celu skorygowania natywnych aberracji rogówki i soczewki8,9,11,12,13,14.
Obecny protokół demonstruje podejście do obrazowania in vivo sygnałów fluorescencyjnych w siatkówce w rozdzielczości komórkowej, wykorzystując podstawową metodę częściowej korekcji przedniej optyki oka myszy. Strategia ta wymaga bardzo niewielkich adaptacji do ustawień mikroskopów wielofotonowych, które są powszechnie stosowane do obrazowania mózgu in vivo. Ponieważ to podejście jest proste do skonfigurowania, a myszy są pod wpływem niewielkiego stresu, sprzyja ono wykonywaniu eksperymentów poklatkowych zarówno w ostrym, jak i przewlekłym czasie. Ponadto procedury oparte na barwnikach genetycznych i organicznych, które znakują poszczególne składniki siatkówki, w tym RGC, komórki amakrynowe, mikroglej i naczynia krwionośne, są kompatybilne z tą techniką obrazowania i umożliwiają obserwację in vivo typów komórek i struktur krytycznych dla funkcji siatkówki. Narzędzia te można dostosować do oznaczania większości innych typów komórek neuronalnych, a także glejowych i naczyniowych składników siatkówki.

<table><tbody><tr><td>#1.5 szkiełko nakrywkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>152440</td><td>Richard-Allan #1.5 Szklana</td></tr><tr><td>strzykawka</td><td>24</td> mm x 40 mm 50 ml Hamilton <td>80950</td><td>Igła cementowana 22G</td></tr><tr><td>Wirus związany z adenowirusem (AAV2)</td><td>Hope Center Viral Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anestezjologiczna pompa powietrza</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-30</td><td></td></tr><tr><td>Atropine</td><td>Sigma</td><td>A0132</td><td>Dla ucznia roztwór rozszerzacza</td></tr><tr><td>Podstawowe urządzenie do znieczulenia małych zwierząt</td><td>RWD Life Science</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter</td><td>B150-86-10</td><td>Średnica zewnętrzna 1,50 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm, długość 10 cm</td></tr><tr><td>Kostka filtra CFP/YFP</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>480/40, 505 long pass, 535/30</td></tr><tr><td>ChromoFlex - Dwukanałowa jednostka detekcyjna PMT</td><td>Scientifica</td><td>S-MPLG-1002</td><td></td></tr><tr><td>Obiegowa pompa ciepła</td><td>Braintree Scientific</td><td>tp-700</td><td>Ustawiona na 37 & deg; C</td></tr><tr><td>Folia spożywcza</td><td>VWR</td><td>10713-916</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy uchwyt filtra</td><td>ThorLabs</td><td>DH1</td><td>Trzyma szkiełko nakrywkowe nad okiem myszy</td></tr><tr><td>transgenicznych myszy Cx3cr1-GFP (B6.129P2(CG)-Cx3cr1tm1Litt/J)</td><td>Obudowa kontrolera DAQ Jackson Laboratory</td><td>005582</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PXIe-1073</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do akwizycji danych</td><td>National Instrumenty</td><td>BNC-2090A</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue dye</td><td>Fisher Scientific AAA1677409</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moduł FPGA z digitizerem</td><td>National Instruments</td><td>NI-5734</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do ewakuacji gazu</td><td>RWD Life Science</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Silnie smarowany żel do oczu&nbsp; &nbsp;</td><td>Alcon</td> <td>(z lokalnej apteki)</td><td>Do użytku podczas obrazowania</td></tr><tr><td>GFP/Czerwona kostka filtra</td><td>Chroma</td><td>custom</td><td>535/30, 560 long pass, 605/70</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>McKesson Medical and Surgical</td><td>190147</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Launch Optics do użytku z Pockels Cell</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-101080</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope Moduł główny</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100466</td><td></td></tr><tr><td>Ścieżka skanowania HyperScope</td><td>Scientifica</td><td>S-MP-100406</td><td></td></tr><tr><td>HyperScope X galvo Module</td><td>Scientifica</td><td>MP-100443</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fidżi oprogramowanie</td><td></td><td>Freeware</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Kanister filtra izofluranu (aktywne oczyszczanie)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31</td><td></td></tr><tr><td>Kanister z filtrem gazowym izofluranu (pasywne oczyszczanie)</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-31S</td><td></td></tr><tr><td>ketamina HCl (100 mg / mL)</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Adapter M32 do M26</td><td>ThorLabs</td><td>M32M26S</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MaiTai GUI</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB oprogramowanie</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>R2015b</td></tr><tr><td>meloksykam (5 mg/ml)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>NDC 0010-6013-01</td> Mikorskop <td>przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Edmund Optics</td><td>46-404</td> Ściągacz do mikropipet <td>Mitutoyo WE715042319</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>Flaming/Brown Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Fisher</td><td>BP2629-1</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk hemostatyczny mini buldoga</td><td>Fine Science Tools</td><td>18053-28</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowa rurka EVA 0,02 "ID, 0,06" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T1</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowa rurka EVA 0,05 "ID, 0,09" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>1883T4</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na głowę myszy</td><td>Narishige</td><td>SGM-4</td><td></td></tr><tr><td>nr 5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Słupki optyczne 1/2"</td> <td>ThorLabs</td><td>TR3-P5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miernika mocy optycznej</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>pE-300 Ultra LLG Deivery</td><td>Scientifica</td><td>COO-LED3ULLGs</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek fenylefryny</td><td>Sigma</td><td>P6126</td><td>Do roztworu rozszerzacza źrenicy</td></tr><tr><td>Ogniwo Pockelsa</td><td>Conoptics</td><td>350-80-02</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz ogniw Pockels</td><td>Conoptics</td><td>Model 302RM</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek proparakainy</td><td>Sigma</td><td>1571001</td><td>Do unieruchamiania oczu</td></tr><tr><td>Red & Filtr krótkoprzepustowy Far Red Cube</td><td>Chroma</td><td>niestandardowy</td><td>560</td></tr><tr><td>Obrotowy zacisk słupkowy 1/2"</td> Pakiet <td>ThorLabs</td><td>SWC</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio Technologies</td><td>Freeware</td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazów; Wersja 5.4.0 (2018); wymaga</td></tr><tr><td>roztworu chlorku sodu MATLAB, sterylnego (0,9%)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC 63323-186-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>S9 E</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Oxford</td><td>Benchmate C8</td><td></td></tr><tr><td>Terramycyna oksytetracyklina/polimyksyna B antybiotyk maść okulistyczna</td><td>Zoetisus</td><td>NA</td><td>Do stosowania po wstrzyknięciu</td></tr> <tr><td>do ciała szklistegoSystem chłodzenia ThermoRack</td><td>Systemy chłodzenia półprzewodnikowe</td><td>ThermoRack 401</td><td>Zestaw 20 & deg; C</td></tr><tr><td>Ultraszybki laser Ti:Szafirowy</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Myszy transgeniczne Vgat-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)</td>Myszy transgeniczne <td>Jackson Laboratory</td><td>016962</td><td></td></tr><tr><td>VGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>016963</td><td></td></tr><tr><td>VivoScope do obrazowania In Vivo</td><td>Scientifica</td><td>S-MPVS-1200-00P</td><td></td></tr><tr><td>Biała maść do oczu z olejem wazelinowo-mineralnym</td><td>Jęcz</td><td>NA</td><td>Do stosowania po obrazowaniu</td></tr><tr><td>ksylazyny HCl (20 mg/mL)</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Siatkówka przekształca sygnały świetlne z otoczenia w sygnały elektryczne, które są przekazywane do mózgu. Choroby siatkówki są powszechne i powodują upośledzenie wzroku i ślepotę. Zrozumienie, w jaki sposób takie choroby postępują, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych metod leczenia. Mikroskopia in vivo w zwierzęcych modelach chorób jest potężnym narzędziem do zrozumienia neurodegeneracji i doprowadziła do ważnego postępu w leczeniu różnych schorzeń, od choroby Alzheimera po udar mózgu. Biorąc pod uwagę, że siatkówka jest jedyną strukturą ośrodkowego układu nerwowego, która jest z natury dostępna za pomocą metod optycznych, w naturalny sposób nadaje się do obrazowania in vivo. Jednak natywna optyka soczewki i rogówki stanowi pewne wyzwanie dla skutecznego dostępu do obrazowania.
Ten protokół przedstawia metody obrazowania in vivo dwufotonowych kohort i struktur komórkowych w siatkówce myszy w rozdzielczości komórkowej, mające zastosowanie zarówno w eksperymentach z obrazowaniem ostrym, jak i przewlekłym. Przedstawiono przykłady obrazowania komórek zwojowych siatkówki (RGC), komórek amakrynowych, mikrogleju i naczyń krwionośnych przy użyciu zestawu technik znakowania, w tym wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV), myszy transgenicznych i barwników nieorganicznych. Co ważne, techniki te obejmują wszystkie typy komórek siatkówki i opisano sugerowane metody dostępu do innych interesujących populacji komórkowych. Szczegółowo opisano również przykładowe strategie ręcznego przetwarzania obrazu w celu wyświetlenia i kwantyfikacji. Techniki te mają bezpośrednie zastosowanie w badaniach nad funkcją siatkówki w zdrowiu i chorobie.

Różnorodne podejścia z wykorzystaniem transgenów, wektorów wirusowych lub barwników nieorganicznych mogą być stosowane do specyficznej wizualizacji kilku typów komórek i struktur siatkówki in vivo przy użyciu prostej adaptacji podstawowego mikroskopu wielofotonowego. Aby zwizualizować RGC oraz komórki amakrynowe, myszom transgenicznym VGlut2-Cre i VGat-Cre, odpowiednio, podano do ciała szklistego wstrzyknięcie zależnego od Cre konstruktu ekspresyjnego AAV kodującego Twitch2b – cytoplazmatyczny sensor Ca2+ oparty na transferze energii między fluorescencyjnymi donorami (FRET), który zawiera cyjanowe i żółte białka fluorescencyjne (odpowiednio CFP i YFP) oraz domenę wiążącą Ca2+ troponiny15. U myszy VGlut2-Cre ciała komórek RGC są wyraźnie rozróżnialne, a często widoczne są również pęczki aksonów (Rysunek 3).
Należy zauważyć, że przebieg aksonów oraz negatywny obraz naczyń krwionośnych sprawiają, że identyfikacja tarczy nerwu wzrokowego u myszy VGlut2-Cre jest bardzo prosta, co jest przydatne jako punkt orientacyjny w eksperymentach z obrazowaniem chronicznym (Rycina 3). Chociaż komórki amakrynowe wydają się mniej jasne niż RGC, co wynika prawdopodobnie z mniejszego rozmiaru ich somy i/lub mniej wydajnej transdukcji AAV, ich somy są nadal wyraźnie widoczne w wewnętrznej warstwie jądrowej. W przeciwieństwie do RGC, neuryty komórek amakrynowych są częściej obserwowane w wewnętrznych warstwach splotowych (Rycina 4). Mikroglej siatkówki można obrazować w linii transgenicznej myszy Cx3cr1-GFP6. Mikroglej wiąże się z naczyniami krwionośnymi, co umożliwia odnalezienie tego samego obszaru w eksperymentach z obrazowaniem time-lapse.
Podejście to można wykorzystać do śledzenia dynamiki cienkich wypustek mikrogleju, co zapewnia lepszą rozdzielczość przestrzenną w obrazach pojedynczych płaszczyzn lub w przypadku przygotowania projekcji maksymalnej intensywności skoncentrowanych na pojedynczych komórkach (Rycina 5). Słaba rozdzielczość osiowa spowodowana aberracją optyczną przez soczewkę myszy uniemożliwia badanie szczegółów w wymiarze z. Aby sprawdzić, czy ta technika obrazowania pozwala na obserwację zmian degeneracyjnych w ultrastrukturze komórkowej, do ciała szklistego wstrzyknięto 1 µL 50 mM N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) w celu wywołania uszkodzenia ekscytotoksycznego. Jeden dzień po iniekcji mikroglej wykazywał krótkie wypustki lub morfologię ameboidalną (Rycina 5), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16. Należy zauważyć, że komórki w linii transgenicznej Cx3cr1-GFP wykazywały bardziej jednorodną i kompletną ekspresję białka fluorescencyjnego w całej kohorcie komórkowej niż w eksperymentach z dostarczeniem kaset ekspresyjnych białka fluorescencyjnego za pomocą AAV. Projektując eksperymenty, należy rozważyć zalety zróżnicowanego i rzadkiego w stosunku do kompletnego i jednorodnego znakowania.
Aby oznakować naczynia siatkówki zgodnie z wcześniejszym opisem8, myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 200 µL barwnika Evans blue (20 mg/mL w soli fizjologicznej) na 30-60 min przed obrazowaniem. Doprowadziło to do silnego oznakowania naczyń krwionośnych wychodzących z tarczy nerwu wzrokowego (Rysunek 6). Co zaskakujące, sygnał fluorescencyjny po pojedynczej iniekcji utrzymywał się przez co najmniej siedem dni. Do oszacowania wymiarów obrazów in vivo zastosowano dwie odrębne metody. Po pierwsze, te same obszary siatkówki obrazowano in vivo oraz po utrwaleniu w płaskich preparatach całej siatkówki (whole-mount) przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Rysunek 7). Z czterech różnych próbek in vivo wybrano losowe pary komórek, a rzeczywistą odległość między nimi zmierzono w skanach konfokalnych i zestawiono z odległością w pikselach in vivo, co pozwoliło uzyskać średnią wielkość piksela 0,99 µm przy 1x powiększeniu cyfrowym. Zastosowanie podobnych metod korelacji obrazów in vivo ze skanami konfokalnymi preparatów whole-mount wykazało, że jedna pozycja głowy umożliwia obrazowanie obszaru siatkówki o powierzchni około 650 mm2.
Zmiana położenia uchwytu głowy wzdłuż jednej osi torsyjnej umożliwia dostęp do liniowego obszaru siatkówki o długości 2,2 mm (nie pokazano). Ponadto, do oczu myszy wstrzyknięto mikrosfery fluorescencyjne o średnicy 1 lub 2 µm, a ich średnicę zmierzono jako pełną szerokość połówki maksimum (FWHM) skanów liniowych z obrazów in vivo przy 10-krotnym powiększeniu cyfrowym. Przyniosło to nieco większą szacunkową wielkość piksela, lecz z większą wariancją (Rysunek 7). Ogólnie obrazowanie konfokalne próbek całych organów po zakończeniu eksperymentów in vivo jest najbardziej spójną metodą przypisywania skali do poszczególnych obrazów, ponieważ różnice we właściwościach rogówki i soczewki mogą zmieniać skalę obrazu w zależności od próbki.
<img alt="Schemat mikroskopii dwufotonowej z laserem, ogniwem Pockelsa i galwanometrami; układ wzbudzenia optycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat drogi światła. Podstawowe elementy mikroskopu dwufotonowego użytego w tym protokole składają się z ogniwa Pockelsa do modulacji mocy lasera, pary soczewek w celu zmniejszenia średnicy wiązki lasera do rozmiaru tylnej apertury obiektywu mikroskopowego oraz pary galwanometrycznych luster skanujących do sterowania wiązką. Przed każdym głównym elementem optycznym znajduje się para luster kierujących. Ostrość jest kontrolowana przez silnik napędzający uchwyt obiektywu. Drogę światła emisyjnego można dostosować do różnych fluoroforów poprzez wymianę filtrów dichroicznych i barierowych. Przedstawiono ogólny układ do obrazowania w kolorach cyjanowym/żółtym/czerwonym, w którym dichroiczne lustro krótkoprzepustowe kieruje czerwone światło do pierwszego PMT, a dichroiczne lustro długoprzepustowe w połączeniu z odpowiednimi filtrami pasmowymi służy do rozdzielenia emisji cyjanowej i żółtej. Skrót: PMT = fotopowielacz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Technika wyrównania oka myszy; układ optyczny; rozmieszczenie szkiełka podstawowego; regulacja drogi świetlnej źrenicy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Pozycjonowanie myszy do obrazowania in vivo. Aby ustawić źrenicę myszy w osi drogi świetlnej, znieczuloną mysz najpierw unieruchamia się w uchwycie do głowy, głowę obraca i ustawia pod odpowiednim kątem, na oko nakłada się dużą kroplę żelu nawilżającego, a następnie mysz umieszcza się na stoliku. Szkiełko podstawowe montuje się w uchwycie prostopadle do drogi świetlnej i opuszcza w kierunku oka. Szkiełko nie powinno stykać się z rogówką ani głową myszy (po lewej), co będzie widoczne w przypadku odchylenia szkiełka. Jednocześnie szkiełko powinno znajdować się wystarczająco blisko, aby uniknąć zwężenia kropli (po prawej), ponieważ spowodowałoby to efekt pomniejszenia próbki. Po zastosowaniu immersji żelowej i zabezpieczeniu szkiełka, stolik należy przesunąć bezpośrednio pod obiektyw mikroskopu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy wyrównania stosu Z; analiza mikroskopowa z wykorzystaniem technik z-project oraz filtra medianowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie komórek zwojowych siatkówki. W celu wyświetlenia obrazu utworzono projekcje maksymalnej intensywności z płaszczyzn Z zawierających komórki zainteresowania, a otrzymane obrazy poddano filtrowaniu medianowemu w celu usunięcia szumu śrutowego PMT. Przedstawiono dwa przykłady komórek zwojowych siatkówki znakowanych poprzez wstrzyknięcie AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b do myszy transgenicznych VGlut2-Cre, a konkretnie sygnał CFP. Obrazy pozyskano podczas sesji oddalonych od siebie o cztery dni, a punkty orientacyjne naczyń krwionośnych posłużyły do powrotu do tego samego regionu w pobliżu głowy nerwu wzrokowego. Głowa nerwu wzrokowego jest skierowana w dół obrazu. Chociaż obie próbki wykazują pewną zmienność w orientacji (regiony o zmniejszonej intensywności wskazano strzałkami), większość komórek jest obecna w obu punktach czasowych. Pasek skali = około 50 µm. Skróty: PMT = lampa fotopowielająca; AAV = wirus adeno-zależny; EF1α = czynnik elongacyjny-1alfa; FLEX = flip-excision; VGlut2 = pęcherzykowy transporter glutaminianu 2; CFP = cyjanowa białko fluorescencyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig3v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii konfokalnej warstw siatkówki wykazujący ekspresję VGat-Cre i AAV2 w tkankach neuronalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazowanie komórek amacrynych. Komórki amacryne zostały oznakowane poprzez wstrzyknięcie AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b u myszy transgenicznych VGat-Cre. Przedstawiono specyficznie sygnał CFP białka Twitch 2b. Małe projekcje maksymalnej intensywności skupione na głębokościach wewnętrznej warstwy jądrowej wskazują ciała komórek amacrynych, natomiast skupienie na warstwie splotowej wewnętrznej pozwala na rozróżnienie neurytów komórek amacrynych (strzałka). Główka nerwu wzrokowego jest skierowana w prawą stronę obrazu. Pasek skali = około 50 µm. Skróty: AAV = wirus adeno-zależny; EF1α = czynnik elongacyjny 1-alfa; FLEX = flip-excision; VGat = pęcherzykowy transporter kwasu gamma-aminomasłowego; CFP = cyjanowy białko fluorescencyjne; INL = wewnętrzna warstwa jądrowa; IPL = wewnętrzna warstwa splotowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna Cx3cr1-GFP, projekcje Z, analiza uszkodzeń ekscytotoksycznych, badanie time-lapse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Obrazowanie mikrogleju. Do znakowania mikrogleju wykorzystano transgeniczną linię myszy Cx3cr1-GFP. Projekcja maksymalnej intensywności pełnej objętości skanu ukazuje wiele komórek mikrogleju, z których niektóre wykazują rozdzielcze detale drobnych wypustek. Należy zauważyć, że komórki w lewym dolnym rogu pola widzenia wykazują mniejsze zniekształcenia w projekcji maksymalnej niż te w prawym górnym rogu ze względu na paralaksę w tym regionie. Projekcje maksymalnej intensywności zawierające tylko interesującą komórkę znacząco redukują tę paralaksę (środek, obramowane odpowiednimi kolorami). Ponadto ta strategia obrazowania pozwala udokumentować dynamikę przebudowy drobnych wypustek mikrogleju (panele dolne). Dla porównania, wiele komórek mikrogleju z krótkimi wypustkami lub morfologią ameboidalną można zaobserwować jeden dzień po uszkodzeniu ekscytotoksycznym wywołanym wstrzyknięciem domacicznym 50 mM NMDA (prawo). Pasek skali = około 50 µm. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; Cx3cr1 = receptor chemokin 1 typu Cx3; NMDA = N-metylo-D-asparaginian. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia time-lapse in vivo pobierania barwnika Evans Blue do jamy otrzewnej, d0, d2, d7, obrazowanie naczyń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Znakowanie punktów orientacyjnych naczyń. Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 200 µL roztworu Evans blue o stężeniu 20 mg/mL na 30-60 min przed pierwszą sesją obrazowania. Projekcje maksymalnej intensywności o pełnej grubości wykazują trwałą fluorescencję w naczyniach siatkówki, która utrzymywała się przez co najmniej siedem dni. Pasek skali = około 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig6v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres rozmiarów pikseli w mikroskopii dwufotonowej i obrazowaniu konfokalnym neuronów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Wymiary obrazu. Komórki zwojowe siatkówki oznakowane poprzez wstrzyknięcie AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b u myszy transgenicznych VGlut2-Cre zostały zobrazowane in vivo, a ten sam obszar zobrazowano następnie za pomocą konfokalnej skanującej mikroskopii laserowej po utrwaleniu i przygotowaniu preparatu siatkówki w całości (wholemount). Dla obu metod pokazano kanał żółtego białka fluorescencyjnego. Pary kolorowych strzałek wskazują tę samą komórkę w obu preparatach (panele górne). Obraz w jednej płaszczyźnie fluorescencyjnych mikrosfer o średnicy 2 µm wstrzykniętych do ciała szklistego i zobrazowanych in vivo (panel dolny lewy). Mikrosfery nie osiadły, przez co znajdowały się w ciągłym ruchu, co uniemożliwiło pomiar rozdzielczości osiowej. Rozmiary pikseli obliczone z pomiarów pełnej szerokości połówki maksimum (FWHM) fluorescencyjnych mikrosfer in vivo lub korelacyjnych pomiarów konfokalnych wykonanych na 2-4 siatkówkach na grupę (dolny prawy). Pasek skali = 50 µm. Skróty: AAV = wirus adeno-zależny; EF1α = czynnik elongacyjny-1alpha; FLEX = flip-excision; VGlut2 = pęcherzykowy transporter glutaminianu 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig7v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia time-lapse zmian poziomu Ca²⁺; wykres intensywności fluorescencji; badanie neuroobrazowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Aktywność wapniowa indukowana skanowaniem dwufotonowym. Komórki zwojowe siatkówki oznakowane poprzez wstrzyknięcie AAV-EF1α-FLEX-Twitch2b u myszy transgenicznych VGlut2-Cre; YFP jest zakolorowane na magenta, a CFP na zielono; obrazy wykonane w jednej płaszczyźnie jako seria czasowa z częstotliwością 4,22 Hz. Wszystkie RGC miały podobny początkowy stosunek YFP/CFP. Większość zareagowała wzrostem stosunku FRET (z wyjątkiem pomarańczowej komórki), a jedna utrzymała wysoki stosunek YFP/CFP przez całą serię czasową (żółta komórka). Stosunki YFP/CFP zostały znormalizowane do średniej z pierwszej klatki, a kolorowe kółka odpowiadają kolorowym śladom. Gwiazdki wskazują punkty czasowe, dla których reprezentatywne obrazy przedstawiono po lewej stronie. Pasek skali = 20 µm. Skróty: AAV = wirus towarzyszący adenowirusom; EF1α = czynnik elongacyjny-1alfa; FLEX = flip-excision; VGlut2 = pęcherzykowy transporter glutaminianu 2; YFP = żółte białko fluorescencyjne; CFP = cyjanowe białko fluorescencyjne; RGCs = komórki zwojowe siatkówki; FRET = fluorescencyjny rezonansowy transfer energii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61970/61970fig8v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Ta metoda obrazowania in vivo komórek siatkówki pozwala na badanie chorób okulistycznych i zrozumienie prawidłowych funkcji siatkówki. Metoda ta zapewnia proste i wysoce powtarzalne podejście do obrazowania siatkówki in vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Właściwa stabilizacja myszy jest kluczem do uzyskania wysokiej jakości obrazów in vivo.Przećwicz ustawianie myszy w uchwycie głowy i oswoić się z procedurą przed próbą uzyskania obrazów. Uspokoić zwierzę zgodnie z zatwierdzonym protokołem stosowania zwierząt. Zastosuj roztwór rozszerzający źrenice i pozostaw mysz w ciemności na pięć minut, aby źrenice mogły się rozszerzyć.Zamocuj dolny sworzeń przewodu słuchowego w pozycji wysuniętej do wewnątrz, a sworzeń górnego przewodu słuchowego w pozycji wycofanej. Obróć główne ramię uchwytu na głowę, aż listwa słuchawki zostanie przechylona pod kątem 60 stopni poniżej poziomu. Trzymając mysz skierowaną w stronę belki zgryzowej, zamontuj jedno ucho na przedłużonym dolnym trzpieniu z kołkiem włożonym do kanału słuchowego.Po poluzowaniu mocującej sworzeń górnego kanału słuchowego, wsuń kołek do drugiego kanału słuchowego i ponownie dokręć, aby zabezpieczyć głowicę. Upewnij się, że mysz jest dobrze umieszczona w uchwycie na głowę. Naciśnij czubek głowy.Mysz powinna bezpiecznie trzymać się w nausznikach, a jej główka powinna swobodnie obracać się wokół osi kanałów słuchowych. Trzymając pręt gryzący skierowany w stronę głowy myszy, delikatnie podnieś głowę myszy, aby umożliwić opuszczenie siekaczy szczęki do uchwytu paska gryzowego, i cofnij drążek gryzący z delikatną siłą, aby zabezpieczyć głowę. Użyj, aby zamocować pręt gryzowy na miejscu i umieść mysz i uchwyt na stoliku mikroskopu.Nałóż nawilżające krople do oczu na oba oczy myszy. Obróć główne ramię uchwytu głowicy, aż źrenica jednego oka zorientuje się w linii ze ścieżką światła, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe o numerze 1.5 w kompaktowym uchwycie filtra. Po zamocowaniu uchwytu do stolika mikroskopu, opuść szkiełko nakrywkowe, aż zetknie się z żelem do oczu ze smarem bez dotykania rogówki, a następnie wyreguluj stolik w wymiarze X-Y i pozycji Z obiektywu, aż światło wzbudzenia o szerokim polu całkowicie pokryje rogówkę.Użyj okularu, aby kontynuować regulację pozycji Z, aż komórki lub struktury fluorescencyjne w siatkówce staną się ostre, zwiększając oświetlacz epifluorescencji w razie potrzeby, aby rozdzielić poszczególne komórki lub struktury będące przedmiotem zainteresowania. Dostosuj wyrównanie siatkówki do ścieżki światła obrazowania. Dostosuj kąt nachylenia głowicy, aż podczas zmiany płaszczyzny ogniskowej nastąpi tylko rozszerzanie lub kurczenie się nieostrego światła, minimalizując zniekształcenia X-Y.Następnie wyłącz oświetlacz epifluorescencyjny i zamknij migawkę oświetlacza. W przypadku obrazowania dwufotonowego należy przestrzegać wszystkich instytucjonalnych protokołów bezpieczeństwa laserowego. Wyłącz i zakryj całe światło otoczenia i przełącz ścieżkę światła wzbudzenia na laser, a ścieżkę światła emisyjnego na PMT.W oprogramowaniu do akwizycji obrazu ustaw rozmiar klatki na 512 na 512, a średnią klatkę na trzy. Ustaw krok Z tak, aby zaczynał się od góry stosu i postępował w dół, minimalizując dwufotonową aktywację lasera fotoreceptorów. Włącz i włącz PMT i dostosuj napięcie do 680 woltów.Włącz migawki obrazowania i emisji. Rozpocznij podgląd obrazu na żywo tkanki docelowej, zaczynając od 1% mocy lasera, i automatycznie dostosuj jasność wyświetlacza, aby zwizualizować interesujące komórki lub struktury. Jeśli tkanka docelowa jest przyciemniona lub niewyraźna, zwiększaj procentową moc lasera, aż struktury staną się widoczne bez przekraczania 45 miliwatów.Manewruj stolikiem mikroskopu w kierunku X-Y, aby wyśrodkować żądany obszar obrazowania i przejdź do płaszczyzny Z z interesującymi strukturami w ostrości. W przypadku przewlekłego eksperymentu poklatkowego otwórz wcześniej uzyskany obraz, aby użyć go jako odniesienia dla komórek będących przedmiotem zainteresowania, zwracając uwagę, aby kąt obrazowania na bieżącym obrazie był podobny do kąta poprzednich obrazów. Następnie przejdź do górnej i najniższej płaszczyzny Z, aby ustawić limity Z stosu obrazowania i uzyskać obraz.Po zarejestrowaniu wszystkich obrazów wyłącz PMT i migawkę laserową. Przełącz ścieżkę światła wzbudzenia na oświetlenie epifluorescencyjne i ścieżkę światła emisyjnego z powrotem do okularu. Następnie wyjdź z oprogramowania do akwizycji obrazu, wyłącz laser w interfejsie komputera i wyłącz sprzęt w odwrotnej kolejności uruchamiania, z wyjątkiem zawsze włączonego sprzętu.Pod koniec analizy wyjmij mysz z uchwytu na głowę i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby delikatnie usunąć żel pod oczy. Następnie nałóż smarującą maść do oczu na oba oczy i umieść mysz na poduszce grzewczej z obiegiem ciepłej wody o temperaturze 37 stopni Celsjusza z monitorowaniem do pełnego opadnięcia, zanim włożysz mysz z powrotem do obudowy. U myszy VGlut-2-Cre wyraźnie widoczne są somy komórek zwojowych siatkówki, a pęczki aksonów są często widoczne.Trajektoria aksonów i negatywny obraz układu naczyniowego ułatwiają identyfikację głowy nerwu wzrokowego u myszy VGlut-2-Cre, co jest przydatne jako punkt orientacyjny w eksperymentach z obrazowaniem przewlekłym. W przeciwieństwie do komórek zwojowych siatkówki, neuryty amakrynowe są częściej obserwowane w wewnętrznych warstwach splotowatych. Dzień po wstrzyknięciu NMDA do gałki ocznej mikroglej siatkówki wykazuje krótkie procesy lub morfologię ameboidalną zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami.Podanie niebieskiego barwnika Evansa za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia dootrzewnowego na 30 do 60 minut przed obrazowaniem wywołuje silne znakowanie naczyń krwionośnych wychodzących z głowy nerwu wzrokowego, które utrzymuje się przez co najmniej siedem dni. Po fiksacji rzeczywista odległość między parami komórek w spłaszczonych całych mocowaniach siatkówki może być mierzona w skanach konfokalnych i dopasowywana do odległości pikseli in vivo w celu określenia średniego rozmiaru piksela obrazów in vivo. Mikrosfery fluorescencyjne wstrzykiwane do oczu myszy umożliwiają pomiar średnicy mikrosfery in vivo, dając nieco większe oszacowanie rozmiaru piksela, ale z większą wariancją.Obrazowanie in vivo można połączyć z analizami histologicznymi, takimi jak barwienie immunologiczne i hybrydyzacja in situ. Metody te mogą identyfikować określone typy komórek i badać ekspresję genów w obrazowanych komórkach.

transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Źródło: Jongbloets, B. C., et al. Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo. J. Vis. Exp. (2019) Ten film demonstruje procedurę mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej do wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachłanających głowę podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej 

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u noworodków myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film prezentuje mikroskopię dwufotonową używaną do obrazowania neuronów w mózgu znieczulonego transgenicznego szczeniaka myszy. Laser dwufotonowy pozwala na głębsze obrazowanie z wysoką rozdzielczością przestrzenną i minimalnym rozpraszaniem światła, umożliwiając szczegółowe uchwycenie morfologii neuronów, w tym projekcji dendrytycznych.

Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania morfologii neuronów u szczeniaka myszy

Source: Nishimura, C.  Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego wirusem HIV. J. Vis. Exp. (2016). Ten film pokazuje wizualizację in vivo naczyń włosowatych kory mózgowej myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Przedstawiono w nim etapy wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego znieczulonej myszy z cienkim oknem korowym czaszki, przygotowywania zestawu do obrazowania i uzyskiwania szczegółowych obrazów struktur...

 Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy 

Źródło: Kulkarni, M. et al. Obrazowanie ca2+ Dynamika w stożku fotoreceptorów zakończeń aksonów siatkówki myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków transgenicznej siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy przygotowania wycinków siatkówki, obrazowania biosensorów wapnia opartych na FRET oraz analizy zmian fluorescencji w celu ilościowego określenia poziomu wapnia przy oświetleniu tła i...

Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Poznaj metodę przezźrenicowego dwufotonowego obrazowania siatkówki myszy in vivo. Technika ta umożliwia badanie funkcji komórek siatkówki oraz mechanizmów chorób oczu w modelu zwierzęcym.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów