Name: Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych mikrotkanek mięśni szkieletowych człowieka w platformie MyoTACTIC. Technika umożliwia wielokrotne, mało inwazyjne pomiary siły skurczowej i transjentów wapniowych w badaniach funkcji mięśniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Mohammadowi Afsharowi, Haben Abraha, Mohsenowi Afshar-Bakooshliemu i Sadeghowi Davoudi za przyczynienie się do wynalezienia platformy kulturowej MyoTACTIC oraz ustanowienia metod produkcji i analizy opisanych w niniejszym dokumencie. HL otrzymał dofinansowanie z programu szkoleniowego Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) w zakresie stypendium w zakresie inżynierii i przedsiębiorczości organ-on-a-chip oraz stypendiów dla absolwentów University of Toronto Wildcat. PMG jest Kanadyjską Katedrą Badań nad Naprawą Endogenną i otrzymała wsparcie dla tego badania od Ontario Institute for Regenerative Medicine, Stem Cell Network oraz od Medicine by Design, Canada First Research Excellence Program. Schematy ideowe zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li>
<li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoScreen%2C+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li>
<li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+innovation%3A+New+estimates+of+drug+development+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307(2018).</li>
<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
<li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121(2020).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li>
<li>Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li>
<li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918(2020).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym manuskrypcie opisano metody wytwarzania i analizy modelu hodowli 3D hMMT, który można zastosować do badań nad podstawową biologią mięśni, modelowania chorób lub do testowania cząsteczek kandydujących. Platforma MyoTACTIC jest tańsza, łatwa w produkcji i wymaga stosunkowo niewielkiej liczby komórek do produkcji mikrotkanek mięśni szkieletowych. hMMT powstające na platformie hodowlanej MyoTACTIC składają się z wyrównanych, wielojądrowych i prążkowanych miotub i reagują na bodźce elektryczne poprzez inicjowanie stanów...

Mięśnie szkieletowe są jedną z najobficiej występujących tkanek w ludzkim ciele i wspierają kluczowe funkcje organizmu, takie jak lokomocja, homeostaza ciepła i metabolizm1. Historycznie rzecz biorąc, modele zwierzęce i dwuwymiarowe (2D) systemy hodowli komórkowych były wykorzystywane do badania procesów biologicznych i patogenezy chorób, a także do testowania związków farmakologicznych w leczeniu chorób mięśni szkieletowych2,3. Podczas gdy modele zwierzęce znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat mięśni szkieletowych w zdrowiu i chorobie, ich wpływ translacyjny był utrudniony przez wysokie koszty, względy etyczne i różnice międzygatunkowe2,4. Zwracając się do systemów opartych na komórkach ludzkich do badania mięśni szkieletowych, systemy hodowli komórkowych 2D są korzystne ze względu na swoją prostotę. Jest jednak pewne ograniczenie. Ten format często nie podsumowuje interakcji komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa, które zachodzą naturalnie w ciele5,6. W ciągu ostatnich kilku lat trójwymiarowe (3D) modele mięśni szkieletowych stały się potężną alternatywą dla całych modeli zwierzęcych i konwencjonalnych systemów hodowli 2D, umożliwiając modelowanie fizjologicznie i patologicznie istotnych procesów ex vivo7,8. Rzeczywiście, mnóstwo badań opisało strategie modelowania ludzkich mięśni szkieletowych w biosztucznej kulturze 3D format1. Jednym z ograniczeń dla wielu z tych badań jest to, że siła czynna jest określana ilościowo po usunięciu tkanek mięśniowych z platform hodowlanych i przyłączeniu do przetwornika siły, co jest destrukcyjne, a zatem ogranicza się do służenia jako test końcowy9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Inni zaprojektowali systemy hodowli, które pozwalają na nieinwazyjne metody pomiaru siły czynnej, ale nie wszystkie są podatne na testowanie cząsteczek o wysokiej zawartości7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28,29.
Ten protokół opisuje szczegółową metodę wytwarzania mikrotkanek mięśni ludzkich (hMMT) na platformie mikrotkankowej mięśni szkieletowych (Myo) do badania (MyoTACTIC); 96-dołkowe urządzenie do produkcji mikrotkanek mięśni szkieletowych 3D30. Metoda wytwarzania płytek MyoTACTIC umożliwia wytworzenie 96-dołkowej płytki hodowlanej z polidimetylosiloksanu (PDMS) i wszystkich odpowiadających jej cech dołka w jednym etapie odlewania, przy czym każda studzienka wymaga stosunkowo niewielkiej liczby komórek do wytworzenia mikrotkanek. Mikrotkanki utworzone w MyoTACTIC zawierają wyrównane, prążkowane i wielojądrowe rurki miotube, które są odtwarzalne od studni do studni urządzenia, a po dojrzewaniu mogą reagować na bodźce chemiczne i elektryczne in situ30. W niniejszym artykule przedstawiono i omówiono technikę wytwarzania płytki hodowlanej PDMS MyoTACTIC z repliki poliuretanu (PU), zoptymalizowaną metodę implementacji unieśmiertelnionych ludzkich miogennych komórek progenitorowych do wytwarzania hMMT oraz funkcjonalną ocenę zmodyfikowanego generowania siły hMMT i właściwości obchodzenia się z wapniem.

<table><tbody><tr><td>0,9% roztwór soli fizjologicznej, sterylny</td><td>produkt marki</td><td>1010</td><td>10 ml porcje roztworu są wytwarzane i przechowywane w temperaturze 4& Igła C</td></tr><tr><td>25G</td><td>BD, Medstore, Uniwersytet w Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-aminokapronowy, &ge; 99% (miareczkowanie), proszek</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg / ml powstaje przez rozpuszczenie 5 mg proszku kwasu 6-aminokapronowego w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej. Roztwór jest filtrowany próżniowo, a 10 ml porcji jest przechowywanych w temperaturze 4&deg; </td></tr><tr><td>C 6,35 mm ID Rurka VWR</td><td></td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 Myoblast Cell Line</td><td>Institut de Myologie (Paryż, Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generator przebiegów arbitralnych</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej (Geltrex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>Przechowywany jako podwielokrotności 50 &mikro; L lub 100 &mikro; L przy -80&deg; </td></tr><tr><td>C Stołowa komora próżniowa</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> zaciskowy BNC do Aligator <td>zamówiony w Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Zawiera płytki hodowlane, pipety serologiczne itp</td></tr>. <tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21600069</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Jest to DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą i pirogronianem sodu</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen z osocza bydlęcego</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Podwielokrotności w zakresie od 7 do 10 mg proszku fibrynogenu są wytwarzane i przechowywane w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Filtropur, 0,22um Wielkość</td><td>porów Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana insulina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>Roztwór podstawowy wynosi 100X i jest wytwarzany przez rozpuszczenie 1 mg ludzkiej rekombinowanej insuliny w 1 ml DMEM i 1 &mikro; L z NaOH 10N. Roztwór jest filtrowany i przechowywany w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze 4& Oprogramowanie do</td></tr><tr><td>akwizycji obrazów</td> C <td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik izotempowy</td><td>Mikroskop Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>- Uchwyt do kamery</td><td>Labcam</td><td>Labcam dla iPhone'a</td><td>Zamówiony w Amazon</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe jednorazowe strzykawki, 1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe jednorazowe strzykawki, 50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, proszek, Bioodczynnik</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>5% roztwór podstawowy kwasu pluronowego sporządza się przez rozpuszczenie 5 g proszku kwasu pluronowego w 100 ml schłodzonej, autoklawowanej wody destylowanej. Roztwór jest filtrowany próżniowo, a 10 ml porcji jest przechowywanych w temperaturze 4&deg; C</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td><td>Zestawy Dow</td><td>4019862</td><td>są również dostępne w Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich itp.</td></tr><tr><td>Poliuretanowa forma ujemna</td><td>Wewnętrzny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>środek antyadhezyjny</td><td>Mann Release Technologies</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>Rotacyjna łopatkowa pompa próżniowa</td><td>Edwards</td><td>A65401906</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka z pojedynczą krawędzią</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa komórek mięśni szkieletowych Podłoże</td><td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>30 mL porcje, które są generowane i przechowywane w temperaturze 4& stopni C.</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek mięśni szkieletowych (gotowa do użycia)</td><td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>42 mL porcje są generowane i przechowywane w temperaturze 4& stopni C.</td></tr><tr><td>Smartfon (iPhone)</td><td></td><td>Pompa</td> próżniowa Apple SE <td></td></tr><tr><td>Standard Duty Dry Vacuum</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Worek do sterylizacji</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>Naparstek</td><td>Igege Zamówiony</td><td></td><td>w Amazon</td></tr><tr><td>Trombina z ludzkiego osocza</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>100 jednostek trombiny rozpuszcza się w 1 ml 0,1% roztworu BSA. 10 &mikro; Podwielokrotności L są przygotowywane i przechowywane w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>Drut miedziany pokryty cyną</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>Zamówiony w Amazon</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25%</td> <td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Komora próżniowa 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Trójwymiarowe (3D) modele in vitro mięśni szkieletowych są cennym postępem w badaniach biomedycznych, ponieważ dają możliwość badania przemiany i funkcji mięśni szkieletowych w skalowalnym formacie, który jest podatny na eksperymenty manipulations. 3D systemy hodowli mięśni są pożądane, ponieważ umożliwiają naukowcom badanie mięśni szkieletowych ex vivo w kontekście człowieka cells. 3D modele in vitro ściśle naśladują aspekty natywnej struktury tkankowej dorosłego osobnika mięśnie szkieletowe. Ich uniwersalne zastosowanie jest jednak ograniczone dostępnością platform, które są proste w wykonaniu, drogie i przyjazne dla użytkownika, a także dają stosunkowo duże ilości ludzkich tkanek mięśni szkieletowych. Ponadto, ponieważ mięśnie szkieletowe odgrywają ważną rolę funkcjonalną, która z czasem ulega upośledzeniu w wielu stanach chorobowych, platforma eksperymentalna do badań mikrotkanek jest najbardziej praktyczna, gdy minimalnie inwazyjne pomiary przejściowej i kurczliwej siły wapnia można przeprowadzić bezpośrednio na samej platformie. W tym protokole opisano wytwarzanie 96-wiertniczej platformy znanej jako "MyoTACTIC" oraz masową produkcję 3D ludzkich mikrotkanek mięśni szkieletowych (hMMT). Ponadto przedstawiono metody minimalnie inwazyjnego zastosowania stymulacji elektrycznej, która umożliwia wielokrotne pomiary siły mięśni szkieletowych i obchodzenia się z wapniem każdej mikrotkanki w czasie.

W niniejszej pracy opisano metody odlewania 96-dołkowej platformy hodowlanej MyoTACTIC opartej na PDMS z formy z PU, wytwarzania macierzy replik tkanek hMMT oraz analizy dwóch aspektów funkcji hMMT w urządzeniu hodowlanym – generowania siły oraz gospodarki wapniowej. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd przygotowania dołków hodowlanych MyoTACTIC przed wysianiem hMMT. PDMS jest powszechnie stosowanym polimerem na bazie silikonu, który można łatwo formować w celu tworzenia złożonych urz...

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Nasz protokół opisuje szczegółowe metody wytwarzania i analizy 3D hodowli mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych. Mikrotkanki mięśniowe mogą być stosowane do badań nad podstawową biologią mięśni, modelowania chorób lub do testowania cząsteczek kandydujących. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ocenę in situ siły skurczu i stanów przejściowych wapnia.Z tego powodu można prowadzić badania podłużne funkcji tkanki mięśniowej. Procedurę zademonstrują Brennen Musgrave i Heta Lad, doktoranci z mojego laboratorium. Dwie do trzech godzin przed wysiewem komórek umieść sześciodołkową łagodną porcję płytki taktycznej w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych.Dobrze przygotuj każdą pojedynczą kulturę miotaktyczną, dodając 100 mikrolitrów 5% roztworu pluronicznego F-127. Użyj pokrywki, aby przykryć studzienki i nałóż folię parafinową, aby uszczelnić naczynie. Odwirować naczynie w temperaturze 1 550 razy G przez jedną minutę w wirówce wyposażonej w adapter do obracania płytek.Przechowuj naczynie hodowlane w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż komórki będą gotowe do wysiewu. Następnie powoli rozmrozić 150 mikrolitrów podwielokrotności ekstraktu z błony podstawnej i 110 mikrolitrów podwielokrotności trombiny na lodzie w okapie hodowlanym. Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, dodaj 700 mikrolitrów 0,9% roztworu soli fizjologicznej do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej siedem miligramów sproszkowanego fibrynogenu.Umieść probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy do pięciu minut bez wirowania. Wyjmij probówkę i delikatnie nią trzepnij, a następnie pulsacyjnie odwiruj rozpuszczony roztwór w mikrowirówce przed powrotem do okapu hodowlanego. Przefiltrować roztwór fibrynogenu za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra.Następnie przenieś rozpuszczony roztwór fibrynogenu do lodu wraz z ekstraktem z błony podstawnej i podwielokrotnościami trombiny. Przygotuj i wstępnie ogrzej pożywkę do wzrostu tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, która zostanie wprowadzona do dołków hodowlanych po wysianiu tkanek. Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i odessać pożywkę hodowlaną.Następnie umyj komórki raz, dodając pięć mililitrów DPBS do każdej płytki hodowlanej. Odessać DPBS i odłączyć komórki, dodając jeden mililitr 0,25% trypsyny EDTA do każdej płytki hodowlanej. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy minuty, przytrzymaj trypsynę, dodając trzy mililitry pożywki do mycia do naczynia hodowlanego, a następnie przenieś komórki do stożkowej rurki o odpowiedniej wielkości.Osadzać komórki, odwirowując w temperaturze 400 razy G przez 10 minut. Ostrożnie zassać pożywkę, nie uszkadzając osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze medium myjącego. Policz komórki za pomocą hemocytometru i niebieskiego barwnika trypanowego pod mikroskopią w jasnym polu.Aby wysiać sześć tkanek, przygotuj wystarczającą ilość komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej dla ośmiu tkanek, uwzględniając w ten sposób straty i tworzenie się pęcherzyków. Przenieś 1,2 miliona komórek do nowej stożkowej rury, a następnie zwiększ objętość do 10 milimetrów za pomocą środka myjącego. Osadzać komórki, odwirowując w temperaturze 400 razy G przez 10 minut.Przygotuj 150 mikrolitrów mieszaniny ECM w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej i przechowuj mieszaninę na lodzie do czasu użycia. Odessać pożywkę ze stożkowej rurki zawierającej komórki, uważając, aby uniknąć osadu komórek. Energicznie przesuwaj koniec rurki palcem w rękawiczce, aż granulka pojawi się jako zawiesina komórkowa.Przenieś 120 mikrolitrów roztworu ECM do probówki zawierającej zawiesinę komórek i ostrożnie pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie ponownie zawiesić komórki w ECM w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. Należy unikać tworzenia pęcherzyków, a następnie umieścić zawiesinę ECM komórek na lodzie do czasu użycia. Umieść schłodzone 10-centymetrowe naczynie zawierające studzienki miotaktyczne na wierzchu okładu z lodu wewnątrz okapu do hodowli komórkowych i odessaj roztwór pluroniczny F-127 z każdej studzienki.Poczekaj, aż resztki roztworu pluronicznego F-127 uwolnią się z porowatego PDMS i osiądź na dnie studzienki, pozostawiając studzienki na pięć minut na lodzie, a następnie ponownie zassać. Ostrożnie odpipetować zawiesinę ECM ogniwa, aby ponownie zawiesić komórki, a następnie przenieść 105 mikrolitrów zawiesiny do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra, chwytając ją blisko góry. Dodaj 0,84 mikrolitra 100 jednostek na mililitr roztworu podstawowego trombiny do 105 mikrolitrów zawiesiny ECM komórki.Pipetować szybko i dokładnie, aby wymieszać, unikając wprowadzania pęcherzyków. Dodaj 15 mikrolitrów mieszaniny ECM komórek do każdego dołka bez wciskania pipety na dno studzienki. Dwoma lekkimi ruchami rozprowadź zawiesinę komórek za każdym słupkiem w studni.Umieść pokrywkę na 10-centymetrowej płytce hodowlanej i przenieś ją do inkubatora do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na około pięć minut. Dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do wzrostu tkanek do każdego miotaktycznego dołka po polimeryzacji mieszaniny ECM komórki. Załóż pokrywkę na 10-centymetrową szalkę i trzymaj ją w inkubatorze aż do różnicowania.Podczas 14-dniowego okresu hodowli mioblasty wykazywały aspekty tkanki natywnej, samoorganizując się w łagodnej taktyce, tworząc mikrotkankę 3D z wielojądrowymi prążkowanymi miorurkami. Miotubes mają prążki sarkomerowe, które zostały uwidocznione przez barwienie immunologiczne sarkomerycznej alfa aktyniny. Aby uzyskać dobrze ustawione rurki miotube, należy unikać błędów technicznych, takich jak tworzenie się pęcherzyków podczas pipetowania lub uszkadzająca powłoka pluroniczna podczas aspiracji.Pokazano tutaj reprezentatywne przemieszczenie słupka płytki studzienki miotaktycznej w odpowiedzi na stymulację elektryczną o niskiej i wysokiej częstotliwości, co wskazuje, że miorurki reagują na różne bodźce elektryczne i odpowiednio się kurczą. Kwantyfikacja przemieszczenia po przemieszczeniu pozwala na konwersję do bezwzględnej siły skurczu HMMT. Przeanalizowano również przejściowość wapnia na HMMT wykonanych z mioblastów transdukowanych GCaMP6 w odpowiedzi na stymulację o niskiej i wysokiej częstotliwości.Kwantyfikacja intensywności fluorescencji może być wykorzystana jako pomiar właściwości HMMT w zakresie obchodzenia się z wapniem. Większość osób, które wykonują to wysiewanie tkanek po raz pierwszy, zmaga się z dodaniem macierzy zewnątrzkomórkowej komórki do studzienek i tworzeniem się pęcherzyków. Zalecamy przećwiczenie tej techniki na kilku zapasowych studzienkach do hodowli mikrotkanek z bardzo prostym lepkim roztworem przed pierwszą próbą z komórkami.

assessing-functional-metrics-skeletal-muscle-health-human-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Ten protokół opisuje użycie mikroskalowych wsporników krzemowych jako giętkich powierzchni hodowlanych do pomiaru kurczliwości komórek mięśniowych in vitro. Skurcz komórkowy powoduje zginanie wspornika, które można zmierzyć, zarejestrować i przekształcić w odczyty siły, zapewniając nieinwazyjny i skalowalny system pomiaru funkcji skurczu in vitro.

Wykorzystanie mikroskalowych wsporników krzemowych do oceny funkcji kurczliwości komórkowej in vitro

Ten protokół opisuje solidną, powtarzalną i prostą metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych. Wykorzystywane tutaj mięśnie obejmują mięśnie stóp i nóg. Takie podejście umożliwia wyizolowanie wzbogaconej populacji pierwotnych mioblastów do badań funkcjonalnych.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Ten raport techniczny opisuje odmianę zmodyfikowanej techniki Bergströma do biopsji mięśnia piszczelowego przedniego, która ogranicza uszkodzenia włókien.

Pobieranie biopsji mięśni szkieletowych z górnego przedziału mięśnia piszczelowego ludzkiego mięśnia piszczelowego przedniego w celu oceny mechanicznej

Kwantyfikacja maksymalnej siły prostownika kolana jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych adaptacji do starzenia się, chorób, urazów i rehabilitacji. Przedstawiamy nowatorską metodę wielokrotnego pomiaru in vivo izometrycznego szczytowego momentu obrotowego tężcowego wyprostu kolana.

Pomiar in vivo funkcji mięśni prostowników stawu kolanowego u myszy

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół wykorzystuje mikrotomografię komputerową, aby umożliwić ekonomiczną kwantyfikację beztłuszczowej masy, w tym mięśni szkieletowych i tkanki trzewnej, tkanki tłuszczowej i tkanki szkieletowej u małych zwierząt. Rozróżnia tkankę beztłuszczową i tłuszczową, co daje znaczące korzyści w badaniach biomedycznych, szczególnie w badaniach translacyjnych na małych zwierzętach.

Nieinwazyjna kwantyfikacja mięśni szkieletowych u małych zwierząt za pomocą mikrotomografii komputerowej

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych mikrotkanek mięśni szkieletowych człowieka w platformie MyoTACTIC. Technika umożliwia wielokrotne, mało inwazyjne pomiary siły skurczowej i transjentów wapniowych w badaniach funkcji mięśniowej.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Przeglądaj więcej filmów