Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Nasz protokół opisuje szczegółowe metody wytwarzania i analizy 3D hodowli mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych. Mikrotkanki mięśniowe mogą być stosowane do badań nad podstawową biologią mięśni, modelowania chorób lub do testowania cząsteczek kandydujących. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ocenę in situ siły skurczu i stanów przejściowych wapnia.

Z tego powodu można prowadzić badania podłużne funkcji tkanki mięśniowej. Procedurę zademonstrują Brennen Musgrave i Heta Lad, doktoranci z mojego laboratorium. Dwie do trzech godzin przed wysiewem komórek umieść sześciodołkową łagodną porcję płytki taktycznej w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych.

Dobrze przygotuj każdą pojedynczą kulturę miotaktyczną, dodając 100 mikrolitrów 5% roztworu pluronicznego F-127. Użyj pokrywki, aby przykryć studzienki i nałóż folię parafinową, aby uszczelnić naczynie. Odwirować naczynie w temperaturze 1 550 razy G przez jedną minutę w wirówce wyposażonej w adapter do obracania płytek.

Przechowuj naczynie hodowlane w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż komórki będą gotowe do wysiewu. Następnie powoli rozmrozić 150 mikrolitrów podwielokrotności ekstraktu z błony podstawnej i 110 mikrolitrów podwielokrotności trombiny na lodzie w okapie hodowlanym. Pracując w kapturze do hodowli komórkowych, dodaj 700 mikrolitrów 0,9% roztworu soli fizjologicznej do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej siedem miligramów sproszkowanego fibrynogenu.

Umieść probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy do pięciu minut bez wirowania. Wyjmij probówkę i delikatnie nią trzepnij, a następnie pulsacyjnie odwiruj rozpuszczony roztwór w mikrowirówce przed powrotem do okapu hodowlanego. Przefiltrować roztwór fibrynogenu za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra.

Następnie przenieś rozpuszczony roztwór fibrynogenu do lodu wraz z ekstraktem z błony podstawnej i podwielokrotnościami trombiny. Przygotuj i wstępnie ogrzej pożywkę do wzrostu tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, która zostanie wprowadzona do dołków hodowlanych po wysianiu tkanek. Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i odessać pożywkę hodowlaną.

Następnie umyj komórki raz, dodając pięć mililitrów DPBS do każdej płytki hodowlanej. Odessać DPBS i odłączyć komórki, dodając jeden mililitr 0,25% trypsyny EDTA do każdej płytki hodowlanej. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy minuty, przytrzymaj trypsynę, dodając trzy mililitry pożywki do mycia do naczynia hodowlanego, a następnie przenieś komórki do stożkowej rurki o odpowiedniej wielkości.

Osadzać komórki, odwirowując w temperaturze 400 razy G przez 10 minut. Ostrożnie zassać pożywkę, nie uszkadzając osadu komórkowego, a następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze medium myjącego. Policz komórki za pomocą hemocytometru i niebieskiego barwnika trypanowego pod mikroskopią w jasnym polu.

Aby wysiać sześć tkanek, przygotuj wystarczającą ilość komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej dla ośmiu tkanek, uwzględniając w ten sposób straty i tworzenie się pęcherzyków. Przenieś 1,2 miliona komórek do nowej stożkowej rury, a następnie zwiększ objętość do 10 milimetrów za pomocą środka myjącego. Osadzać komórki, odwirowując w temperaturze 400 razy G przez 10 minut.

Przygotuj 150 mikrolitrów mieszaniny ECM w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej i przechowuj mieszaninę na lodzie do czasu użycia. Odessać pożywkę ze stożkowej rurki zawierającej komórki, uważając, aby uniknąć osadu komórek. Energicznie przesuwaj koniec rurki palcem w rękawiczce, aż granulka pojawi się jako zawiesina komórkowa.

Przenieś 120 mikrolitrów roztworu ECM do probówki zawierającej zawiesinę komórek i ostrożnie pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie ponownie zawiesić komórki w ECM w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. Należy unikać tworzenia pęcherzyków, a następnie umieścić zawiesinę ECM komórek na lodzie do czasu użycia. Umieść schłodzone 10-centymetrowe naczynie zawierające studzienki miotaktyczne na wierzchu okładu z lodu wewnątrz okapu do hodowli komórkowych i odessaj roztwór pluroniczny F-127 z każdej studzienki.

Poczekaj, aż resztki roztworu pluronicznego F-127 uwolnią się z porowatego PDMS i osiądź na dnie studzienki, pozostawiając studzienki na pięć minut na lodzie, a następnie ponownie zassać. Ostrożnie odpipetować zawiesinę ECM ogniwa, aby ponownie zawiesić komórki, a następnie przenieść 105 mikrolitrów zawiesiny do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra, chwytając ją blisko góry. Dodaj 0,84 mikrolitra 100 jednostek na mililitr roztworu podstawowego trombiny do 105 mikrolitrów zawiesiny ECM komórki.

Pipetować szybko i dokładnie, aby wymieszać, unikając wprowadzania pęcherzyków. Dodaj 15 mikrolitrów mieszaniny ECM komórek do każdego dołka bez wciskania pipety na dno studzienki. Dwoma lekkimi ruchami rozprowadź zawiesinę komórek za każdym słupkiem w studni.

Umieść pokrywkę na 10-centymetrowej płytce hodowlanej i przenieś ją do inkubatora do hodowli tkankowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na około pięć minut. Dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do wzrostu tkanek do każdego miotaktycznego dołka po polimeryzacji mieszaniny ECM komórki. Załóż pokrywkę na 10-centymetrową szalkę i trzymaj ją w inkubatorze aż do różnicowania.

Podczas 14-dniowego okresu hodowli mioblasty wykazywały aspekty tkanki natywnej, samoorganizując się w łagodnej taktyce, tworząc mikrotkankę 3D z wielojądrowymi prążkowanymi miorurkami. Miotubes mają prążki sarkomerowe, które zostały uwidocznione przez barwienie immunologiczne sarkomerycznej alfa aktyniny. Aby uzyskać dobrze ustawione rurki miotube, należy unikać błędów technicznych, takich jak tworzenie się pęcherzyków podczas pipetowania lub uszkadzająca powłoka pluroniczna podczas aspiracji.

Pokazano tutaj reprezentatywne przemieszczenie słupka płytki studzienki miotaktycznej w odpowiedzi na stymulację elektryczną o niskiej i wysokiej częstotliwości, co wskazuje, że miorurki reagują na różne bodźce elektryczne i odpowiednio się kurczą. Kwantyfikacja przemieszczenia po przemieszczeniu pozwala na konwersję do bezwzględnej siły skurczu HMMT. Przeanalizowano również przejściowość wapnia na HMMT wykonanych z mioblastów transdukowanych GCaMP6 w odpowiedzi na stymulację o niskiej i wysokiej częstotliwości.

Kwantyfikacja intensywności fluorescencji może być wykorzystana jako pomiar właściwości HMMT w zakresie obchodzenia się z wapniem. Większość osób, które wykonują to wysiewanie tkanek po raz pierwszy, zmaga się z dodaniem macierzy zewnątrzkomórkowej komórki do studzienek i tworzeniem się pęcherzyków. Zalecamy przećwiczenie tej techniki na kilku zapasowych studzienkach do hodowli mikrotkanek z bardzo prostym lepkim roztworem przed pierwszą próbą z komórkami.