Wspólna hodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości w urządzeniach mikroprzepływowych w celu oceny interakcji elektrycznych

Interakcje między złośliwymi komórkami glejaka a otaczającymi je neuronami zyskują coraz większe zainteresowanie. Tutaj pokazujemy rozwój modelu in vitro ko-kulturowego pochodzącego z korowych neuronów glutaminergicznym i komórek nowotworowych. Urządzenia mikrofludyczne stosowane do kohodowli sprzężonych z układami wieloelektrodowymi umożliwiają badanie różnych typów komórek i wykonywanie zapisów aktywności elektrycznej w różnych punktach czasowych kultur.

Metoda ta jest szczególnie pomocna w badaniach funkcjonalnych i mechanistycznych oraz w analizie skutków środków farmakologicznych, które blokują migrację komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości u dzieci i interakcję z neuronami. Aby rozpocząć hodowlę skomercjalizowanych ludzkich neuronów glutaminergicznych pochodzących z IPS, opróżnij zbiorniki wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego za pomocą aspiracji pipetami, pozwalając, aby tylko kanały urządzenia zostały wypełnione pożywką. Zasiej ludzkie komórki IPS, dodając 10 mikrolitrów 6,5 miliona ludzkich komórek IPS na mililitr zawiesiny do pożywki i pozwól urządzeniu znajdować się pod maską przez 15 minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się.

Po 15 minutach napełnij zbiorniki wlotowe i wylotowe 50 mikrolitrami pożywki hodowlanej czwartego dnia, a następnie przenieś urządzenie do inkubatora, aby utrzymać komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 23 dni. Pożywkę należy wymieniać co trzy do czterech dni, zgodnie z opisem w tekście. Aby policzyć komórki i ocenić ich żywotność za pomocą standardowego mikroskopu z kontrastem fazowym, należy wykonać zdjęcia mikroskopowe w 4., 21. i 23. dniu.

Hodowla zarówno linii komórkowych UW479, jak i BT35 w DMEM i F-12 GlutaMAX uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą w kolbie do hodowli komórkowych. Utrzymuj hodowlę komórkową w kontrolowanym środowisku w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach normoksyjnych przez cały czas trwania eksperymentu. Obserwuj każdą linię komórkową, aby osiągnąć 80% konfluencji.

W 21 dniu po hodowli neuronów glutaminergicznym rozpocznij wspólną hodowlę poprzez trypsynizację komórek UW479 i BT35. Wysiewaj trypsynizowane komórki UW479 i BT35 na wierzchu dojrzałych przylegających neuronów glutaminergicznego w każdym dedykowanym urządzeniu mikroprzepływowym. Utrzymuj kokultury przez dwa dni w kontrolowanym środowisku w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z neuronem glutaminergicznym D11 i dalszym podłożem.

Policz pediatryczne komórki glejaka o wysokim stopniu złośliwości, korzystając ze zdjęć mikroskopowych analizowanych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, aby ocenić ich żywotność i obliczyć procent komórek. Umieść MFD w urządzeniu rejestrującym i użyj dostępnego na rynku oprogramowania, aby wykonać elektrofizjologiczny zapis neuronów glutaminergicznych w 21 dniu. Przed wysiewem pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości należy wykonać drugi zapis elektrofizjologiczny zróżnicowanych neuronów glutaminergicznego hodowanych jako kontrola równolegle do kohodowli.

Wykonaj kolejny zapis elektrofizjologiczny 23 dnia po dwóch dniach kohodowli. Ludzkie neurony glutaminergiczne pochodzące z IPS scharakteryzowano i oceniono za pomocą nestyny, SOX2, metabotropowych receptorów glutaminianu II i barwienia immunologicznego VGLUT1. Nestyna jest pośrednim białkiem filamentowym i uległa ekspresji w niezróżnicowanych komórkach OUN.

SOX2 ulegał również ekspresji w niezróżnicowanych komórkach nabłonka nerwowego w OUN. Odsetek komórek nestynowych i SOX2-dodatnich zmniejszył się od czwartego do 21 dnia, co potwierdza zróżnicowany stan neuronów glutaminergicznym. Obrazy mikroskopowe ujawniły postępujący rozkład neuronów glutaminergicznym w urządzeniach mikroprzepływowych.

Po dodaniu BT35 i UW479 do hodowli zaobserwowano, że pływające komórki były obecne po wysianiu komórek glejaka w 21 dniu, które stopniowo zanikały do 23 dnia i stawały się przylegające w urządzeniu. Odsetek żywotnych komórek dla BT35 i UW479 był porównywalny i sugerował, że linie komórkowe pochodzące od pacjentów mogą być odpowiednio wykorzystane. Wykrywanie kolców i wykres rastrowy w 23 dniu hodowli wykazały zwiększoną aktywność elektryczną po dodaniu pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości.

Aby monitorować synchronizację aktywności sieci neuronowej, zarejestrowano chwilową szybkość odpalania w BT35 lub neuronach glutaminergicznym. Różnica w aktywności elektrycznej między indywidualnie hodowanymi i współhodowanymi neuronami glutaminergicznymi była znacząca w 23 dniu. Dalszy rozwój metodologiczny może obejmować ocenę funkcjonalną sieci z analizą rozerwania i specjalnymi czasowymi korelacjami krzyżowymi sieci.

Teraz naukowcy mają obiecujące narzędzie do badania interakcji i farmakologicznego celowania w pediatryczne linie guza glejaka o wysokim stopniu złośliwości i neurony o wysokim PSC. Można użyć kilku linii nowotworowych i kilku typów neuronów.