Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Nasz protokół pozwala naukowcom analizować proces arteriogenezy in vivo poprzez śledzenie przylegania komórek odpornościowych i wynaczynienia w rosnących tętnicach pobocznych w czasie rzeczywistym. Technika mikroskopii wielofotonowej pozwala na wizualizację dynamiki komórek w głębokich tkankach żywych modeli myszy o niskiej fototoksyczności i wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej. Procedura mikroskopowa zostanie zademonstrowana przez Dominica van den Heuvela, asystenta technicznego z platformy obrazowania wielofotonowego z laboratorium dr Helen Ishikawa-Ankerhold.

Zademonstruję procedurę chirurgiczną. Aby rozpocząć, umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej. Następnie umieść dwa kawałki uformowanej gliny pod górną tylną kończyną myszy, aby zapewnić płaską pozycję mięśnia przywodziciela.

Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym. Po usunięciu owłosienia z obu nóg należy zdezynfekować i przeciąć skórę w kółko wokół blizny wcześniejszego podwiązania tętnicy udowej prawej kończyny tylnej. Usuń warstwę skóry i tłuszczu z górnej części nogi i odciągnij pozostałą skórę za pomocą szwów, aby utworzyć kieszeń wokół mięśnia przywodziciela z naczyniami pobocznymi.

Następnie usuń podskórną tkankę tłuszczową, aby uzyskać wyraźny obraz mięśnia przywodziciela, tętnicy i żyły profunda, a także naczyń pobocznych. Usuń powierzchowną warstwę mięśni na wierzchu naczyń pobocznych za pomocą cienkich kleszczy. Napełnij przygotowaną kieszeń solą fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu tkanki i kontynuuj tę samą procedurę dla pozorowanej lewej kończyny tylnej.

Przed obrazowaniem dodaj żel ultradźwiękowy do obu kieszeni, który zapobiega wysychaniu i służy jako medium zanurzeniowe do optycznego sprzężenia z obiektywem. Włącz klucz w szafirowej skrzynce laserowej, skrzynce interfejsów elektronicznych, jednostce grzewczej komory inkubatora, lampie fluorescencyjnej i komputerze. Uruchom oprogramowanie do akwizycji.

Ustaw długość fali na 800 nanometrów i otwórz migawkę mikroskopu. W oknie dialogowym kreatora pomiarów wybierz tryb przyrządu jako pojedynczą wiązkę i tryb pomiaru jako timelapse skanowania 3D. Następnie przenieś znieczuloną mysz do wstępnie ogrzanej komory inkubacyjnej mikroskopu i umieść obszar z żelem ultradźwiękowym bezpośrednio w kontakcie z przednią soczewką obiektywu.

Otwórz migawkę mikroskopu epifluorescencyjnego. Następnie wybierz odpowiedni filtr lub ustawienie dichroiczne dla wizualizacji FTSE. Zdefiniuj obszar zainteresowania, śledząc przepływ krwi w świetle epifluorescencyjnym.

Po ustawieniu obszaru zainteresowania w środkowym polu view zamknij migawkę mikroskopu epifluorescencyjnego. W oknie dialogowym skanera XY ustaw wymagane parametry dla rozmiaru obrazu, piksela, częstotliwości, średniej linii. Dostosuj moc lasera i ustaw wzmocnienie mnożnika zdjęć dla kanałów zielonych, czerwonych i niebieskich.

Wybierz odpowiedni obiektyw do ustawień obrazowania przyżyciowego i korekcji dryfu. Zdefiniuj zakres stosu obrazów, uruchamiając tryb akwizycji podglądu, naciskając czerwony przycisk w oknie dialogowym kreatora pomiarów. Aby uzyskać dobre obrazy, zdefiniuj obszar i strukturę zainteresowania poprzez ustawienie ostrości.

Obserwując ekran, zmieniaj ostrość, przesuwając obiektyw, aż obraz zniknie i ustaw go jako zero. Ustaw pozycję celu jako ostatnią pozycję w kierunku osiowym. Następnie zmień ostrość w przeciwnym kierunku, przesuwając obiektyw w dół, aż obraz ponownie zniknie z ekranu.

Kliknij przycisk zatrzymania w lewym górnym rogu okna dialogowego kreatora pomiarów i ustaw rozmiar kroku na dwa mikrometry. Wybierz oś Pythona jako pierwsze urządzenie osi w oknie dialogowym kreatora pomiarów i wybierz opcję nie aktywuj trybu automatycznego zapisywania. Następnie zaznacz pole automatycznego zapisywania tylko na osi czasu.

Następnie naciśnij ikonę Python w oknie dostępnych urządzeń, aby otworzyć okno dialogowe Python. W ustawieniach osi okna dialogowego języka Python wprowadź sekcje od i do, a następnie wprowadź liczbę kroków. Przejdź do okna dialogowego XYZ stage Z i zwiększ zakres skanowania o 200 mikrometrów na obu końcach.

Aby to zrobić, wprowadź 200 mikrometrów na początku i minus 240 mikrometrów na końcu, a zakres zostanie automatycznie ustawiony na minus 440 mikrometrów. Otwórz okno dialogowe interfejsu użytkownika VivoFollow. Rozpocznij pobieranie obrazu, naciskając zielony grot strzałki w lewym górnym rogu okna dialogowego kreatora pomiarów.

Jeśli używana jest korekcja dryftu na żywo, poszukaj okna dialogowego, w którym pojawi się konfiguracja korekcji dryftu. Następnie ustaw używany kanał pozyskiwania tak, jak w odwołaniu do mobilnego punktu orientacyjnego. Wprowadź maksymalne przesunięcie korekcji w mikrometrach dodane do pierwszej i ostatniej pozycji Z, a następnie kliknij przycisk OK. Monitoruj bieżące przesunięcie dryfu w X, Y i Z w czasie rzeczywistym podczas akwizycji obrazu w oknie dialogowym front-end przepływu vivo i zatrzymaj akwizycję obrazowania po 35 minutach, gdy wymagany jest kolejny cykl ponownego wstrzyknięcia znieczulenia.

Wstrzyknąć połowę dawki mieszanki MMF i wznowić akwizycję obrazowania aż do zakończenia eksperymentu. To narzędzie umożliwia długoterminową akwizycję obrazu, umożliwia gromadzenie wysokiej jakości danych i nadaje się do śledzenia komórek w celu pomiaru prędkości. Jak pokazano bez korekcji dryftu, obszar zainteresowania stopniowo oddala się od widoku nagrywania, co wpływa na możliwość śledzenia komórek w celu analizy prędkości.

Jednak za pomocą oprogramowania do korekcji dryfu można nagrywać stabilne filmy, a więcej komórek można śledzić przez długi czas. Oprogramowanie do korekcji dryftu może również zapewnić wizualizację przesunięć X, Y i Z w czasie, które zostały skorygowane przez system. Mikroskopia wielofotonowa oferuje wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną do śledzenia leukocytów, w której można śledzić i monitorować etapy i prędkość migracji komórek.

Przygotowując naczynia poboczne do obrazowania wielofotonowego, konieczne jest uniknięcie uszkodzenia tętnic pobocznych. Przed obrazowaniem ważne jest, aby bezpiecznie zidentyfikować właściwą tętnicę poboczną. Dzięki tej nowej procedurze przyżyciowego obrazowania wielofotonowego tętnic obocznych możliwa jest analiza przylegania i wynaczynienia wszystkich komórek krwi in vivo poprzez zmianę etykiety przeciwciała.