Name: Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu w komórkach HeLa. Ta metoda pozwala badać wpływ mutacji w miejscach splicingowych i rozwijać terapie genowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze dla S.S. z National Institutes of Health (R21CA170786 i R01GM127464) oraz American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) oraz dla S.S. i W.M. z Valley Research Partnership Program (P1-4009 i VRP77). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Zhuang, Y., Weiner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+base+change+in+U1+snRNA+suppresses+a+5%27+splice+site+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation.</a> Cell. 46 (6), 827-835 (1986).</li>
<li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mis-splicing+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA mis-splicing in disease.</a> Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).</li>
<li>Ward, A. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathobiology+of+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The pathobiology of splicing.</a> Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).</li>
<li>Scalet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-causing+variants+of+the+conserved+%2B2T+of+5%27+splice+sites+can+be+rescued+by+engineered+U1snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutatation%22%5BJournal%5D)">Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs.</a> Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).</li>
<li>Yamazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+small+nuclear+RNA+for+rescue+from+exon+7+skipping+caused+by+5%27-splice+site+mutation+of+human+cathepsin+A+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene.</a> Gene. 677, 41-48 (2018).</li>
<li>Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+nuclear+RNA-mediated+modulation+of+splicing+reveals+a+therapeutic+strategy+for+a+TREM2+mutation+and+its+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation.</a> Science Reports. 8 (1), 6937(2018).</li>
<li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).</li>
<li>Donadon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-specific+U1+snRNAs+improve+ELP1+exon+20+definition+and+rescue+ELP1+protein+expression+in+a+familial+dysautonomia+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).</li>
<li>Dominski, Z., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+splice+sites+in+pre-mRNAs+with+short+internal+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons.</a> Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).</li>
<li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li>
<li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position+%2B3+of+donor+splice-sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li>
<li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li>
<li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSteitz%2C+JA+%22Functions+of+the+abundant+U-snRNPs.+Structure+and+function+of+major+and+minor+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%22">Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles</a>. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).</li>
<li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5%27+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li>
<li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+recognition+of+5%27+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li>
<li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+atypical+5%27+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li>
<li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splice-switching+small+molecules%3A+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li>
<li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li>
<li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test można dostosować do analizy splicingu w liniach komórkowych innych niż HeLa, jednak czynniki wpływające na wydajność transfekcji, takie jak zbieganie się komórek i ilość DNA, mogą wymagać optymalizacji. Stosunek reportera do konstruktu U1 jest kolejnym krytycznym parametrem, który może wymagać określenia w zależności od poziomów ekspresji obserwowanych w innych typach komórek. Jakość wyekstrahowanego RNA ma kluczowe znaczenie dla analizy splicingu; dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie wody wolnej od RNaz i odk...

Splicing pre-mRNA jest niezbędnym etapem przetwarzania, który usuwa niekodujące introny i precyzyjnie liguje kodujące egzony do dojrzałego mRNA. Rozpoznanie sekwencji konsensusu w połączeniach egzon-intron, określanych jako miejsce 5′-splicingu i miejsce 3′-splicingu, przez elementy maszyny do splicingu inicjuje proces splicingu. Mała rybonukleoproteina jądrowa U1 (snRNP) rozpoznaje miejsce 5′-splicingu poprzez parowanie zasad snRNA U1 z klasą pre-mRNA1. Genetycznie dziedziczone mutacje, które zmieniają sekwencje miejsc splicingu 5′, są związane z wieloma chorobami2,3. Przewiduje się, że utrata parowania zasad snRNA U1 ze zmutowanymi miejscami splicingu 5′ powoduje nieprawidłowe splicing, co może zagrozić translacji dotkniętego transkryptu. Potencjalne podejście terapeutyczne do korygowania defektów splicingu polega na tłumieniu mutacji przez zmodyfikowane snRNA U1 przenoszące kompensacyjne zmiany nukleotydowe w regionie 5′, który łączy się w pary z miejscem splicingu 5′. Stwierdzono, że takie zmodyfikowane snRNA U1, określane również jako snRNA U1 specyficzne dla eksonu, są skuteczne w odwracaniu defektów splicingu, co skutkuje zwiększoną ekspresją białka z uratowanego mRNA4,5,6,7,8.
Tutaj opisujemy test komplementacji U1 snRNP, test splicingu komórkowego oparty na reporterze, który pozwala ocenić wpływ mutacji 5′-ss na splicing eksonu i może być również wykorzystany do rozwoju zmodyfikowanych snRNA U1, aby umożliwić uratowanie inkluzji eksonu. Udostępniamy również protokoły monitorowania splicingowanych transkryptów reporterowych przez rozszerzenie startera i RT-PCR oraz do oznaczania ekspresji zmodyfikowanych snRNA U1 przez rozszerzenie startera i RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik Woda dejonizowana</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet proszku Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), Źródło australijskie, inaktywowany termicznie</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P / S)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, roztwór wzorcowy 1,0N</td><td>Kwas solny Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>, certyfikowany ACS Plus, 36,5 do 38,0%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe filtry do butelek PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sól disodowa dwuwodna</td><td>Amresco</td><td>0105-2,5KG</td><td></td></tr><tr><td>2,5% trypsyna (10x), bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Odczynnik Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do chlorku potasu</td><td>Fisher</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Disodium Wodorofosforan Siedmiowodny</td><td>Bioreagent Fishera</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Bioreodczynnik Fishera</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka transfekcyjna - Opti-MEM&handel; I Zredukowana pożywka w surowicy, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji - Lipofectamine&handel; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Odczynnik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (ok. 0,75% etanolu jako konserwant/biologia molekularna)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absolutny (200 dowodów), klasa biologii molekularnej, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, klasa biologii molekularnej, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen (5 mg / ml)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miniprzygotowawczy Direct-zol RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Ołów, 1 mCi</td><td></td> Kinaza polinukleotydowa <td>PerkinElmer</td> NEG035C001MC <td></td></tr><tr><td>T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Wykluczenie rozmiaru beands - Sephadex&reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>Wykluczenie rozmiaru mini kolumny</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>Marker o niskiej masie cząsteczkowej, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki inaktywujące rnazę - RNaseZAP&trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM szt.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza - M-MLV Odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>stosowany do przedłużania startera</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Losowe heksamery (50 &mikro; M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka do PCR w czasie rzeczywistym - SYBR&trade; Wybierz Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade; III Odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>używany do otrzymywania cDNA</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X bufor pierwszej nici</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Formamid (&ge; 99,5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>Review Karty charakterystyki substancji niebezpiecznej</td></tr><tr><td>Sól sodowa błękitu bromofenolowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (białe kryształy lub krystaliczny proszek/biologia molekularna)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy (krystaliczny/ Elektroforeza)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid: Bis-Akrylamid 19:1 (40% roztwór/elektroforeza)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>Review Karty charakterystyki</td></tr><tr><td>Mocznik (bezbarwne do białych kryształy lub krystaliczny proszek/mol. Biol.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Peroxodisiarczan amonu (APS) &ge; 98%, Pro-Pure, Klasa proteomiczna</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED) &ge; 99%, Ultrapure</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>Review Karty charakterystyki substancji niebezpiecznej</td></tr><tr><td>Regulowane systemy żelowe do płyt, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Zestawy płytek szklanych, 16,5 x 14,5 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>Pionowa folia żelowa i handel; Zestawy płytek szklanych, 16,5 x 22,0 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>Pionowa owijka żelowa i handel; Zestawy płyt szklanych, 16,5 x 38,7 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE Ekrany fosforowe do przechowywania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&trade; FLA 7000 Obrazownik biomolekularny</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 Licznik scyntylacyjny cieczy</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dotykowy termocykler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Systemy PCR w czasie rzeczywistym</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Podczas ekspresji genów, kluczowym etapem splicingu pre-mRNA jest dokładne rozpoznanie miejsc splicingu i efektywne składanie kompleksów spliceosomalnych w celu połączenia eksonów i usunięcia intronów przed cytoplazmatycznym eksportem dojrzałego mRNA. Wydajność splicingu może być zmieniona przez obecność mutacji w miejscach splicingu, wpływ trans-działających czynników splicingowych lub aktywność środków terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół testu komórkowego, który można zastosować do monitorowania wydajności splicingu dowolnego eksonu. Test wykorzystuje adaptowalny reporter minigenu 3-eksonu/2-intronu kodowany plazmidem, który może ulegać ekspresji w komórkach ssaków przez transfekcję przejściową. Po transfekcji izoluje się całkowity komórkowy RNA, a skuteczność splicingu eksonów w reporterowym mRNA określa się albo przez wydłużenie startera, albo półilościową reakcję łańcuchową polimerazy odwrotnej transkryptazy (RT-PCR). Opisujemy, w jaki sposób można określić wpływ mutacji 5′ splicingu związanych z chorobą, wprowadzając je do reportera; oraz w jaki sposób tłumienie tych mutacji można osiągnąć poprzez kotransfekcję z konstruktem U1 z małym jądrowym RNA (snRNA) przenoszącym mutacje kompensacyjne w regionie 5′, który łączy się w pary z miejscami splicingu 5′ w połączeniach egzon-intron w pre-mRNA. W ten sposób reporter może być wykorzystany do projektowania terapeutycznych cząstek U1 w celu poprawy rozpoznawania zmutowanych miejsc splicingu 5′. Wprowadzenie miejsc regulatorowych działających cis, takich jak sekwencje wzmacniacza splicingu lub tłumika, do reportera można również wykorzystać do zbadania roli U1 snRNP w regulacji, w której pośredniczy określony alternatywny czynnik splicingowy. Wreszcie, komórki wykazujące ekspresję reporterową można inkubować z małymi cząsteczkami w celu określenia wpływu potencjalnych środków terapeutycznych na konstytutywny splicing pre-mRNA lub na eksony przenoszące zmutowane miejsca splicingu 5′. Ogólnie rzecz biorąc, test reporterowy może być stosowany do monitorowania wydajności splicingu w różnych warunkach w celu zbadania podstawowych mechanizmów splicingu i chorób związanych z splicingiem.

Reporter skrawania Dup51, minigen składający się z trzech eksonów i dwóch intronów, został wyprowadzony z ludzkiego genu β-globiny i został opisany wcześniej (Rysunek 1A)11,12 . Stworzyliśmy mutant reportera, Dup51p, wprowadzając mutacje miejsca skrawania 5´ powiązane z zespołem Ushera, które występują w eksonie 3 genu protokadheryny 15 (PCDH15)13. Sekwencja miejsca skrawania 5´ na złączeniu ekson 2-i...

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Protokół ten opisuje komórkowy test do monitorowania wydajności łączenia przy użyciu elastycznego reportera zarządzającego. Ten test reporterowy może być wykorzystany do badania skutków mutacji związanych z chorobą w miejscach Exxon lub splicingu oraz do projektowania terapii, w szczególności cząstek jednocząsteczkowych, w celu poprawy rozpoznawania zmutowanych miejsc splicingu w pięciu punktach. Pasaż w komórkach Hela odsysa zużytą pożywkę i inkubuje komórki z trzema mililitrami 0,2 5% tripów zawierających jeden milimolowy EDTA, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty.Po inkubacji w siedmiu mililitrach świeżego DMEM i przenieś zawiesinę komórek do 10 mililitrowej probówki. Odwirować komórki. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 10 mililitrach świeżego DMEM i umieść komórki na nowym naczyniu do hodowli tkankowej przy 20% konfluencji, w celu przejściowej transfekcji.Policz komórki hela za pomocą czystego szkiełka hemocytometrycznego i przygotuj zawiesinę o gęstości 2,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr, zasiew jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 12-dołkowej płytki i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessaj zużytą pożywkę i dodaj 800 mikrolitrów świeżego DMEM z surowicą do płytki. Przygotuj mieszanki do transfekcji i wiruj je przez 15 sekund.Następnie odwirować mieszanki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji dodać wszystkie 200 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do jednego dołka 12-dołkowej płytki komórkowej hela, aby uzyskać końcową objętość jednego mililitra na studzienkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Przygotowane reakcje znakowania są w fazie inkubacji.Ponownie zawieś 25-kilokilogramowe kulki wykluczające wielkość odcięcia masy cząsteczkowej daltona, delikatnie wirując przez 10 sekund. Następnie przenieś 600 mikrolitrów zawieszonych kulek do jednorazowej mini kolumny, umieszczonej w 1,5 mililitrowej probówce zbiorczej i przywróć zapas kulek do czterech stopni Celsjusza. Odwirować kolumnę i odrzucić przepływ, który przez nie przepływa.Następnie umyj kulki dwukrotnie, dodając do kolumny 300 mikrolitrów wody wolnej od RNA. Po drugim płukaniu przenieś mini kolumnę do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj mieszaninę reakcji kinazy do kolumny. Odwirować kolumnę i zebrać przepływ zawierający oligonukleotydy znakowane P32.Dodaj dwa mikrogramy RNA wyekstrahowanego z komórek heli do 200 mikrolitrowych mikroprobówek wirówkowych i dodaj wodę wolną od RNA, aby uzupełnić objętość do 6,55 mikrolitrów. Następnie dodać 0,9 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej probówki PCR zawierającej próbki RNA i inkubować probówki najpierw w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie na lodzie przez jedną minutę. Następnie w 2,55 mikrolitra, mieszanka główna dwa, do każdej probówki zawierającej RNA i mieszaj główną jedną i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Po inkubacji przenieść probówki do termocyklera i inkubować najpierw w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po inkubacji dodać 10 mikrolitrów barwnika ładującego 2X formamid RNA do każdej próbki i przystąpić do oddzielania fragmentów według strony UIA. Synteza DNA Percy'ego.Dodaj dwa mikrogramy RNA wyekstrahowanego z przeciętych komórek hela do 200 mikrolitrowych probówek wirówek mikrolitrowych i dodaj wodę wolną od RNA, aby uzupełnić objętość do niskich 11 mikrolitrów. Następnie dodaj dwa mikrolitry, mieszankę wzorcową po jednym do każdej próbki i inkubuj najpierw w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie na lodzie przez jedną minutę. Następnie dodaj siedem mikrolitrów, mieszankę wzorcową po dwie do każdej probówki i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut i 70 stopni Celsjusza przez 15 minut.Następnie, w przypadku PCR, rozcieńczyć reakcję C DNA, aby uzyskać stężenie 100 nanogramów na mikrolitr i przenieść jeden mikrolitr każdej próbki CDNA do nowych probówek PCR. Dodać 10,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej probówki zawierającej CDNA i przeprowadzić PCR. Korzystanie z termocyklera Po zakończeniu PCR.Dodaj 12,5 mikrolitra 2X barwnika ładującego DNA formamidu do każdej probówki. Podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut i przystąp do wykonania strony UIA. Odpipetować pięć mikrolitrów rozcieńczonego CDNA do indywidualnych studzienek 96-dołkowej płytki qpcr trzykrotnie.Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszanki PCR w czasie rzeczywistym do każdej studzienki, uszczelnij płytki folią optyczną i odwiruj, aby zebrać reakcje na dnie studzienek, a następnie wykonaj qpcr, zbierając progowe wartości cyklu kwantyfikacji docelowego amplikonu. Przed załadowaniem markerów i próbek należy przepłukać studzienki buforem TBE w celu usunięcia osiadłego mocznika. Następnie załaduj 10 mikrolitrów każdej próbki do dołka i uruchom żel przy napięciu od 300 do 500 woltów przez dwie do trzech godzin lub do momentu, gdy ksylen dotrze do dna.Po elektroforezie wyjąć szklane płytki z aparatu do elektroforezy i ostrożnie oddzielić dwie płytki tak, aby żel leżał płasko na dowolnej powierzchni szkła, następnie przenieść żel na bibułę filtracyjną i przykryć folią, za pomocą suszarki do żelu suszyć próżniowo żel w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut, Następnie umieść wysuszony żel w kasecie do obrazowania luminoforowego w celu inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Po ekspresji w komórkach hela, reporter krojenia dup 51 minnijean wyraża dojrzały transkrypt o pełnej długości, w którym Exxon dwa jest skutecznie spleciony. Pięć głównych mutacji w miejscu splicingu i dup 51 P redukują inkluzję Exxon two z 95 do 30%, co prowadzi do powstania krótszego transkryptu.Koekspresja dup 51 P z U15A SNRNA ratuje splicing Exxon two i przywraca tworzenie transkryptu o pełnej długości. W przeciwieństwie do tego, koekspresja z dzikim typem U1 lub wariantem U15G nie ma podobnego wpływu na splicing dup 51P. Wykrywanie transkryptów wariantu U15A, przez pierwotne rozszerzenie, wykorzystuje U1 od siedmiu do 26 nukleotydów oligonukleotydowych, który ma 20 nukleotydów długości i par zasad w pobliżu adeniny w piątej pozycji SNRNA U1.W obecności samego DATP, U1 od siedmiu do 26 pozwala na włączenie dwóch do trzech nukleotydów dla endogennego dzikiego typu U1 SNRNA, dając produkt o długości 22 lub 23 nukleotydów. W przypadku wariantów U15A i U15G wydłużenie kończy się po dodaniu pojedynczej adenozyny, w wyniku czego powstaje produkt składający się z 21 nukleotydów. Po normalizacji do ekspresji U2 SNRNA, transfekowane warianty U1 U1 typu dzikiego 5g i U15A ulegały ekspresji od trzech do pięciu razy w stosunku do endogennego SNRNA.Jakość wyekstrahowanego RNA ma kluczowe znaczenie dla analizy splicingu. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie wody wolnej od RNA i odkażanie usług środkami inaktywującymi RNA. Opisany tutaj system raportów może być zastosowany do badania roli RNA SN U1 w regulacjach splicingu w celu odwrócenia efektu mutacji splicingu flash price w celu wyciszenia genów za pomocą zmodyfikowanych RNA U1SN.

a-reporter-based-cellular-assay-for-monitoring-splicing-efficiency

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano protokół przygotowania stabilnych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa w małej skali. Protokół ten jest wartościowy dla analiz wymagających użycia niewielkich populacji komórek, takich jak komórki poddane działaniu leków lub RNAi. Metoda powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie analiz ekspresji genów oraz w przypadku innych typów komórek, w tym komórek pobranych od pacjentów.

Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.

Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

SINEUPs to syntetyczne, antysensowne, niekodujące RNA, które zawierają domenę wiążącą (BD) i domenę efektorową (ED) oraz regulują w górę translację docelowego mRNA. W tym miejscu opisujemy metody wykrywania SINEUP w hodowanych liniach komórkowych, analizę ich aktywności promującej translację za pomocą Western-blot oraz półautomatyczny system obrazowania o wysokiej przepustowości.

Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Poznaj test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu w komórkach HeLa. Ta metoda pozwala badać wpływ mutacji w miejscach splicingowych i rozwijać terapie genowe.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Przeglądaj więcej filmów