Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Zindywidualizowaną terapię u pacjentów z mukowiscydozą można osiągnąć za pomocą modelu choroby in vitro, aby zrozumieć aktywność CFTR na początku badania. Ludzkie organoidy nabłonkowe nosa lub organoidy HNE wytwarzają światła o różnych rozmiarach, które korelują z aktywnością CFTR, rozróżniając organoidy CF i bez mukowiscydozy. Tutaj szczegółowo opisaliśmy metodologię hodowli i obrazowania tych organoidów HNE.

Dysfunkcyjny transport jonów nabłonkowych, szczególnie chlorków i wodorowęglanów, powoduje zmniejszenie objętości płynów wyściełających nabłonek. Wpływa to również na wydzielinę śluzu, prowadząc do śluzowicy i niedrożności. Dlatego nasz model HNE został opracowany do różnych zastosowań, w zależności od projektu eksperymentalnego i zasobów badacza.

Oprócz oceny aktywności CFTR na początku badania lub w odpowiedzi na terapię, technika ta może być również stosowana w innych chorobach związanych z funkcjonowaniem komórek nabłonka, zwłaszcza transportu płynów w komórkach nabłonka. Metody te zostały opracowane przede wszystkim do stosowania w badaniach nad mukowiscydozą. Inne badania oceniające nabłonek dróg oddechowych, takie jak pierwotna dyskineza rzęsek, mogą również uznać te metody za pomocne.

Techniki te wymagają dbałości o szczegóły i precyzji. Wymagają również uważnej obserwacji, aby upewnić się, że początkowa ekspansja komórek jest odpowiednia. Monitoruj wszystkie kultury każdego dnia, a sukces będzie bardziej prawdopodobny.

Na początek zdysocjuj biopsję szczoteczki do nosa na 8 mililitrów pożywki RPMI w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, kilkakrotnie przepuszczając szczoteczkę cytologiczną przez jednomililitrową końcówkę pipety o dużej średnicy. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach roztworu do oddzielania komórek.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 16 minut do strawienia. Użyj pięciu mililitrów pożywki eksplatacyjnej, aby dwukrotnie umyć komórki. Następnie dodaj je do kolby T75, wstępnie wysianej napromieniowanymi, inaktywowanymi i 50 do 60% zbiegającymi się fibroblastami 3T3.

Pozwól komórkom na wspólną hodowlę i ekspansję w pożywce ekspansyjnej przez 7 do 14 dni. Jeśli antybiotyki zostały wprowadzone do komórek pochodzących od pacjentów z mukowiscydozą, pożywka powinna zostać zastąpiona pożywką ekspansyjną wolną od antybiotyków po pierwszych trzech dniach hodowli i może kontynuować zmianę pożywki co dwa dni, aż do uzyskania 80% zlewu. Umyj komórki 1x DPBS.

Następnie dodaj 1,5 mililitra 0,05% trypsyny-EDTA do kolby T75 i inkubuj przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć napromieniowany i inaktywowany fibroblast 3T3 z hodowli. Przepłukać kolbę T75 dwukrotnie 1x DPBS, aby dokładnie zmyć wszelkie pozostałe fibroblasty 3T3. Dodać 1,5 mililitra 0,05% trypsyny-EDTA do kolby T75 i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu odłączenia HNE.

Zneutralizuj trypsynę inhibitorem trypsyny sojowej w stosunku jeden do jednego. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy przez pięć minut. Następnie wyrzuć supernatant i przemyj komórki pięcioma mililitrami pożywki eksplatacyjnej.

Komórki są teraz gotowe do wysiewu w celu wyhodowania organoidów. Rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową hodowli organoidów lub ECM przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Schłodzić 15-dołkowe szkiełka angiogenezy przez noc w tej samej temperaturze.

Następnie schłodzić końcówki pipet do temperatury czterech stopni Celsjusza. Posmaruj szkiełka pięcioma mikrolitrami zimnego 100% ECM na lodzie. Umieść je w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut w celu konsolidacji.

Policz HNE zebrane z kokultury za pomocą hemocytometru. Następnie rozcieńczyć komórki do 500 komórek na mikrolitr w całkowitej liczbie, przy czym 20% ECM rozcieńczyć pożywką różnicującą na lodzie. Wyjąć szkiełka z powłoką ECM z inkubatora i wysiać pięć mikrolitrów mieszaniny ECM z zimnymi komórkami do każdego z dołków.

Natychmiast przenieść szkiełka do inkubatora hodowlanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę, aby skonsolidować mieszaninę komórek ECM. Następnie wyjmij szkiełka z inkubatora i wprowadź komórki do każdej studzienki z 15-dołkowych szkiełek angiogenezy z 50 mikrolitrami pożywki różnicującej. Włóż szkiełko z powrotem do inkubatora hodowlanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zmieniając pożywkę co drugi dzień, aż organoidy będą gotowe do dalszych eksperymentów.

Wstępnie potraktuj 8-dołkowe szkiełka komory ze szklanym dnem klejem komórkowym przez 30 minut. Wylej roztwór i susz studzienki na powietrzu przez kolejne 30 minut. Następnie wyrzuć pożywkę z górnej części ECM, a następnie dodaj 50 mikrolitrów zimnego 1x PBS do każdej studzienki 15-dołkowych szkiełek na lodzie.

Pipetuj w górę i w dół trzy do pięciu razy, używając 200 mikrolitrów końcówki do pipety o dużej średnicy. Dozuj roztwór na środek studzienki szkiełek z 8 dołkami. Natychmiast usuń nadmiar płynu ze studzienek za pomocą pipety z cienką końcówką.

Następnie umieść szkiełko komory w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 40 minut, aby wzmocnić organoid przylegający do szklanego dna. Po 40 minutach delikatnie umyj organoidy dwukrotnie 1x PBS i utrwal je 300 mikrolitrami 4% paraformaldehydu w każdym dołku na 30 minut w ustawionej temperaturze pokojowej. Umyć dwukrotnie 1x PBS i przechowywać organoidy w 1x PBS ustawionym na cztery stopnie Celsjusza w celu barwienia immunologicznego przez okres do dwóch tygodni.

Aby zebrać organoidy do badań histologicznych, usuń pożywkę z kultury i dodaj 50 mikrolitrów zimnego jednego 1x PBS do każdej studzienki szkiełek na lodzie. Pipetuj w górę i w dół od trzech do pięciu razy za pomocą końcówki do pipety o dużej średnicy 200 mikrolitrów. Połącz wszystkie roztwory z 15-dołkowego szkiełka lub wkładek hodowlanych w 15-mililitrowej stożkowej probówce na lodzie.

Dostosuj całkowitą objętość roztworu w probówce do 10 mililitrów, dodając zimny 1x PBS. Odwirować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 300 razy g przez pięć minut. Następnie odessać supernatant i dodać 60 mikrolitrów ciepłego histożelu, aby wymieszać go z osadem organoidowym za pomocą 200-mikrolitrowej końcówki do pipety o dużej średnicy.

Zawiesinę należy natychmiast przenieść do formy histologicznej. Po zagęszczeniu histożelu w temperaturze pokojowej umieść blok formy w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Otwórz oprogramowanie i kliknij prawym przyciskiem myszy u dołu ekranu.

Następnie wybierz opcję Kontrolki analizy, a następnie Wyniki pomiarów automatycznych. Otwórz obraz organoidu i wybierz od 5 do 10 organoidów z widocznymi lumenami. Przytrzymaj obraz prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć menu i wybierz Wielokątny zwrot z inwestycji, aby obrysować pełny organoid, aby uzyskać całkowitą powierzchnię organoidu.

Następnie obrysuj światło, aby uzyskać obszar światła. Powtórz to dla pozostałych organoidów w studzience i wszystkich studzienek w badaniu. Na koniec wyeksportuj dane do programu Excel.

Podziel obszar światła przez całkowitą powierzchnię i uśrednij wszystkie organoidy z próbki, aby uzyskać wyjściowy współczynnik strumienia świetlnego. Obrazy w jasnym polu reprezentują HNE z udanej i nieudanej kolekcji próbek. HNE dobrze rosną w dużym skupisku.

W przeciwieństwie do tego, HNE słabo rosną w dwóch małych skupiskach otaczających napromieniowane komórki 3T3. Organoidy w szkiełku 15-dołkowym mają bardziej precyzyjne i ostrzejsze obrazy niż te we wstawce hodowlanej. Poza tym nie zaobserwowano istotnej różnicy morfologicznej w tych dwóch metodach hodowli.

Organoidy inne niż CF mają zazwyczaj większy prześwit i więcej płynu niż organoidy CF. Barwienie HNE w organoidach od osoby bez CF, F508del/F508del oraz barwienie immunofluorescencyjne rzęsek w organoidzie są pokazane na tych obrazach. Pokazano tutaj rzęski wybarwione acetylowaną tubuliną, przeciwciałem drugorzędowym znakowanym FITC oraz jądra znakowane DAPI.

Pokazano tutaj maksymalne obrazy projekcyjne dwóch reprezentatywnych organoidów za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego w całości i odpowiadające im trójwymiarowe obrazy rekonstrukcji. Pokazano śluz i rzęski w świetle organoidów. Obrazy graficzne reprezentują test obrzęku wywołany forskoliną w celu zbadania funkcji CFTR na pierwotnych komórkach nabłonka nosa.

Reprezentatywny eksperyment dawka-odpowiedź forskoliny u ochotników bez mukowiscydozy jest pokazany tutaj. Odpowiedź na dawkę FSK porównuje się ze średnią zmianą ułamkową po jednej godzinie w porównaniu ze zmianą po ośmiu godzinach, co sugeruje, że ośmiogodzinny test może powodować bardziej znaczącą różnicę w obrzęku między różnymi dawkami FSK niż te po jednej godzinie. Obszar pod krzywą może wykazywać niewielką różnicę w obrzęku w porównaniu ze średnią zmianą ułamkową po ośmiu godzinach.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że organoidy zostaną utracone podczas procesu zbierania, utrwalania i barwienia. Dlatego należy zachować skrupulatną ostrożność podczas każdego kroku i uzyskać wystarczającą liczbę numerów startowych, aby zapewnić sukces. Hodowla organoidów we wkładkach hodowlanych może pomóc w tym względzie, ponieważ techniki te są rozwijane.

W tym przypadku użyliśmy dostępnych na rynku odczynników i materiałów eksploatacyjnych, aby ułatwić ekspansję innym badaczom. Opracowano również test funkcjonalny, w którym wykorzystano popularne techniki mikroskopowe i bardziej specjalistyczny sprzęt.