Name: System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj metodę potrójnej hodowli komórkowej modelującą ludzką barierę krew-mózg z użyciem komórek śródbłonka, pericytów i astrocytów. Model ten umożliwia badanie transportu nanocząstek i penetracji mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została przyznana w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 764958, w ramach projektu NANOSTEM, innowacyjnej sieci szkoleniowej Marie Skłodowska-Curie (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Stypendium dla Clémence Deligne, Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies (SFCE), Stowarzyszenie "l'étoile de Martin" oraz Stowarzyszenie "Cassandra contre la leucémie".

Protokół został zatwierdzony przez francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (źródło: CODECOH DC2011-1321) oraz przez lokalną komisję rewizyjną (Béthune Maternity Hospital, Beuvry, Francja). W celu uzyskania komórek śródbłonka (EC) uzyskano pisemną i świadomą zgodę rodziców dawcy na pobranie krwi pępowinowej, zgodnie z francuskim ustawodawstwem. Perycyty zostały dostarczone przez profesora Takashi Kanda (Wydział Neurologii i Neurologii Klinicznej, Yamaguchi University Graduate School of Medicine, Ube, Japonia), które zostały wyizolowane zgodnie z Reference19. Pierwotne astrocyty ludzkiej kory mózgowej są kupowane od komercyjnego dostawcy (patrz tabela materiałów).
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla komórek śródbłonka 
	UWAGA: Komórki śródbłonka (EC) pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+ wyizolowanych z ludzkiej krwi pępowinowej, zgodnie z metodą opisaną przez Pedroso i wsp.20. Fenotyp śródbłonka EC jest opisany w Pedroso et al.20.
	<ol>
		<li>Hodować ludzkie EC przy użyciu pożywki z komórek śródbłonka uzupełnionej 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,5% gentamycyny i 1% suplementu wzrostu komórek śródbłonka (ECM) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>W przypadku subkulturacji EC, dwa dni przed ustawieniem modelu, posmaruj jedno naczynie 10 ml 2% żelatyny przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie zastąp je 20 ml ciepłego ECM. Rozmrozić jedną fiolkę EC zawierającą 1 milion komórek (komórki zostały ręcznie policzone zgodnie z opisem w kroku 2.3.3 przed zamrożeniem komórek) w wstępnie powlekanym naczyniu do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Po 3 godzinach w temperaturze 37 °C odnowić pożywkę i utrzymywać komórki aż do ustawienia trikultury w wilgotnej atmosferze w inkubatorze w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5 % CO2 i 21 %O2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla perycytów 
	UWAGA: Perycyty są izolowane z ludzkiego mózgu zgodnie z protokołem opublikowanym przez Shimizu et al.19, którego procedura izolacji jest zgodna z metodą opublikowaną przez Kanda et al.21 z modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Hoduj perycyty przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco uzupełnionego 4,5 g/l glukozy (DMEM HG), 10% FCS, 1% de penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>W przypadku podhodowli perycytów, pięć dni przed ustawieniem modelu, pokryj dwie szalki 8 ml / naczynie 100 μg / ml roztworu kolagenu typu I w 0,02 N kwasie octowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie umyj dwukrotnie RT DMEM HG. Rozmrozić jedną fiolkę z perycytami zawierającymi 1 milion komórek w stożkowej probówce zawierającej 10 ml ciepłej pożywki i odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 190 x g w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad w 10 ml ciepłej pożywki i wysiać nasiona w wstępnie pokrytych szalkach do hodowli komórkowych wypełnionych 15 ml ciepłej pożywki na naczynie. Pożywkę odnawia się po 3 dniach, a komórki są utrzymywane do momentu ustawienia trikultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i 21%O2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla astrocytów
	<ol>
		<li>Hoduj astrocyty przy użyciu pożywki astrocytów uzupełnionej 20% FCS, 1% suplementu wzrostu astrocytów i 1% roztworu penicyliny/streptomycyny (AM) (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>W celu subhodowli astrocytów, na tydzień przed ustawieniem modelu, należy pokryć jedną kolbę do hodowli komórek T75 10 ml poli-L-lizyny (PLL) o stężeniu 2 μg/cm2 (PLL) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i dwukrotnie przemyć sterylną wodą RT. Rozmrozić jedną fiolkę astrocytów zawierających 1 milion komórek w 20 ml ciepłej pożywki i nasiona w wstępnie powlekanej kolbie do hodowli komórek T75. 
		UWAGA: Komercyjnie uzyskane fiolki z komórkami potwierdzają obecność ~1 miliona komórek, więc liczenie komórek nie zostało tutaj przeprowadzone.</li>
		<li>Utrzymać komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 i 21%O2 . Pożywkę odnawia się po 24 godzinach, a następnie co 2 dni aż do zawiązania trikultury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ustawienie modelu potrójnej kultury
UWAGA: Montaż trzech typów komórek odbywa się tego samego dnia. Dzień przed ustawieniem trikultury należy wykonać powlekanie kolagenem typu I na odwróconych filtrach wsadowych (patrz tabela materiałów) i zasiać astrocyty w dołkach pokrytych PLL na 12-dołkowej płytce.
<ol>
	<li>Wysiewanie astrocytów w studzienkach
	<ol>
		<li>Pokryć studzienki 500 μl roztworu PLL o stężeniu 2 μg/cm2 zgodnie z opisem w kroku 1.3.2.</li>
		<li>Przemyć komórki raz 10 ml ciepłego buforu fosforanowego soli fizjologicznej - bez wapnia i magnezu 1X (1X PBS-CMF) (Tabela 1) przed inkubacją przez 3 minuty w temperaturze 37 °C z 10 ml ciepłego 20% roztworu trypsyny/EDTA (T/E) i mechanicznie odłączyć komórki od kolby. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki zawierającej 5 ml ciepłego, nierozcieńczonego FCS. 
		UWAGA: Zgodnie z protokołem dostawcy22, zbieranie astrocytów można zoptymalizować, umieszczając kolbę w inkubatorze na 1 minutę i stukając w kolbę, aby pomóc zakończyć odłączanie. Pozostałe komórki należy zebrać z 5 ml roztworu neutralizującego T/E i umieścić w stożkowej probówce zawierającej FCS.</li>
		<li>Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 20 °C przy 190 x g.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml ciepłego AM. Policz komórki, rozcieńczając 20 μl zawiesiny komórek w 80 μl 1X PBS-CMF przy użyciu ręcznej komory liczącej pod mikroskopem (patrz tabela materiałów). Umieść około 40 000 komórek/cm2 w każdej studzience pokrytej PLL w objętości 1,5 ml ciepłego AM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie perycytów na odwróconych filtrach wsadowych
	<ol>
		<li>Dodać 250 μl roztworu kolagenu typu I (100 μg/ml) na odwrócone wkładki filtracyjne, umieszczone na obrzeżach przykrytego naczynia o wysokości 25 mm (patrz tabela materiałów) za pomocą sterylnej pęsety. Pozostawić powłokę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach. 
		UWAGA: Zużyte naczynie musi być wystarczająco wysokie, aby zapewnić utrzymanie sterylności na zewnątrz okapu i unikać kontaktu roztworów na odwróconym filtrze z pokrywą naczynia.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć roztwór kolagenu typu I za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu zasysającego. Przemyć dwukrotnie 250 μl RT DMEM HG, a następnie ostrożnie usunąć cały roztwór z wkładanych filtrów. Pozostaw powlekane filtry wkładowe w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach do momentu wysiewu komórek. 
		UWAGA: Podczas procedury powlekania należy uważać, aby nie dotknąć filtra, aby uniknąć uszkodzenia membrany. Po pokryciu kolagenem typu I filtry wkładowe mogą być przechowywane przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W dniu ustawienia trikultury przemyj perycyty dwukrotnie 10 ml ciepłego 1X PBS-CMF i inkubuj komórki z 2 ml ciepłej trypsyny. Monitoruj działanie trypsyny, obserwując komórki pod mikroskopem. Gdy komórki zaczną się odłączać, usuń trypsynę i dodaj 5 ml ciepłego ECM przed mechaniczną dysocjacją.</li>
		<li>Policzyć komórki, rozcieńczając 20 μl zawiesiny komórek w 80 μl 1X PBS-CMF za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem i zasiać 44 500 komórek/cm2 na wstępnie powlekanych filtrach z odwróconym wkładem w objętości 250 μl. Przechowywać filtry wkładane w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w temperaturze poniżej 5% CO2 i 21%O2.</li>
		<li>Ostrożnie odwróć wkładki filtracyjne za pomocą sterylnej pęsety w 12-dołkowej płytce zawierającej 1,5 ml ciepłego ECM/studzienki. Filtry wtykowe są teraz gotowe do powlekania z drugiej strony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek śródbłonka na filtrach wsadowych
	<ol>
		<li>Pokryj górną stronę filtrów wkładowych 500 μl hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (1/48 v/v) (patrz tabela materiałów). Po 1 godzinie, w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i 21%O2 przemyć raz 500 μl RT DMEM HG.</li>
		<li>Przemyj raz 10 ml ciepłego 1X PBS-CMF i inkubuj komórki z 2 ml ciepłej trypsyny. Gdy komórki zaczną się odłączać, usuń trypsynę i dodaj 5 ml ciepłego ECM przed mechaniczną dysocjacją.</li>
		<li>Policz komórki, rozcieńczając 20 μl zawiesiny komórek w 80 μl 1X PBS-CMF za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem i zasiaj EC o gęstości 71 500 komórek/cm2 na wstępnie powlekanych filtrach wkładkowych w objętości 500 μl ciepłego ECM.</li>
		<li>Zastąp AM 1,5 ml ciepłego ECM / studzienki, a następnie przenieś filtry z wkładkami zasianymi (EC + perycyty) na dołki zawierające astrocyty.</li>
		<li>Umieścić systemy komórkowe trikultur w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 i 21 %O2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie hodowli trójkomórkowej w celu indukcji właściwości BBB 
	UWAGA: Do indukcji właściwości BBB w EC konieczne jest 6 dni potrójnej hodowli.
	<ol>
		<li>Odnawiać pożywkę co drugi dzień do 6 dnia, ostrożnie usuwając pożywkę z górnej i dolnej komory za pomocą szklanej pipety połączonej z systemem aspiracji.</li>
		<li>Szybko wymień na ciepły ECM w objętości 500 μl w górnej komorze i 1,5 ml w dolnej komorze i umieść komórki z powrotem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 i 21% O2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Walidacja fenotypu BBB
UWAGA: Po 6 dniach potrójnej hodowli, czasie niezbędnym do wywołania fenotypu BBB w ECs, ludzki model BBB jest gotowy do eksperymentów. Fizyczna integralność komórek śródbłonka podobnego do mózgu (BLEC) jest wizualizowana przez barwienie immunofluorescencyjne białek TJ oceniane za pomocą testu przepuszczalności do markerów integralności BBB. Walidacja fenotypu BBB obejmuje również analizę ekspresji genów/białek i funkcjonalność pomp wypływowych zgodnie z procedurą opisaną w Deligne et al., 23. Perycyty i astrocyty są wizualizowane za pomocą odpowiednich markerów barwienia zgodnie z procedurą opisaną w Deligne i wsp. 202023.
<ol>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Zamocuj filtry wkładowe i astrocyty w lodowatym metanolu/acetonie (50/50 v/v) na 1 minutę i umyj dwukrotnie RT 1X PBS-CMF.</li>
		<li>Ostrożnie oddziel filtr od wkładu, przecinając membranę za pomocą skalpela. Wykonaj immunocytochemię na błonie i studzienkach dennych zgodnie z Deligne et al.23. 
		UWAGA: Do etapu blokowania użyj 250 μl bufora blokującego SEA BLOCK (patrz Tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test integralności BBB
	<ol>
		<li>Ocenić integralność fizyczną BLEC za pomocą testu przepuszczalności przy użyciu markerów integralności BBB o różnych masach cząsteczkowych, takich jak fluoresceina sodu (NaF) i dekstran 20 kDa (FD20) (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić zgodnie z procedurą opisaną w Deligne et al.23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Funkcjonalność pompy Efflux
	<ol>
		<li>Oceń funkcjonalność glikoproteiny P (P-gp) i białka oporności na raka piersi (BCRP), mierząc wewnątrzkomórkową akumulację rodaminy 123 (R123) z i bez Elacridaru, inhibitora P-gp i BCRP (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić zgodnie z procedurą opisaną w Deligne et al.23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja genów i białek
	<ol>
		<li>Pobrać próbkę genów i białek na lodzie po szybkim umyciu komórek zimnym filtrem Ringera (RH) (Tabela 1). Przed pobraniem próbki EC zeskrob perycyty z odwróconych filtrów wsadowych20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Transport nanożelu
UWAGA: Aby oszacować przejście polimerowych nanożeli (NG) z komory luminalnej do abluminalnej modelu BLEC trikultury, 0,1 mg/ml roztworu NG dodano w 6 dniu na komorze luminalnej przez 24 godziny. Badane NG były fluorescencyjnie znakowanymi hydrożelami na bazie N-izopropylacrylamidu (NIPAM) o średniej wielkości 8-10 nm (patrz Tabela Materiałów).
<ol>
	<li>Zważyć nanożel w proszku i rozpuścić go w ECM w stężeniu 1 mg/ml. Sonikować roztwór przez 10 minut i filtrować za pomocą filtra PTFE 0,2 μm. 
	UWAGA: Przygotuj świeży roztwór gazu ziemnego w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Zmienić pożywkę w komorze luminalnej i dodać 50 μl roztworu gazu ziemnego do górnej komory, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mg/mL. 
	UWAGA: Wykonać rozcieńczenie 1:10 od oryginalnego roztworu.</li>
	<li>Po 24 godzinach inkubacji zebrać podwielokrotności z komór luminalowych (20 μl) i abluminalnych (200 μl) i umieścić je na czarnej płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Określić ilościowo fluorescencję za pomocą fluorescencyjnego czytnika wielopłytkowego (patrz tabela materiałów) z czarną 96-dołkową płytką, ustawiając długości fal wzbudzenia/emisji na 477/540 nm. Oblicz procent przecięcia odnoszący się do początkowego roztworu roboczego dodanego w czasie = 0 h (t0)6,15. 
	UWAGA: Aby przygotować 96-dołkową płytkę do pomiaru fluorescencji, dodać 200 μl roztworu z komory abluminalnej i 20 μl roztworu z komory luminalnej i preparatu t0 (dodać 180 μl ECM, aby osiągnąć końcową objętość 200 μL). Dołącz również krzywą kalibracyjną i ślepą próbkę do płytki odczytu. Parametry instrumentalne: Metoda detekcji - Fluorescencja, Pozycja optyczna - Góra, Typ odczytu - Punkt końcowy, Długość fali wzbudzenia - 477 nm, Długość fali emisji - 540 nm, Czułość - 100, Drąganie - Podwójny orbital przez 5 s.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+W+%22L.Advanced+science%22">L.Advanced science</a>. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937(2021).</li>
<li>Vashist, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogels+as+potential+drug+nanocarriers+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery.</a> Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).</li>
<li>Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+for+crossing+the+BBB+with+nanoparticles%3A+The+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).</li>
<li>Bernardo-Castro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+the+different+phases+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke.</a> Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482(2021).</li>
<li>Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+L-proline+based+thermoresponsive+and+pH-switchable+nanogel+as+a+drug+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle.</a> Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).</li>
<li>Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+crosslinked+nanogels%3A+An+NMR+study+of+the+effect+of+monomer+reactivity+on+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure.</a> Polymers. 11 (2), 353(2019).</li>
<li>Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9DSmart%E2%80%9D+polymer+nanogels+as+pharmaceutical+carriers%3A+A+versatile+platform+for+programmed+delivery+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics.</a> ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).</li>
<li>Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+biological+barriers+with+nanogels+to+improve+drug+delivery+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).</li>
<li>Basso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-based+drug+delivery+nanosystems+for+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors.</a> Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62(2018).</li>
<li>Harilal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+blood-brain+barrier%3A+A+hard+nut+to+crack+in+the+transportation+of+drug+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules.</a> Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).</li>
<li>Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+polymeric+nanovehicles+for+neural+stem+cell+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation.</a> Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood-brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+in+vitro+techniques+for+blood-brain+barrier+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).</li>
<li>Shimizu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+pericytes+modify+the+blood-nerve+barrier+function+and+tight+junctional+molecules+through+the+secretion+of+various+soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).</li>
<li>Pedroso, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival%2C+vascular+differentiation+and+wound+healing+potential+of+stem+cells+co-cultured+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells.</a> PLoS One. 6 (1), 16114(2011).</li>
<li>Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+bovine+endothelial+cells+of+endoneurial+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin.</a> Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).</li>
<li>Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources">https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources</a> (2021).</li>
<li>Deligne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+in+vitro+blood-brain+tumor+barrier+model+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+to+better+understand+the+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37(2020).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), 99733(2014).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+Physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+brain+pericytes+in+blood-brain+barrier+formation+and+maintenance%3A+A+transcriptomic+study+of+co-cultured+human+endothelial+cells+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 48(2020).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).</li>
<li>Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+reinforces+the+blood-brain+properties+in+a+serum+free+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).</li>
<li>Drolez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+relevant+in+vitro+blood-brain+barrier+model+to+investigate+pro-metastatic+features+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines.</a> PloS One. 11 (3), 0151155(2016).</li>
<li>Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+astrocytes+in+an+in+vitro+stroke+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).</li>
<li>Mysiorek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B1+activation+protects+brain+capillary+endothelial+cells+from+oxygen-glucose+deprivation-induced+hyperpermeability+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier.</a> Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Culot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+protection+as+a+possible+mechanism+for+the+protective+effects+of+NXY-059+in+preclinical+models%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study.</a> Brain Research. 1294, 144-152 (2009).</li>
<li>Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+co-culture+in+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+use+in+cancer+research%3A+Maintaining+an+appropriate+endothelial+monolayer+for+the+assessment+of+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration.</a> Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+Blood-Brain+Barrier+endothelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology.</a> BMC Neuroscience. 12, 40(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Leczenie chorób mózgu pozostaje wyzwaniem, biorąc pod uwagę trudność leków w pokonaniu bariery krew-mózg, aby dotrzeć do ich komórkowych i molekularnych celów w miąższu mózgu.
Opracowywanie leków na choroby mózgu wykazuje obecnie niski wskaźnik sukcesu, ponieważ większość leków wykazujących obiecujące wyniki w modelach przedklinicznych nie wykazała żadnych korzyści, gdy była stosowana w klinice. Zgodnie z "zasadą 3R", która ma na celu zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych do eksperymentów, opracowywane są modele b krew-mózg in vitro w celu badania patologii mózgu i przewidywania penetracji mózgu przez narkotyki29. Modele in vitro BBB zostały opracowane głównie z wykorzystaniem komórek zwierzęcych i stały się bardziej wyrafinowane w celu zwiększenia trafności uzyskanych wyników16. Jeden ze znaczących postępów w wykorzystaniu komórek ludzkich, który przynosi niezaprzeczalnie nowe spojrzenie i większą szczegółowość na poziomie komórkowym i molekularnym, do badania mechanizmów chorób u ludzi16. Opracowanie odpowiednich modeli wymaga jednak rozważenia poprawy ustawień modelu BBB in vitro oraz wiedzy uzyskanej dzięki modelom zwierzęcym. W związku z tym należy wziąć pod uwagę złożoność architektury bariery krew-krew i znaczenie komunikacji komórka-komórka w badaniu bariery krew-krew w warunkach fizjologicznych i patologicznych30.
Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę tworzenia pełnego modelu ludzkiego BBB in vitro , obejmującego trzy główne typy komórek BBB, bez ograniczeń dostępu do tkanki mózgowej. Jako system wielokomórkowy, indukcja i utrzymanie właściwości BBB, bez sztucznego użycia związków napinających, ale zamiast tego indukowane przez komunikację komórka-komórka, jest bardziej fizjologicznie istotne i zgodne z indukcją in vivo właściwości BBB31. W związku z tym poszanowanie chronologii protokołu ma zasadnicze znaczenie dla jego powodzenia. Co więcej, czasy inkubacji podczas ustawiania potrójnej hodowli i po połączeniu trzech typów komórek stanowią główne krytyczne etapy protokołu.
Właściwości BBB w EC są indukowane przez kokulturę z perycytami, jak opisano dla modelu kokultury24. W związku z tym hodowla perycytów na odwrotnej stronie filtra wkładowego jest najbardziej krytycznym punktem i wymaga ścisłego przestrzegania protokołu w przypadku ryzyka braku wystarczającej liczby perycytów do indukcji właściwości BBB. Po pierwsze, podczas procedury powlekania, a także wysiewu komórek, należy zwrócić uwagę, aby pokrywa szalki Petriego nie stykała się z powłoką, a także z podłożem po wysianiu komórek, aby zapewnić dobre pokrycie filtra i nie spowodować utraty komórek (kroki 2.2.1 i 2.2.4). Ponadto, po wysianiu perycytów, konieczne jest odczekanie wskazanego czasu na przyłączenie perycytów (krok 2.2.4) przed przywróceniem wkładki filtra w celu powlekania i wysiewu EC po drugiej stronie (kroki 2.2.5 i 2.3). Po wysianiu potrzeba sześciu dni, aby indukować właściwości BBB poprzez komunikację komórka-komórka (krok 2.4).
Model jest walidowany pod względem ograniczonej przepuszczalności (związanej z ustawieniem ścisłych połączeń), ponieważ EC modelu potrójnej hodowli wyświetlają wartości przepuszczalności dla markerów integralności BBB podobne do zwalidowanego modelu kohodowli, a także mierzone w zwalidowanych modelach zwierzęcych lub ludzkich 16,27,32. Co więcej, walidacja modelu BBB in vitro wymaga, oprócz ograniczonej przepuszczalności, odpowiedzi na inne typy komórek NVU oraz ekspresji funkcjonalnych receptorów i transporterów16. Ponadto model jest powtarzalny i wytwarza wiele filtrów wkładowych i studzienek do przeprowadzania licznych analiz (ekspresja genów i białek, barwienie fluorescencyjne, testy toksyczności) na każdym typie komórek z osobna, bez konieczności stosowania metody sortowania komórek.
Model został opracowany przy użyciu filtra o wielkości porów 0,4 μm, aby mieć po jednym typie ogniwa z każdej strony filtra wkładowego. System filtrów wpuszczanych pozwolił na badanie komunikacji między komórkami w warunkach fizjologicznych poprzez przeniesienie go na dobrze zawierające astrocyty. Obecność astrocytów w systemie stanowi wartość dodatnią w porównaniu z początkowym modelem kohodowli in vitro 24. Rzeczywiście, biorąc pod uwagę znaczenie astrocytów w fizjologii BBB, ten trzeci typ komórek pozwala na dalsze zrozumienie komunikacji komórka-komórka w obrębie BBB. Co więcej, system hodowli trójkomórkowej może być również badany w stanach patologicznych, takich jak udar, w których astrocyty odgrywają istotną rolę 33,34,35. Ponadto konstrukcja BLEC / perycytów po obu stronach filtra wkładowego może być łatwo umieszczona na innych typach komórek, aby naśladować stany patologiczne, takie jak rak mózgu23.
Wielkość porów filtra wkładanego może powodować ograniczenia w przypadku niektórych eksperymentów, takich jak transmigracja komórek przez barierę krew-mózg. Jednak opracowanie modelu o większym rozmiarze porów wymaga dostosowania protokołu w celu zapewnienia utworzenia fizjologicznej monowarstwy EC, a nie wielu warstw, co nie jest fizjologicznie istotne dla naśladowania BBB36.
Przydatność modelu została zademonstrowana za pomocą eksperymentu z transportem NGs, wykazując możliwość przeprowadzenia eksperymentu z transportem przy użyciu systemu wielokomórkowego. Niemniej jednak należy zdawać sobie sprawę z trudności związanych z posiadaniem związku lub cząsteczki kontrolnej do eksperymentu transportowego, o właściwościach porównywalnych z NG, ponieważ każda nanostruktura wykazuje unikalny zestaw właściwości (masa cząsteczkowa, ładunek, kształt, właściwości fizyczne, tworzenie korony białkowej).
Jednym z ograniczeń modelu jest brak naprężeń ścinających, które, jak wykazano, wpływają na różnicowanie EC i ekspresję białek TJ37. Jednak opracowanie systemu fluidycznego naśladującego naczynia włosowe mózgu jest wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność dodawania części płynnej, wymagającej określonego urządzenia, w systemie wielokomórkowym. Co więcej, dane urządzenie zwykle nie jest dostępne na rynku i nie pozwala na wiele powtórzeń, co sprawia, że systemy fluidyczne są mniej przystosowane do zastosowań o wysokiej przepustowości.
Podsumowując, ten potrójny system hodowli składający się z komórek ludzkich odtwarza in vitro architekturę bariery krew-mózg. Pozwala to na generowanie wielu wkładek, które można wykorzystać do obszernego przesiewania związków.

BBB, zlokalizowany na poziomie komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu (EC), kontroluje i reguluje dostęp do miąższu mózgu, co jest kluczowe dla utrzymania homeostazy mózgu i funkcji komórek nerwowych1,2. Jednak w przypadku patologii mózgu brak dostępu do miąższu mózgu stanowi realną przeszkodę w opracowaniu strategii terapeutycznych.
EC BBB posiadają złożony zestaw właściwości, w tym białka ścisłego połączenia (TJ), które uszczelniają przestrzeń międzykomórkową, związane z systemem pomp wypływowych, specyficznych transporterów i receptorów, które kontrolują szlak transkomórkowy1,2,3. Co więcej, wszystkie te właściwości są indukowane i utrzymywane dzięki komunikacji z perycytami osadzonymi w błonie podstawnej BBB EC oraz astrocytami, których końcowe stopy otaczają naczynia włosowate mózgu1,2,3. W związku z tym badanie BBB in vitro jest wyzwaniem, biorąc pod uwagę złożoność jego architektury i komunikację między różnymi typami komórek tworzących jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU)2. Co więcej, różne typy komórek mają kluczowe znaczenie dla indukcji i utrzymania właściwości BBB, a w konsekwencji wpływają na przewidywanie przejścia przez BBB. Różne strategie dostarczania leków do mózgu zostały już przetestowane przy użyciu dużego panelu taktyk mających na celu ominięcie ograniczonych właściwości BBB4. Ostatnio, wraz z postępem nanotechnologii, opracowywane są nowe materiały do zastosowań jako nośniki leków5,6. Oprócz większego obciążenia, zmniejszonej toksyczności i zwiększonej biodostępności leków, te nowe nanomateriały mogą być funkcjonalizowane pod kątem strategii konia trojańskiego, która przekracza barierę krew-mózg i jest specyficznie ukierunkowana na komórki w miąższu 5,6. Wśród różnych rodzajów ocenianych nanomateriałów, nanożele cieszą się dużym zainteresowaniem, głównie ze względu na ich właściwości koloidalne i zdolność do dostosowywania struktury chemicznej w celu wprowadzenia właściwości reagujących na bodźce7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Modele in vitro są teraz opracowywane do badań przedklinicznych z wykorzystaniem ludzkich komórek do przewidywania przenikania leków do mózgu16. Dostępne są różne ustawienia tych modeli, od monowarstw EC mózgu po wiele systemów komórkowych16. Biorąc pod uwagę znaczenie komórek NVU w indukcji i utrzymaniu bariery krew-mózg oraz skoordynowanej odpowiedzi na środowisko patologiczne, modele BBB in vitro muszą uwzględniać wszystkich tych protagonistów, aby poprawić trafność przewidywania2,17.
Obecna metoda opisuje tworzenie modelu potrójnej hodowli in vitro ludzkiego BBB, który jest w pełni rozwinięty z ludzkimi komórkami do badania specyficznych komórkowych i ludzkich mechanizmów molekularnych. Aby być fizjologicznie istotnym, model składa się z trzech głównych aktorów komórkowych BBB (EC, perycyty i astrocyty) niezbędnych do indukcji i utrzymania właściwości BBB, bez użycia związków napinających i wykazujących zestaw właściwości wymaganych do uznania za model BBB in vitro16,18. Model jest ustawiony w konfiguracji wyznaczającej przedział krwi i mózgu, odpowiedniej do badań przedklinicznych transportu leków i cząstek w celu przewidywania penetracji mózgu. Użyteczność modelu ilustruje pomiar transportu nanożeli polimerowych.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Astocyte Medium (AM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost astrocytów</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1852</td><td>Suplement wzrostu astrocytów jest dostarczany w zestawie AM.</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430293</td><td>100 mm x 20 mm; naczynie służące do rozmrażania EC i PC przed ustawieniem triculture</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 150 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430599</td><td>Wysokość tych szalek (25 mm) umożliwia wysiewanie PC w odwróconej wkładce w celu ustawienia modelu trikultury.</td></tr><tr><td>Kolagen I&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Ogon szczura&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka</td><td>w proszku ScienCell&nbsp;</td><td>1051</td><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka jest dostarczany w zestawie ECM.</td></tr><tr><td>Pożywka dla komórek śródbłonka (ECM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt płodowych&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G2500</td><td>2% żelatyna ze skóry świni w PBS-CMF</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>BiochromA6</td><td>A-2712</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>w proszku</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Merck</td><td>1002891000</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyty ludzkiej kory mózgowej</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1800-SC</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek Malasseza</td><td>vWR HECH40453702</td><td></td><td>Liczenie zostało przeprowadzone ręcznie.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Hydrożel na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0503</td><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny znajduje się w zestawach ECM i AM.</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>System Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPT0SRE</td><td>0,22 & mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Wkładka Transwell&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>0,4 & mikro; Filtr z poliwęglanu o dużych porach&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę/EDTA</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0113</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0103</td><td></td></tr><tr><td>Immunocytochemia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEA BLOCK bufor blokujący</td><td>ThermoScientific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 przeciwciało wtórne anty-myszy</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 przeciwciało drugorzędowe anty-królika</td><td>Thermofisher</td><td>A11036</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Claudin-5</td><td>InVitrogen</td><td>34-1600</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Desmin</td><td>Abcam</td><td>ab6322</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwglejowe fibrylarne białko fibrylarne</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwpłytkowe-&beta</td><td>Abcam</td><td>ab51090</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-VE-kadheryny</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe Anti-Zona Occludens-1</td><td>InVitrogen</td><td>61-7300</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Anti Blaknięcie z DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Ekspresja genów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,933,250</td><td></td></tr><tr><td>96 basenik wielopłytkowy</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>iSCRIPT</td><td>Biorad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz uszczelniający&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>Ekspresja białka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Laemli Sample Buffer</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td>Dodać 50 &mikro; L bMerkaptoetanolu do 950 &mikro; L buforu Laemmli i przechowywać w temperaturze -20°C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 próbką białka do oznaczenia.</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe przeciw rakowi piersi</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Obróbka wstępna 15 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4&deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Claudina-5</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>Obróbka wstępna 5 minut w 95&deg; C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4&deg; C</td></tr><tr><td>Transporter antyglukozy 1 przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Millipore</td><td>07-1401</td><td>Obróbka wstępna 5 minut w temperaturze 95&deg; C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4&deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne anty-myszy</td><td>Dako</td><td>P0447</td><td>Rozcieńczenie 1:5000 w TBS-Tween</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe anty-glikoproteiny</td><td>P Genetex</td><td>GTX23364</td><td>Obróbka wstępna 15 minut w RT pod mieszaniem; rozcieńczenie 1:400, 3 godziny w RT</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe anty-królika</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>Rozcieńczenie 1:8000 w TBS-Tween</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe antytransferyny</td><td>Abcam</td><td>ab84036</td><td>Obróbka wstępna 5 minut w temperaturze 95& C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4&deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe Anti-Zona occludens-1</td><td>Abcam</td><td>ab216880</td><td>Obróbka wstępna 5 minut w 95&deg; C; rozcieńczenie 1:1000, O.N. przy 4&deg; C</td></tr><tr><td>Kryterium TGX Gel&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>5678083</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie ECL Prime</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>RPN2236</td><td>Revelation rozwiązanie do trzymania w ciemności</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitora fospatazy 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fospatazy 3</td><td>Sigma</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Wzorce białek</td><td>Biorad</td><td>161-0373</td><td>Markery masy cząsteczkowej</td></tr><tr><td>RIPA 10x</td><td>Milipore</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Biorad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-Glycine</td><td>Biorad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Test</td><td></td> integralności <td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>BBB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluorescein</td><td>Ampresco</td><td>0681</td><td>&lambda; ex = 490 nm; &lambda; em= 525 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Elacridar</td><td>Sigma</td><td>SML0486</td><td>GF120918</td></tr><tr><td>FITC-Dekstran 20 kDa</td><td>Sigma</td><td>FD-20S</td><td>&lambda; ex = 490 nm; &lambda; em=&nbsp; 525 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma</td><td>R8004</td> <td>i lambda; ex = 501 nm; &lambda; em= 538 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>SynergyTM H1&nbsp;</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>Fluorescencyjny czytnik wielopłytkowy</td></tr><tr><td>Nanogel Transport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawka</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td> 1 <td>mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtr</td><td>FisherScientific</td><td>15161499</td><td>0,2 & mikro; m Filtr membranowy PTFE,</td></tr><tr><td>hydrożele na bazie N-izopropylacyloamidu (NIPAM) o średnicy 15 mm&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Nanożele (NG) użyte w badaniu zostały dostarczone przez naszego współpracownika z Queen Mary University London, Department of Chemistry. NG są kowalencyjnie znakowane cząsteczką fluorescencyjną (&lambda; ex = 477 nm; &lambda; em = 540 nm). NG są liofilizowane i wysyłane w postaci proszku, w tym stanie są stabilne w temperaturze pokojowej przez długi czas.</td></tr></tbody></table>

system potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

Dostarczanie leków do mózgu pozostaje wyzwaniem ze względu na bardzo specyficzne i ograniczające właściwości bariery krew-mózg (BBB), która kontroluje i ogranicza dostęp do miąższu mózgu. Jednak wraz z rozwojem nanotechnologii opracowano duże panele nowych nanomateriałów w celu usprawnienia dostarczania leków, co uwypukliło potrzebę niezawodnych mikrosystemów in vitro do przewidywania penetracji mózgu w ramach testów przedklinicznych. Oto prosta metoda stworzenia systemu mikrofizjologicznego do modelowania bariery krew-mózg przy użyciu wyłącznie komórek ludzkich. W swojej konfiguracji model składa się z potrójnej hodowli, w tym komórek śródbłonka podobnych do mózgu (BLEC), perycytów i astrocytów, trzech głównych aktorów komórkowych BBB niezbędnych do indukowania i regulowania właściwości BBB w bardziej fizjologiczny sposób bez konieczności stosowania związków zaciskających. Model opracowany w formacie 12-dołkowej płytki, gotowy po 6 dniach potrójnej hodowli, charakteryzuje się właściwościami fizycznymi, ekspresją genów i białek oraz służy do pomiaru transportu polimerowego nanożelu. Model może być wykorzystywany w szerokim zakresie eksperymentów w warunkach zdrowych i patologicznych i stanowi cenne narzędzie do przedklinicznej oceny transportu cząsteczek i cząstek, a także transportu między- i wewnątrzkomórkowego.

Konfiguracja ludzkiego modelu potrójnej hodowli BBB 
Protokół niezbędny do konfiguracji ludzkiego modelu BBB in vitro opisano na Rysunku 1; obejmuje on kolejne kroki, których kolejność musi być ściśle przestrzegana. Najpierw trzy typy komórek są hodowane indywidualnie w naczyniach do hodowli komórkowej (Rysunek 1A), a następnie są łączone w systemie filtrów wkładkowych. Konfiguracja potrójnej hodowli rozpoczyna się od wysiewu pierwszego typu komórek, astrocytów, do uprzednio powleczonego dołu. Następnego dnia perycyty i komórki śródbłonka (ECs) są wysiewane odpowiednio na uprzednio powleczone powierzchnie abluminalną i luminalną filtra wkładkowego. Filtr wkładkowy jest następnie przenoszony nad astrocyty. Model jest utrzymywany w hodowli przez 6 dni, co jest czasem niezbędnym do indukowania właściwości BBB w komórkach ECs, przy wymianie medium co drugi dzień zgodnie z opatentowanym modelem współhodowli24. Komórki ECs są następnie nazywane BLECs (Rysunek 1B).
Charakterystyka ludzkiego modelu BHE 
Potrójny model hodowli komórkowej został poddany charakterystyce pod kątem obecności zestawu właściwości specyficznych dla BHE. Przede wszystkim dane immunocytochemiczne potwierdziły ekspresję konwencjonalnych markerów, takich jak receptor czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β (PDGFR-β)25,26 oraz desmina dla perycytów i kwaśnego białka włókienstwa glejowego (GFAP)26 dla astrocytów (Rysunek 2A). Zatem po 6 dniach hodowli z perycytami i astrocytami, monowarstwa BLEC, wizualizowana za pomocą barwienia złączy przylegających na VE-Cadherin, wykazuje ciągłą lokalizację białek TJ, Claudin-5 i ZO-1, na granicach komórek (Rysunek 2A). Uformowanie się TJ koreluje z niskimi współczynnikami przepuszczalności parakomórkowej, zmierzonymi przy użyciu markerów integralności BHE o niskiej masie cząsteczkowej, tj. NaF (376 Da)16,27, oraz o wysokiej masie cząsteczkowej, tj. FD20 (20 kDa)27, co przedstawiono na Rysunku 2B. Wartości pomiarowe są porównywalne z walidowanymi modelami BHE in vitro wykorzystującymi to samo źródło EC23,24,28. Łącznie wyniki te podkreślają niską przepuszczalność parakomórkową monowarstwy BLEC w potrójnej hodowli, co jest charakterystyczne dla BHE in vivo. Dodatkowo wewnątrzkomórkowa akumulacja R123 w BLEC wykazała znaczny wzrost w obecności inhibitora pompy efflux Elacridar23,24 w porównaniu do warunków kontrolnych bez jego dodatku (Rysunek 2C). Wskazuje to na obecność aktywnych cząsteczek pomp efflux, mianowicie P-gp i BCRP, w komórkach BLEC.
Aby dokładniej scharakteryzować BLEC, zbadano ekspresję genów i poziom białek kluczowych cech BBB (Rycina 3). Dane uzyskane w modelu potrójnej hodowli porównano z walidowanym i opatentowanym modelem współhodowli składającym się z EC i pericytów24, który posłużył jako model kontrolny. Astrocyty stanowią trzeci typ komórek dodany do początkowego modelu współhodowli w modelu potrójnej hodowli. W konsekwencji analiza ekspresji genów (Rycina 3A) w BLEC w potrójnej hodowli, w porównaniu z BLEC we współhodowli, wykazała utrzymanie ekspresji kluczowych cech BBB, takich jak białka TJ (claudin-5 i zonula occludens-1) oraz pompy eflluksu (P-gp i BCRP), a także nadekspresję większości badanych transporterów BBB (transporter glukozy 1) i receptorów (receptor transferyny). Dane z ilościowego oznaczania białek (Rycina 3B) okazały się być zgodne z wynikami transkrypcyjnymi. Ogólnie rzecz biorąc, dane te potwierdzają pozytywną indukcję właściwości BBB w warstwie BLEC w potrójnej hodowli, podobnie jak w walidowanym modelu współhodowli. Podsumowując, model potrójnej hodowli wykazuje wymagane właściwości fizyczne i metaboliczne dla mikrofizjologicznego systemu in vitro służącego do modelowania BBB.
Zastosowanie w strategiach dostarczania leków – pomiar transportu nanżeli 
Aby ocenić możliwość wykorzystania modelu potrójnej hodowli do badania nowych strategii dostarczania substancji do mózgu, oceniono transport neutralnych NG na bazie NIPAM znakowanych fluorescencyjnie6,15. W czasie 0 min NG umieszczono w przedziale luminalnym w stężeniu 0,1 mg/mL (Rycyna 4A). Po 24 h inkubacji w przedziale abluminalnym stwierdzono obecność 5,82% NG (Rycina 4B), co dowodzi ich zdolności do przenikania przez BLECs.
Wyniki demonstrują przydatność modelu do pomiaru przepuszczalności małych i większych związków, opisanej za pomocą markerów integralności, oraz do oceny transportu nanomateriałów, takich jak polimerowe NGs.
<img alt="Schemat modelu bariery krew-mózg; komórki śródbłonka, perycyty, astrocyty; układ potrójnej hodowli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Przedstawienie krytycznych etapów przygotowania potrójnej hodowli in vitro model ludzkiej bariery krew-mózg. (A) Obrazy w kontraście fazowym trzech komponentów komórkowych modelu BBP: komórek śródbłonkowych (EC), pericytów (PC) i astrocytów (AC). Pasek skali = 250 µm. (B) Schematyczna i ilustracyjna oś czasu dla procesu tworzenia potrójnej hodowli ludzkiej BBB in vitro model. Podświetlone pole przedstawia procedurę powlekania odwróconego wkładu z filtrem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Model bariery krew-mózg: markery komórek śródbłonkowych (Ve-Cadh, CLD5, ZO1) i powiązane wyniki na wykresach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ocena właściwości potrójnego modelu kultur BBB. (A) Reprezentatywne obrazy immunobarwienia dla charakterystycznych markerów BLECs (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 i VE-Cadherin: Ve-Cadh), perycytów (Platelet-Derived Growth Factor Receptor-β: PDGFR-β i desmina) oraz astrocytów (Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP). Pasek skali = 10 µm. (B) Przepuszczalność parakomórkowa BLECs dla fluorescencyjnych markerów integralności BBB: fluoresceiny sodowej (NaF, 376 Da, Pe: 0.61 ± 0.062) i FITC-dekstranu (FD20, 20 kDa, Pe: 0.04 ± 0.005). N = 3; n = 9. Średnia ± SEM. (C) Funkcjonalność P-gp i BCRP w komórkach śródbłonka oceniono poprzez kwantyfikację wewnątrzkomórkowego R123 z dodatkiem (124.2% ± 3.39%) i bez dodatku (100% ± 8.79%) Elacridaru. N = 4; n = 12. Średnia ± SEM. p = 0.017 przy użyciu nieparzystego testu t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy ekspresji genów i białek; ko-kultura BBB ECs; CLD5, ZO1, GLUT1, TRFR, PGP, BCRP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ocena ekspresji genów BLEC i poziomu białek dla charakterystycznych markerów w modelu potrójnej kultury w porównaniu z modelem ko-kultury BBB. (A) Ekspresja genów białek połączeń szczelnych (Claudin-5: CLD5 i Zona Occludens-1: ZO1), transporterów (Transporter glukozy-1: GLUT1, Glikoproteina P: PGP oraz Białko oporności na raka piersi: BCRP) oraz receptorów dużych cząsteczek (Receptor transferryny: TRFR), znormalizowana względem ekspresji RPLP0. N = 3; n = 9. (B) Poziom białek połączeń szczelnych (CLD5 i ZO1), transporterów (GLUT1, PGP i BCRP) oraz receptorów dużych cząsteczek (TRFR), znormalizowany względem ekspresji β-aktyny. N = 3; n = 9. Średnia ± SEM. Dla (A) i (B) wartości &gt; 1 odpowiadają wyższej ekspresji genów lub wyższym poziomom białek w modelu potrójnej kultury. Czerwona linia odpowiada wartości 1, gdzie poziom ekspresji (genów lub białek) w obu modelach jest równoważny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat transportu nanogelu; układ oceny NP z wynikami fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pomiar transportu nanogelu w potrójnym modelu hodowli. (A) Schematyczny przedstawienie testu transportu nanogelu. (B) Procentowy transport nanogelu po 24 h inkubacji w potrójnym modelu hodowli (5,82% ± 0,09%). N = 2; n = 6. Średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2" rowspan="2">Nazwa buforu</td>
			<td colspan="3">Skład</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Uwaga</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Masa cząsteczkowa</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">Fosforanowy bufor solny, wolny od wapnia i magnezu</td>
			<td rowspan="5">PBS-CMF</td>
			<td >NaCl</td>
			<td >8 g/L</td>
			<td >58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="5">Dodać wszystkie składniki do sterylnej wody i odczekać do całkowitego rozpuszczenia. pH otrzymanego roztworu musi mieścić się w zakresie 7.3-7.4. Przefiltrować roztwór przez membranę 0.22 µm i przechowywać sterylny roztwór w temperaturze 4 °C.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td >0.2 g/L</td>
			<td >74.55</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >KH2PO4</td>
			<td >0.2 g/L</td>
			<td >136.09</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NaHPO4-12 H2O</td>
			<td >2.87 g/L</td>
			<td >358.14</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >woda</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="8">Ringer HEPES</td>
			<td rowspan="8">RH</td>
			<td >NaCl</td>
			<td >8.8 g/L</td>
			<td >58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="8">Dodać wszystkie składniki do sterylnej wody i odczekać do całkowitego rozpuszczenia. Dostosować pH do 7.4 (początkowe pH roztworu wynosi około 6.8). Przefiltrować roztwór przez membranę 0.22 µm i przechowywać sterylny roztwór w temperaturze 4 °C.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td >0.387 g/L</td>
			<td >74.55</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CaCl2</td>
			<td >0.244 g/L</td>
			<td >110.99</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >MgCl2 6H2O</td>
			<td >0.0406 g/L</td>
			<td >203.3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NaHCO3</td>
			<td >0.504 g/L</td>
			<td >84.1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >1.19 g/L</td>
			<td >238.3</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Glukoza</td>
			<td >0.504 g/L</td>
			<td >180.16</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >woda</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład różnych buforów użytych w protokole.

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Dostarczanie leków do mózgu pozostawało wyzwaniem. Opracowanie dużych paneli nowych nanomateriałów w celu poprawy ich dostarczania do mózgu podkreśla potrzebę stworzenia prawdziwego mikrosystemu in vitro do przewidywania penetracji mózgu w ramach testów przedklinicznych. Główną zaletą tej techniki jest zamrożenie wolnych komórek bólu bariery krew-mózg wewnątrz tego samego systemu, umożliwiając komunikację komórek komórkowych wymaganą do indukcji fenotypu bariery krew-mózg.Co więcej, każdy typ komórki można wyizolować osobno w celu dalszej analizy molekularnej. Model może być wykorzystywany w szerokim zakresie eksperymentów w warunkach zdrowych i patologicznych i stanowi cenne narzędzie do przedklinicznej oceny transportu cząsteczek i cząstek, a także transportu między- i wewnątrzkomórkowego. Procedurę zademonstrują dr Clemence Deligne i dr Eleonora Rizzi.Zacznij od zakodowania studzienek 500 mikrolitrami dwóch mikrogramów na centymetr kwadratowy roztworu poli-L-lizyny. Inkubować przez noc lub przez co najmniej godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć roztwór poli-L-lizyny szklaną pipetą podłączoną do systemu zasysającego. Następnie spłucz dwukrotnie sterylną wodą.Aby zebrać astrocyty, najpierw umyj astrocyty raz 10 mililitrami ciepłego 1X PBS CMF. Inkubuj je przez trzy minuty z 10 mililitrami ciepłego 20% roztworu 20% trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu. Mechanicznie odłączyć komórki od kolby i przenieść zawiesinę do stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów ciepłego, nierozcieńczonego FCS.Odwirować zawiesinę o stężeniu 190 razy G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach ciepłej pożywki astrocytowej, a następnie rozcieńczyć 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej 80 mikrolitrami 1X PBS CMF. Policz komórki za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem.Umieść około 40 000 komórek na centymetr kwadratowy w każdej wstępnie zakodowanej poli-L-lizynie w objętości 1,5 mililitra ciepłej pożywki astrocytowej. Umieść odwrócone filtry wkładkowe na obrzeżach przykrytego naczynia o wysokości 25 milimetrów i dodaj 250 mikrolitrów roztworu kolagenu typu pierwszego do filtrów wkładowych. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę.Następnie ostrożnie wyjmij roztwór kolagenu typu pierwszego za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu zasysającego. Przemyć dwukrotnie 250 mikrolitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć cały roztwór z wkładanych filtrów. Umyj perycyty dwukrotnie 10 mililitrami ciepłego 1X PBS CMF i inkubuj komórki z dwoma mililitrami ciepłej trypsyny.Obserwuj komórki pod mikroskopem, aby monitorować działanie trypsyny. Kiedy komórki zaczną się odłączać, usuń trypsynę, a następnie dodaj do komórek pięć mililitrów ciepłej pożywki podstawowej komórek śródbłonka lub ECM i rozpocznij dysocjację mechaniczną. Rozcieńczyć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek 80 mikrolitrami 1X PBS CMF i policzyć komórki za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem, jak pokazano wcześniej.Zasiej 44, 500 komórek na centymetr kwadratowy na wstępnie zakodowanych odwróconych filtrach wkładanych w objętości 250 mikrolitrów. Utrzymuj filtry wkładowe w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny w temperaturze poniżej 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu. Użyj sterylnej pęsety, aby ostrożnie włożyć filtry do 12-dołkowej płytki zawierającej 1.5 mililitra ciepłego ECM na studzienkę.Filtry wtykowe są teraz gotowe do powlekania z drugiej strony. Pokryj górną stronę i wkładzie filtry 500 mikrolitrami hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieść filtry wkładowe w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu na godzinę.Umyj je raz 500 mikrolitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze pokojowej. Umyj hodowlę komórek śródbłonka raz 10 mililitrami ciepłego 1X PBS CMF i inkubuj komórki z dwoma mililitrami ciepłej trypsyny. Usuń trypsynę, gdy komórki zaczną się odłączać, a następnie dodaj pięć mililitrów ciepłego ECM i rozpocznij mechaniczną dysocjację.Rozcieńczyć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek 80 mikrolitrami 1X PBS CMF i policzyć komórki za pomocą ręcznej komory liczącej. Zasiaj komórki śródbłonka o gęstości 71 500 komórek na centymetr kwadratowy na wstępnie zakodowanych filtrach wsadowych w objętości 500 mikrolitrów ciepłego ECM. Zastąp pożywkę astrocytów 1,5 mililitra ciepłego ECM na studzienkę.Następnie przenieś zasiane filtry wkładkowe do studzienek zawierających astrocyty. Umieść systemy komórkowe z trzema kulturami w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu. Ostrożnie zdjąć pożywkę z górnej i dolnej komory za pomocą szklanej pipety połączonej z systemem zasysania.Wymień pożywkę na ciepły ECM w objętości 500 mikrolitrów w górnej komorze i 1,5 mililitra w dolnej komorze. Odnawiaj pożywkę co drugi dzień aż do szóstego dnia, powtarzając tę samą procedurę. Na koniec umieść komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu.Dane immunocytochemiczne potwierdziły ekspresję konwencjonalnych markerów, takich jak receptor płytkowego czynnika wzrostu beta i Desmine dla perycytów oraz fibrylarne białko kwasowe gleju dla astrocytów. Stąd, po sześciu dniach hodowli z perycytami i astrocytami, monowarstwa komórek śródbłonka podobnych do mózgu lub BLEC uwidoczniona za pomocą adherentnego barwienia połączenia Ve-Kadheryny wykazuje ciągłą lokalizację białek TJ CLD5 i Z-01 na granicach komórek. Przedstawiono przepuszczalność parakomórkową BLECS dla fluorescencyjnych markerów integralności BBB, fluoresceiny sodu i dekstranu FITC.Wewnątrzkomórkowa akumulacja R123 w BLEC wykazała znaczny wzrost obecności inhibitora pompy wypływowej Elacridar w porównaniu z sytuacją kontrolną przy jego braku. Wskazuje to na obecność aktywnych cząsteczek pompy wypływowej, a mianowicie glikoproteiny P i białka oporności na raka piersi lub BCRP w BLEC. Pokazano tutaj ekspresję genów białek połączeń ścisłych, transporterów i receptorów wielkocząsteczkowych znormalizowaną przez ekspresję RPLP0.W tym przypadku wartości większe niż jeden odpowiadają wyższej ekspresji genów w modelu potrójnej hodowli. Czerwona linia odpowiada wartości jeden, w przypadku gdy poziom wyrażenia obu modeli jest równoważny. Reprezentatywny obraz pokazuje poziom białek połączeń ścisłych, transporterów, w receptorach wielkocząsteczkowych znormalizowanych przez ekspresję beta aktyny.Oceniono transport znakowanych fluorescencyjnie neutralnych polimerowych nanożeli na bazie NIPAM. W czasie zerowym polimerowe nanożele umieszczono w komorze oświetleniowej w stężeniu 0,1 miligrama na mililitr. Po 24 godzinach inkubacji w komorze abluminalnej znaleziono 5,82% polimerowych nanożeli, co dowodzi ich zdolności do przenikania przez BLEC.Kluczowe znaczenie ma prawidłowe powlekanie i wysiewanie perycytów na odwróconym filtrze. Ważne jest utrzymanie sterylności i integralności struktur, aby uniknąć zanieczyszczenia systemu hodowli komórkowych.

a-triple-culture-cell-system-modeling-the-human-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje współhodowlę komórek ludzkiego mózgu perycytów, astrocytów i śródbłonka. Każda warstwa komórkowa jest tworzona oddzielnie, a następnie hodowana razem, tworząc trójwarstwowy system, który naśladuje układ komórkowy bariery...

Opracowanie modelu potrójnej hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP) tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). Model in vitro BCSFB wykorzystuje ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). W artykule opisano hodowlę i infekcję podstawno-boczną komórek HIBCPP przy użyciu systemu wkładek filtrujących do hodowli komórkowych.

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Prezentujemy test fluorescencyjny, aby wykazać, że Lucyfer Żółty (LY) jest solidnym markerem do określenia pozornej przepuszczalności parakomórkowej monowarstw komórek hCMEC/D3, modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Użyliśmy tego testu do określenia kinetyki konfluentnego tworzenia się monowarstwy w hodowanych komórkach hCMEC / D3.

Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu potrójnej hodowli komórkowej bariery krew-mózg na podstawie pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego, astrocytów i perycytów ludzkiego mózgu. Ten wielokomórkowy model nadaje się do badań dysfunkcji jednostek nerwowo-naczyniowych podczas udaru niedokrwiennego in vitro lub do badań przesiewowych kandydatów na leki.

Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Poznaj metodę potrójnej hodowli komórkowej modelującą ludzką barierę krew-mózg z użyciem komórek śródbłonka, pericytów i astrocytów. Model ten umożliwia badanie transportu nanocząstek i penetracji mózgu.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów