System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Dostarczanie leków do mózgu pozostawało wyzwaniem. Opracowanie dużych paneli nowych nanomateriałów w celu poprawy ich dostarczania do mózgu podkreśla potrzebę stworzenia prawdziwego mikrosystemu in vitro do przewidywania penetracji mózgu w ramach testów przedklinicznych. Główną zaletą tej techniki jest zamrożenie wolnych komórek bólu bariery krew-mózg wewnątrz tego samego systemu, umożliwiając komunikację komórek komórkowych wymaganą do indukcji fenotypu bariery krew-mózg

Co więcej, każdy typ komórki można wyizolować osobno w celu dalszej analizy molekularnej. Model może być wykorzystywany w szerokim zakresie eksperymentów w warunkach zdrowych i patologicznych i stanowi cenne narzędzie do przedklinicznej oceny transportu cząsteczek i cząstek, a także transportu między- i wewnątrzkomórkowego. Procedurę zademonstrują dr Clemence Deligne i dr Eleonora Rizzi.

Zacznij od zakodowania studzienek 500 mikrolitrami dwóch mikrogramów na centymetr kwadratowy roztworu poli-L-lizyny. Inkubować przez noc lub przez co najmniej godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć roztwór poli-L-lizyny szklaną pipetą podłączoną do systemu zasysającego. Następnie spłucz dwukrotnie sterylną wodą.

Aby zebrać astrocyty, najpierw umyj astrocyty raz 10 mililitrami ciepłego 1X PBS CMF. Inkubuj je przez trzy minuty z 10 mililitrami ciepłego 20% roztworu 20% trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu. Mechanicznie odłączyć komórki od kolby i przenieść zawiesinę do stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów ciepłego, nierozcieńczonego FCS.

Odwirować zawiesinę o stężeniu 190 razy G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach ciepłej pożywki astrocytowej, a następnie rozcieńczyć 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej 80 mikrolitrami 1X PBS CMF. Policz komórki za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem.

Umieść około 40 000 komórek na centymetr kwadratowy w każdej wstępnie zakodowanej poli-L-lizynie w objętości 1,5 mililitra ciepłej pożywki astrocytowej. Umieść odwrócone filtry wkładkowe na obrzeżach przykrytego naczynia o wysokości 25 milimetrów i dodaj 250 mikrolitrów roztworu kolagenu typu pierwszego do filtrów wkładowych. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie ostrożnie wyjmij roztwór kolagenu typu pierwszego za pomocą szklanej pipety podłączonej do systemu zasysającego. Przemyć dwukrotnie 250 mikrolitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć cały roztwór z wkładanych filtrów. Umyj perycyty dwukrotnie 10 mililitrami ciepłego 1X PBS CMF i inkubuj komórki z dwoma mililitrami ciepłej trypsyny.

Obserwuj komórki pod mikroskopem, aby monitorować działanie trypsyny. Kiedy komórki zaczną się odłączać, usuń trypsynę, a następnie dodaj do komórek pięć mililitrów ciepłej pożywki podstawowej komórek śródbłonka lub ECM i rozpocznij dysocjację mechaniczną. Rozcieńczyć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek 80 mikrolitrami 1X PBS CMF i policzyć komórki za pomocą ręcznej komory liczącej pod mikroskopem, jak pokazano wcześniej.

Zasiej 44, 500 komórek na centymetr kwadratowy na wstępnie zakodowanych odwróconych filtrach wkładanych w objętości 250 mikrolitrów. Utrzymuj filtry wkładowe w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny w temperaturze poniżej 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu. Użyj sterylnej pęsety, aby ostrożnie włożyć filtry do 12-dołkowej płytki zawierającej 1.5 mililitra ciepłego ECM na studzienkę.

Filtry wtykowe są teraz gotowe do powlekania z drugiej strony. Pokryj górną stronę i wkładzie filtry 500 mikrolitrami hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej. Umieść filtry wkładowe w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu na godzinę.

Umyj je raz 500 mikrolitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze pokojowej. Umyj hodowlę komórek śródbłonka raz 10 mililitrami ciepłego 1X PBS CMF i inkubuj komórki z dwoma mililitrami ciepłej trypsyny. Usuń trypsynę, gdy komórki zaczną się odłączać, a następnie dodaj pięć mililitrów ciepłego ECM i rozpocznij mechaniczną dysocjację.

Rozcieńczyć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek 80 mikrolitrami 1X PBS CMF i policzyć komórki za pomocą ręcznej komory liczącej. Zasiaj komórki śródbłonka o gęstości 71 500 komórek na centymetr kwadratowy na wstępnie zakodowanych filtrach wsadowych w objętości 500 mikrolitrów ciepłego ECM. Zastąp pożywkę astrocytów 1,5 mililitra ciepłego ECM na studzienkę.

Następnie przenieś zasiane filtry wkładkowe do studzienek zawierających astrocyty. Umieść systemy komórkowe z trzema kulturami w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu. Ostrożnie zdjąć pożywkę z górnej i dolnej komory za pomocą szklanej pipety połączonej z systemem zasysania.

Wymień pożywkę na ciepły ECM w objętości 500 mikrolitrów w górnej komorze i 1,5 mililitra w dolnej komorze. Odnawiaj pożywkę co drugi dzień aż do szóstego dnia, powtarzając tę samą procedurę. Na koniec umieść komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu.

Dane immunocytochemiczne potwierdziły ekspresję konwencjonalnych markerów, takich jak receptor płytkowego czynnika wzrostu beta i Desmine dla perycytów oraz fibrylarne białko kwasowe gleju dla astrocytów. Stąd, po sześciu dniach hodowli z perycytami i astrocytami, monowarstwa komórek śródbłonka podobnych do mózgu lub BLEC uwidoczniona za pomocą adherentnego barwienia połączenia Ve-Kadheryny wykazuje ciągłą lokalizację białek TJ CLD5 i Z-01 na granicach komórek. Przedstawiono przepuszczalność parakomórkową BLECS dla fluorescencyjnych markerów integralności BBB, fluoresceiny sodu i dekstranu FITC.

Wewnątrzkomórkowa akumulacja R123 w BLEC wykazała znaczny wzrost obecności inhibitora pompy wypływowej Elacridar w porównaniu z sytuacją kontrolną przy jego braku. Wskazuje to na obecność aktywnych cząsteczek pompy wypływowej, a mianowicie glikoproteiny P i białka oporności na raka piersi lub BCRP w BLEC. Pokazano tutaj ekspresję genów białek połączeń ścisłych, transporterów i receptorów wielkocząsteczkowych znormalizowaną przez ekspresję RPLP0.

W tym przypadku wartości większe niż jeden odpowiadają wyższej ekspresji genów w modelu potrójnej hodowli. Czerwona linia odpowiada wartości jeden, w przypadku gdy poziom wyrażenia obu modeli jest równoważny. Reprezentatywny obraz pokazuje poziom białek połączeń ścisłych, transporterów, w receptorach wielkocząsteczkowych znormalizowanych przez ekspresję beta aktyny.

Oceniono transport znakowanych fluorescencyjnie neutralnych polimerowych nanożeli na bazie NIPAM. W czasie zerowym polimerowe nanożele umieszczono w komorze oświetleniowej w stężeniu 0,1 miligrama na mililitr. Po 24 godzinach inkubacji w komorze abluminalnej znaleziono 5,82% polimerowych nanożeli, co dowodzi ich zdolności do przenikania przez BLEC.

Kluczowe znaczenie ma prawidłowe powlekanie i wysiewanie perycytów na odwróconym filtrze. Ważne jest utrzymanie sterylności i integralności struktur, aby uniknąć zanieczyszczenia systemu hodowli komórkowych.