Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Stworzono modele zwierzęce ex vivo i in vivo do badania mechanicznych i chemicznych uszkodzeń rogówki. Technika ta zapewnia naukowcom łatwą do zbudowania platformę do badania mechanicznych i chemicznych uszkodzeń rogówki. Aby utworzyć mysią ranę nabłonka rogówki, oznacz środkową rogówkę znieczulonej myszy za pomocą stempla do biopsji skóry, aby potwierdzić dobrze opisany i dobrze mierzalny obszar rany.

Delikatnie wciśnij stempel nad środkową rogówką, aby pozostawić okrągły ślad Oczyścić nabłonek rogówki aż do warstwy Bowmana, używając ręcznego narzędzia do usuwania pierścienia rdzy rogówki z zadziorem o średnicy 0,5 milimetra, upewniając się, że nie uszkodzi warstwy Bowmana. Usunąć resztki luźnych tkanek na brzegu rany za pomocą kleszczy rogówkowych. Potwierdź obszar oczyszczenia za pomocą barwienia fluorescencyjnego, umieszczając kroplę zwykłej soli fizjologicznej na bibułce fluoresceinowej w celu rozpuszczenia fluoresceiny, a następnie umieszczając kroplę zawierającą fluoresceinę na ubytku nabłonka myszy, aby uwidocznić go w świetle kobaltowym.

Kontynuuj hodowlę ex vivo mysiego modelu rany po otarciu rogówki, delikatnie naciskając górne i dolne krawędzie oczodołu myszy poddanych eutanazji, aby wypchnąć gałkę oczną. Wprowadź końcówkę zamkniętych nożyczek rogówkowych do przestrzeni zagałkowej wzdłuż dolnej ściany oczodołu, upewniając się, że nie przenikną do gałki ocznej. Trzymaj gałkę oczną stabilnie za pomocą 0,3-milimetrowych kleszczy rogówkowych, a następnie przetnij nerw wzrokowy i tkankę miękką okołooczodołową nożyczkami rogówkowymi, aby odizolować gałkę oczną.

W celu hodowli ex vivo mysich gałek ocznych przygotuj 48-dołkową płytkę z roztopionym woskiem wewnątrz studzienki i poczekaj na zestalenie, a następnie końcówką kleszczyków spojówkowych utwórz okrągły otwór na zastygłym wosku, aby pomieścić gałki oczne. Umieść pobrane gałki oczne bezpośrednio na 48-dołkowej płytce z pokrytym woskiem dnem i ściankami bocznymi, aby zapewnić stabilizację. Posiew gałek ocznych za pomocą DMEM zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej z antybiotykami lub bez, w zależności od celu badania.

Zanurz powierzchnię oka w pożywce hodowlanej, nie powodując unoszenia się gałki ocznej i udokumentuj przebieg gojenia się ran poprzez barwienie fluoresceiną i zbieranie zdjęć aparatem cyfrowym w świetle kobaltowym. Aby wywołać oparzenia alkaliczne, umieść okrągłą bibułę filtracyjną o średnicy 8 milimetrów na szalce Petriego. Za pomocą zakraplacza dodaj 0,5 normalnego wodorotlenku sodu do szalki Petriego, aby namoczyć bibułę filtracyjną i spuścić nadmiar roztworu z bibuły filtracyjnej przed umieszczeniem jej na znieczulonej rogówce królika.

Po otwarciu powiek wziernikiem pokrywy należy upewnić się, że błona naszywająca królika nie przeszkadza w wprowadzaniu bibuły filtracyjnej i umieścić nasączoną alkaliami bibułę filtracyjną na środkowej rogówce na 30 sekund. Usuń bibułę filtracyjną i spłucz powierzchnię oka 10 mililitrami soli fizjologicznej, aby wypłukać materiał alkaliczny. Aby uzupełnić ubytek rogówki, należy oczyścić nabłonek rogówki w zmętniałym obszarze aż do błony Bowmana za pomocą środka do usuwania pierścienia rdzy rogówki.

Potwierdź obszar oczyszczenia barwieniem fluoresceinowym w świetle kobaltowym i usuń resztki nabłonka rogówki za pomocą kleszczyków rogówkowych. Aby zabezpieczyć stan rany za pomocą tarsorrhaphy, upewnij się, że błona gładko pokrywa powierzchnię oka i ubytek nabłonka rogówki po stronie nosa. Wykonaj tymczasową tarsorrhathię ze środkami miejscowymi lub bez, używając szwu 6-0, aby chronić powierzchnię oka i zapobiec jej drapaniu przez królika, upewnij się, że szew do tarsorrhaphy znajduje się w odległości od 3 do 4 milimetrów od górnego i dolnego brzegu powieki z czterema do pięciu wiązaniami i dłuższymi węzłami, aby zapobiec zerwaniu szwów przez królika.

W mysim modelu gojenia się ran ex vivo nabłonka rogówki zaobserwowano łagodnie obniżony centralny obszar rogówki z dodatnim barwnikiem fluoresceinowym w centralnej części dwa milimetry po oczyszczeniu nabłonka rogówki myszy in vivo. Hodowla ex vivo mysich gałek ocznych osadzonych na pokrytej woskiem 48-dołkowej płytce hodowlanej była badana i dokumentowana codziennie na 48-dołkowej płytce hodowlanej pod mikroskopem stereoskopowym. Dzień po usunięciu nabłonka mysiej rogówki, na zdjęciach cyfrowych uzyskanych w świetle kobaltowym ujawniono jeden okrągły ubytek nabłonka zabarwiony fluoresceiną o średnicy 2 milimetrów.

Po wytworzeniu alkalicznego uszkodzenia nabłonka rogówki królika, zaobserwowano dodatnie barwienie fluoresceiną z lub bez światła kobaltowego nad centralną rogówką z wyraźnym i pełnym okrągłym brzegiem. Zaobserwowano reepitelializację nabłonka rogówki z wrastaniem łuski od rąbka. Najważniejszymi krokami są zabiegi mające na celu stworzenie gładkich i równych ubytków nabłonka na powierzchniach rogówki myszy i królika.

Na tych platformach można testować nowe terapie medyczne i chirurgiczne. Efekt reepitelializacji można monitorować po zabiegach. Neowaskularyzacja rogówki i zmętnienie po urazie w tym protokole byłoby niezaspokojoną potrzebą dalszych badań.