Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki
April 6th, 2022
Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.
Stworzono modele zwierzęce ex vivo i in vivo do badania mechanicznych i chemicznych uszkodzeń rogówki. Technika ta zapewnia naukowcom łatwą do zbudowania platformę do badania mechanicznych i chemicznych uszkodzeń rogówki. Aby utworzyć mysią ranę nabłonka rogówki, oznacz środkową rogówkę znieczulonej myszy za pomocą stempla do biopsji skóry, aby potwierdzić dobrze opisany i dobrze mierzalny obszar rany.
Delikatnie wciśnij stempel nad środkową rogówką, aby pozostawić okrągły ślad Oczyścić nabłonek rogówki aż do warstwy Bowmana, używając ręcznego narzędzia do usuwania pierścienia rdzy rogówki z zadziorem o średnicy 0,5 milimetra, upewniając się, że nie uszkodzi warstwy Bowmana. Usunąć resztki luźnych tkanek na brzegu rany za pomocą kleszczy rogówkowych. Potwierdź obszar oczyszczenia za pomocą barwienia fluorescencyjnego, umieszczając kroplę zwykłej soli fizjologicznej na bibułce fluoresceinowej w celu rozpuszczenia fluoresceiny, a następnie umieszczając kroplę zawierającą fluoresceinę na ubytku nabłonka myszy, aby uwidocznić go w świetle kobaltowym.
Kontynuuj hodowlę ex vivo mysiego modelu rany po otarciu rogówki, delikatnie naciskając górne i dolne krawędzie oczodołu myszy poddanych eutanazji, aby wypchnąć gałkę oczną. Wprowadź końcówkę zamkniętych nożyczek rogówkowych do przestrzeni zagałkowej wzdłuż dolnej ściany oczodołu, upewniając się, że nie przenikną do gałki ocznej. Trzymaj gałkę oczną stabilnie za pomocą 0,3-milimetrowych kleszczy rogówkowych, a następnie przetnij nerw wzrokowy i tkankę miękką okołooczodołową nożyczkami rogówkowymi, aby odizolować gałkę oczną.
W celu hodowli ex vivo mysich gałek ocznych przygotuj 48-dołkową płytkę z roztopionym woskiem wewnątrz studzienki i poczekaj na zestalenie, a następnie końcówką kleszczyków spojówkowych utwórz okrągły otwór na zastygłym wosku, aby pomieścić gałki oczne. Umieść pobrane gałki oczne bezpośrednio na 48-dołkowej płytce z pokrytym woskiem dnem i ściankami bocznymi, aby zapewnić stabilizację. Posiew gałek ocznych za pomocą DMEM zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej z antybiotykami lub bez, w zależności od celu badania.
Zanurz powierzchnię oka w pożywce hodowlanej, nie powodując unoszenia się gałki ocznej i udokumentuj przebieg gojenia się ran poprzez barwienie fluoresceiną i zbieranie zdjęć aparatem cyfrowym w świetle kobaltowym. Aby wywołać oparzenia alkaliczne, umieść okrągłą bibułę filtracyjną o średnicy 8 milimetrów na szalce Petriego. Za pomocą zakraplacza dodaj 0,5 normalnego wodorotlenku sodu do szalki Petriego, aby namoczyć bibułę filtracyjną i spuścić nadmiar roztworu z bibuły filtracyjnej przed umieszczeniem jej na znieczulonej rogówce królika.
Po otwarciu powiek wziernikiem pokrywy należy upewnić się, że błona naszywająca królika nie przeszkadza w wprowadzaniu bibuły filtracyjnej i umieścić nasączoną alkaliami bibułę filtracyjną na środkowej rogówce na 30 sekund. Usuń bibułę filtracyjną i spłucz powierzchnię oka 10 mililitrami soli fizjologicznej, aby wypłukać materiał alkaliczny. Aby uzupełnić ubytek rogówki, należy oczyścić nabłonek rogówki w zmętniałym obszarze aż do błony Bowmana za pomocą środka do usuwania pierścienia rdzy rogówki.
Potwierdź obszar oczyszczenia barwieniem fluoresceinowym w świetle kobaltowym i usuń resztki nabłonka rogówki za pomocą kleszczyków rogówkowych. Aby zabezpieczyć stan rany za pomocą tarsorrhaphy, upewnij się, że błona gładko pokrywa powierzchnię oka i ubytek nabłonka rogówki po stronie nosa. Wykonaj tymczasową tarsorrhathię ze środkami miejscowymi lub bez, używając szwu 6-0, aby chronić powierzchnię oka i zapobiec jej drapaniu przez królika, upewnij się, że szew do tarsorrhaphy znajduje się w odległości od 3 do 4 milimetrów od górnego i dolnego brzegu powieki z czterema do pięciu wiązaniami i dłuższymi węzłami, aby zapobiec zerwaniu szwów przez królika.
W mysim modelu gojenia się ran ex vivo nabłonka rogówki zaobserwowano łagodnie obniżony centralny obszar rogówki z dodatnim barwnikiem fluoresceinowym w centralnej części dwa milimetry po oczyszczeniu nabłonka rogówki myszy in vivo. Hodowla ex vivo mysich gałek ocznych osadzonych na pokrytej woskiem 48-dołkowej płytce hodowlanej była badana i dokumentowana codziennie na 48-dołkowej płytce hodowlanej pod mikroskopem stereoskopowym. Dzień po usunięciu nabłonka mysiej rogówki, na zdjęciach cyfrowych uzyskanych w świetle kobaltowym ujawniono jeden okrągły ubytek nabłonka zabarwiony fluoresceiną o średnicy 2 milimetrów.
Po wytworzeniu alkalicznego uszkodzenia nabłonka rogówki królika, zaobserwowano dodatnie barwienie fluoresceiną z lub bez światła kobaltowego nad centralną rogówką z wyraźnym i pełnym okrągłym brzegiem. Zaobserwowano reepitelializację nabłonka rogówki z wrastaniem łuski od rąbka. Najważniejszymi krokami są zabiegi mające na celu stworzenie gładkich i równych ubytków nabłonka na powierzchniach rogówki myszy i królika.
Na tych platformach można testować nowe terapie medyczne i chirurgiczne. Efekt reepitelializacji można monitorować po zabiegach. Neowaskularyzacja rogówki i zmętnienie po urazie w tym protokole byłoby niezaspokojoną potrzebą dalszych badań.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie opracowuje modele zwierzęce u myszy i królików w celu zbadania mechanicznych i chemicznych uszkodzeń nabłonka rogówki. Modele te mają na celu ułatwienie przesiewowego badania nowych terapii i zrozumienie podstawowych mechanizmów uszkodzenia rogówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Oftalmologia
- Farmakologia
Tło
- Uszkodzenia rogówki mogą być spowodowane czynnikami mechanicznymi lub chemicznymi.
- Zrozumienie tych uszkodzeń jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
- Modele zwierzęce są niezbędne do badania mechanizmów uszkodzenia rogówki.
- To badanie koncentruje się na modelach mysi i króliczym w celach badawczych.
Cel badania
- Stworzyć wiarygodne modele zwierzęce do badania uszkodzeń nabłonka rogówki.
- Przesiewowe badanie potencjalnych terapii na uszkodzenia rogówki.
- Wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia rogówki.
Stosowane metody
- Zostały stworzone modele zwierzęce ex vivo i in vivo.
- Mechaniczne uszkodzenia były indukowane za pomocą stemple do biopsji skóry.
- Chemiczne uszkodzenia były oceniane poprzez kontrolowane narażenie.
- Zastosowano barwienie fluorescencyjne w celu potwierdzenia obszaru uszkodzenia.
Główne wyniki
- Opracowane modele zapewniają platformę do badania uszkodzeń rogówki.
- Techniki tworzenia i oceny uszkodzeń zostały pomyślnie zweryfikowane.
- Barwienie fluorescencyjne skutecznie uwidoczniło wady nabłonka.
- Modele te mogą być wykorzystywane do przyszłych badań przesiewowych terapii.
Wnioski
- Badanie z powodzeniem ustanowiło modele zwierzęce do badań nad uszkodzeniami rogówki.
- Modele te są cenne dla testowania nowych terapii.
- Zrozumienie mechanizmów uszkodzenia może prowadzić do lepszych opcji leczenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust ex vivo and in vivo animal models for corneal epithelial injury provide a critical translational bridge for evaluating regenerative therapeutics and mechanistic interventions in ocular surface disease. These models enable quantitative assessment of wound healing, neovascularization, and scarring, supporting predictive confidence in early-stage ophthalmic drug development. Their reproducibility and adaptability position them as foundational platforms for preclinical candidate triage and mechanistic de-risking in ocular R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of corneal wound healing pathways and regenerative mechanisms.
- Supports functional validation of candidate therapeutics targeting epithelial repair.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating injury and repair variables in controlled models.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven target evaluation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible injury models for compound screening and efficacy ranking.
- Enables quantitative measurement of wound closure and neovascularization using imaging and staining.
- Supports assay scalability and cross-study comparability through defined injury protocols.
- Prepares validated biological systems for downstream pharmacological evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical testing with disease-relevant injury phenotypes observed in human ocular trauma and chemical burns.
- Enables longitudinal monitoring of therapeutic effects on corneal opacity and vascularization.
- Supports risk-adjusted advancement of regenerative and anti-scarring agents.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation for ophthalmic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
These animal models integrate into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early hypothesis testing, lead identification, and translational validation for ocular surface therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of regenerative and anti-fibrotic mechanisms in corneal repair.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound efficacy and safety assessment.
- Analytics: Enables standardized imaging and staining outputs for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo efficacy in disease-relevant animal models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse therapeutic modalities and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ocular drug development.
- Operational Value: Standardizes injury induction and healing assessment for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in ophthalmic R&D pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative and anti-scarring candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ocular microsurgery and animal handling for reproducible injury induction.
- Demands access to stereomicroscopy, imaging systems, and quantitative analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of injury protocols and readout criteria.
- Adaptable to both murine and rabbit models for mechanistic and translational studies.
- Limitations include species-specific healing responses and the need for careful endpoint selection.
