Name: Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj integrację organoidów jelitowych z technologią organ-on-a-chip do modelowania fizjologii jelita. Ta metoda umożliwia badanie farmakokinetyki, interakcji lekowych i dysfunkcji bariery nabłonkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy profesorowi Markowi Donowitzowi za dostarczenie organoidów pochodzących z biopsji jelitowej oraz Brettowi Clairowi za zaprojektowanie naukowych ilustracji modułu chip, przenośnego i hodowlanego. Cała reszta ilustracji naukowych została wygenerowana za pomocą BioRenderu.

<ol><li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors%3A+An+intra-subject+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li>
<li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+Differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caco-2+cell+monolayer%3A+Usefulness+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%E2%80%99s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology+%28Australia%29%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li>
<li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761(2013).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135(2020).</li>
<li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li>
<li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43(2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li>
<li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Sarna, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+motility%3A+From+bench+side+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Morgan+%26+Claypool+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Colonic motility: From bench side to bedside.</a> Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).</li>
<li>Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigms+for+mechanical+signal+transduction+in+the+intestinal+epithelium+-+category%3A+Molecular%2C+cell%2C+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Digestion%22%5BJournal%5D)">Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology.</a> Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li>
<li>Nava, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+regulates+intestinal+epithelial+homeostasis+through+converging+%CE%B2-Catenin+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways.</a> Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).</li>
<li>Madara, J. L., Stafford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+directly+affects+barrier+function+of+cultured+intestinal+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers.</a> Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).</li>
<li>Bruewer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+disrupt+epithelial+barrier+function+by+apoptosis-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).</li>
<li>Jones, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 36 (5), 724-730 (1995).</li>
<li>Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A%2C+the+major+vertebrate+acute-phase+reactant%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.</a> European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).</li>
<li>Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digesting+the+mechanobiology+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).</li>
<li>In, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+escherichia+coli+reduces+mucus+and+intermicrovillar+bridges+in+human+stem+cell-derived+colonoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li>
<li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106(2021).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li>
</ol>

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi i Magdalena Kasendra są obecnymi lub byłymi pracownikami Emulate Inc. i mogą posiadać udziały. Emulate Inc. to firma, która produkuje chipy narządowe i opublikowała patenty związane z pracą opisaną w tym artykule.

Połączenie technologii narządów na chipie i organoidów jelitowych daje nadzieję na dokładne modelowanie fizjologii i patofizjologii jelit człowieka. W tym miejscu przedstawiamy prosty i solidny protokół krok po kroku (opisany na rysunku 1) do tworzenia chipa jelitowego zawierającego nabłonek jelita cienkiego lub okrężnicy pochodzący z biopsji oraz komórki śródbłonka mikronaczyniowego jelita grubego hodowane wspólnie w urządzeniu mikroprzepływowym. Ta oparta na chipie symulacja ludzkiego jeli...

Ludzkie jelito jest złożonym i wielozadaniowym organem zdolnym do samoregeneracji. Dzieli się na jelito cienkie i grube. Podstawową funkcją jelita cienkiego jest dalsze trawienie pokarmu pochodzącego z żołądka, wchłanianie wszystkich składników odżywczych i przekazywanie pozostałości do jelita grubego, które odzyskuje wodę i elektrolity. Jelito cienkie jest dalej podzielone na wiele anatomicznie odrębnych regionów: dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte, z których każdy jest przystosowany do pełnienia określonych funkcji. Na przykład dwunastnica pomaga w rozkładzie treści pokarmowej (treści żołądkowej), aby umożliwić prawidłowe wchłanianie składników odżywczych zawierających białka, węglowodany, witaminy i minerały w jelicie czczym. Ta proksymalna część jelita cienkiego jest również głównym miejscem wchłaniania i metabolizmu leków w jelitach grubych i charakteryzuje się wyższą ekspresją enzymów metabolizujących leki (np. CYP3A4) w porównaniu z ich ekspresją w jelicie krętym i okrężnicy1. Oprócz swojej głównej roli w trawieniu i wchłanianiu składników odżywczych, jelito jest również skuteczną barierą przed potencjalnie szkodliwą zawartością światła, taką jak mikroorganizmy chorobotwórcze, metabolity drobnoustrojów, antygeny dietetyczne i toksyny2,3. Warto zauważyć, że ludzka okrężnica jest zasiedlona przez dużą liczbę mikroorganizmów, znacznie przewyższającą liczbę wszystkich komórek w ludzkim ciele, które zapewniają wiele korzyści w zakresie odżywiania, metabolizmu i odporności. W związku z tym utrzymanie integralności bariery śluzowej utworzonej przez komórki nabłonka jelitowego ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia symbiotycznego związku między mikrobiotą jelitową a komórkami gospodarza poprzez ich fizyczną separację w celu uniknięcia niepotrzebnej aktywacji komórek odpornościowych2. Ponadto zaprogramowana śmierć komórek jelitowych odgrywa istotną rolę jako mechanizm samoobronny, zapobiegający utrzymywaniu się lub namnażaniu się zakażonych komórek - rozprzestrzeniając w ten sposób potencjalne patogeny3 - podczas gdy ciągłe samoodnawianie nabłonka jelitowego co cztery do siedmiu dni kompensuje utratę komórek, zapewniając integralność bariery i homeostazę tkanek. Upośledzenie opisanych funkcji jelit, w tym wchłaniania składników odżywczych, integralności bariery lub braku równowagi w śmierci komórek jelitowych i samoodnawianiu, może skutkować rozwojem szeregu zaburzeń żołądkowo-jelitowych, w tym niedożywienia i nieswoistego zapalenia jelit (IBD)2,3.
Poprzednio, modele zwierzęce i przekształcone linie komórek jelitowych pochodzących z raka były używane do badania fizjologicznych i patofizjologicznych funkcji ludzkiej tkanki jelitowej. Jednak coraz bardziej widoczne obawy dotyczące przekładalności badań na zwierzętach na ludzi, spowodowane obecnością znacznych różnic między tymi dwoma gatunkami, uwypukliły potrzebę alternatywnych metod istotnych dla człowieka4. Powszechnie stosowane linie komórkowe jelit in vitro obejmują komórki T84, Caco-2 i HT29. Chociaż naśladują pewne aspekty funkcji bariery jelitowej i transportu błonowego, charakteryzują się zmienioną ekspresją enzymów metabolizujących leki5, receptory powierzchniowe i transportery4. Ponadto brakuje im swoistości segmentu jelitowego i nie są w stanie podsumować złożoności nabłonka jelitowego, przy czym każdy model zawiera tylko jeden z pięciu typów komórek nabłonkowych obecnych w jelicie6.
Niedawno, hodowle organoidów ludzkich jelit powstałych na podstawie świeżych biopsji jelita cienkiego i okrężnicy7,8 lub indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)9 zostały wprowadzone jako alternatywne modele eksperymentalne z potencjałem uzupełnienia, ograniczenia i być może zastąpienia eksperymentów na zwierzętach w przyszłości. Podczas gdy iPSC można uzyskać w sposób nieinwazyjny, tworzenie organoidów z iPSC wymaga zastosowania złożonych i długotrwałych protokołów (z kilkoma etapami eksperymentalnymi) i generuje kultury przypominające ludzką tkankę płodową. Natomiast organoidy pochodzące z biopsji są wysoce skalowalne, ponieważ mogą wykorzystywać wrodzoną zdolność tkanki jelitowej do odnawiania i mogą być pasażowane i rozmnażane w nieskończoność in vitro. Co ważne, organoidy pochodzące z biopsji zachowują specyficzne dla choroby i regionu jelitowego cechy tkanki pierwotnej, z której się rozwinęły, oraz naśladują różnorodność komórkową nabłonka jelitowego. Organoidy mogą być wykorzystywane jako awatary specyficzne dla pacjenta in vitro w celu rozwikłania biologii i patogenezy różnych zaburzeń żołądkowo-jelitowych oraz poprawy ich postępowania terapeutycznego. Chociaż organoidy jelitowe osiągnęły imponujący stopień funkcjonalności fizjologicznej, nadal nie są w stanie odtworzyć złożoności narządów rodzimych ze względu na brak krytycznych składników zrębu - w tym naczyń krwionośnych, tkanki łącznej, nerwów obwodowych i komórek odpornościowych - a także stymulacji mechanicznej. Wiadomo, że parametry mechaniczne, takie jak przepływ, naprężenie ścinające, rozciąganie i ciśnienie, wpływają na morfogenezę i homeostazę tkanek in vivo, a wcześniej wykazano, że poprawiają dojrzewanie komórek in vitro10,11,12,13. Dodatkową istotną wadą układów organoidowych jest niedostępność światła, a co za tym idzie do wierzchołkowej strony nabłonka. Stanowi to wyzwanie dla badania różnych mechanizmów związanych ze spolaryzowaną ekspresją transporterów jonów i leków, interakcjami gospodarz-mikrobiom oraz testami toksyczności farmaceutycznej. Wreszcie, hodowle organoidów cierpią ze względu na znaczną zmienność wielkości, morfologii i funkcji, ze względu na stochastyczny charakter procesu samoorganizacji in vitro i wyborów dotyczących losu komórki. Dlatego, aby w pełni wykorzystać potencjał organoidów jelitowych w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i medycynie regeneracyjnej, konieczne jest zbadanie nowych strategii, które zmniejszają zmienność rozwoju organoidów, poprawiają dostęp do przedziału luminalnego i uwzględniają brakujące interakcje komórka-komórka.
Technologia Organ-on-a-Chip wprowadziła wiele technik wprowadzania sił mechanicznych i przepływu płynów do hodowli komórek jelitowych in vitro. Ponieważ jednak większość wstępnych badań potwierdzających słuszność koncepcji wykorzystywała linie komórkowe pochodzące z raka, które nie wykazywały wystarczającej różnorodności komórkowej, znaczenie tych systemów zostało zakwestionowane. Ostatnio synergistycznie połączyliśmy organoidy jelitowe i technologię organ-on-a-chip, aby połączyć najlepsze cechy każdego podejścia w jednym systemie in vitro14,15,16. Powstały w ten sposób chip jelitowy rekapituluje wielokomórkową architekturę nabłonka jelitowego, obecność interfejsu tkankowego nabłonkowo-śródbłonkowego oraz siły mechaniczne przepływu i rozciągania płynu, umożliwiając naśladowanie funkcji na poziomie narządów in vitro. Ponadto zastosowanie organoidów pochodzących z tkanek pierwotnych (które można pobrać z różnych regionów ludzkiego jelita) jako materiału wyjściowego zwiększa wszechstronność tego modelu, ponieważ chipy reprezentujące ludzką dwunastnicę, jelito czcze, jelito kręte i okrężnicę można ustalić po podobnych procedurach wysiewu i hodowli. Co ważne, Intestine-Chips umożliwiają ocenę w czasie rzeczywistym: integralności bariery jelitowej; aktywność granicy szczotek i enzymów metabolizmu leków; produkcja mucyn; wydzielanie cytokin; oraz interakcji komórek jelitowych z mikroorganizmami chorobotwórczymi i komensalnymi, jak wykazano we wcześniej opublikowanych raportach. Warto zauważyć, że gdy stworzono chipy jelitowe przy użyciu organoidów wygenerowanych z tkanek różnych osób, modele te uchwyciły oczekiwaną zmienność między dawcami w funkcjonalnych odpowiedziach na różne leki i terapie. Podsumowując, połączenie organoidów z technologią Organ-on-a-Chip otwiera drzwi do bardziej zaawansowanych, spersonalizowanych modeli istotnych in vivo, które mogą poprawić fizjologiczne znaczenie i dokładność wyników in vitro, a także ich ekstrapolację na ludzi. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół tworzenia chipa jelitowego i jego zastosowania w badaniach funkcji fizjologicznych dwóch odcinków jelita: dwunastnicy i jelita grubego. W pierwszej kolejności opisano metody oceny aktywności enzymu metabolizującego leki CYP3A4 w chipie dwunastnicy, a także jego indukcji przez prototypowe związki, takie jak ryfampicyna i witamina D3. Po drugie, kroki wymagane do modelowania "nieszczelnego jelita" w chipie jelita grubego są opisane w protokole, przy czym przerwanie bariery nabłonkowej odbywa się za pomocą charakterystycznych cytokin zaangażowanych w patogenezę IBD. Krótko mówiąc, organoidy pochodzące z ludzkich biopsji są rozmnażane in vitro, poddawane trawieniu enzymatycznemu i wprowadzane do górnego kanału chipa. W obecności ciągłej perfuzji z pożywkami wzbogaconymi w czynnik wzrostu przekształcają się w zlewającą się monowarstwę nabłonka o architekturze 3D i łatwo dostępnej powierzchni komórek wierzchołkowych. Dolny, "naczyniowy" przedział chipa jest wysadzany mikronaczyniowymi komórkami śródbłonka wyizolowanymi z jelita cienkiego lub grubego. Nabłonek i śródbłonek są oddzielone porowatą, rozciągliwą błoną, która ułatwia interakcje parakrynne między dwiema tkankami, a pod wpływem cyklicznych deformacji naśladuje ruchy jelita ludzkiego przypominające perystaltykę. Kokultura jest utrzymywana w dynamicznych warunkach przepływu generowanych przez perfuzję światła i naczyń krwionośnych za pomocą odpowiednich pożywek do hodowli komórkowych. Na koniec opisujemy liczne rodzaje testów i analiz punktów końcowych, które można przeprowadzić bezpośrednio na chipie lub z próbek ścieków z hodowli komórkowych.

<table><tbody><tr><td>jelito cienkie Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka</td> jelitowego <td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE15</td><td>0,5 komórek M/ml; kriokonserwowana</td></tr><tr><td>okrężnica Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka jelitowego</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE16</td><td>0,5 komórki M/ml; kriokonserwowane</td></tr><tr><td>organoidy dwunastnicy pochodzące z biopsji</td> John <td>Hopkin's University</td><td>-</td><td>Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329).</td></tr><tr><td>Organoidy jelita grubego pochodzące z biopsji</td><td>Uniwersytet Johna Hopkina</td> <td>-</td> <td>Organoidy zostały dostarczone przez profesora Marka Donowitza (numer Institutional Review Board: NA_00038329).</td></tr><tr><td>Zo&euml; CM-1 i handel; &nbsp; Moduł kultury</td><td>Emulacja&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Moduł kulturowy</td></tr><tr><td>Orb-HM1 i handel; &nbsp; Emulacja modułu koncentratora</td><td>&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>5% CO2, rozciąganie próżniowe i zasilanie</td></tr><tr><td>Chip-S1&handel; Rozciągliwy chip</td><td>emulacyjny&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Organ-Chip</td></tr><tr><td>Pod&handel; Emulacja modułów przenośnych</td><td>&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Przenośny moduł</td></tr><tr><td>UV Light Box</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Emulacja kołyski na wióry</td><td>&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>1 za kwadrat naczynia hodowlanego</td></tr><tr><td>Steriflip&reg;-HV Filters</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>0,45&nbsp; &mu; m&nbsp; Filtr PVDF</td></tr><tr><td>Kwadratowe naczynie do hodowli komórkowych (120 x 120 mm)</td><td>VWR</td><td>82051-068-Ręczny</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; próżnia&nbsp; aspirator</td><td>Corning</td><td>4930</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Zasysający&nbsp; </td><td>pipety Corning / Falcon</td><td>357558</td><td>2 mL,&nbsp; polistyren, indywidualnie&nbsp; owinięte</td></tr><tr><td>Końcówki zasysające</td><td>&nbsp;-</td><td></td><td>Sterylne (autoklawowane)</td></tr><tr><td>Serologiczne&nbsp; pipety</td><td></td><td>&nbsp;-</td><td>2 mL, 5 mL,&nbsp; 10 ml,&nbsp; oraz&nbsp; 25 ml&nbsp; niska endotoksyna, sterylna</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td>P20, P200,&nbsp; P1000&nbsp; i standardowa pipeta wielokanałowa</td></tr><tr><td>&nbsp; Porady&nbsp;</td><td></td><td></td><td>P20, P200,&nbsp; oraz&nbsp; P1000.</td></tr><tr><td>Rury stożkowe&nbsp;( Białko&nbsp; LoBind&reg; Dętki)</td><td>Eppendorf</td><td>0030122216; &nbsp; 0030122240</td><td>Probówki 15 mL, 50 ml</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Dętki&reg; &nbsp; lo-bind</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td>probówki 1,5 ml</td></tr><tr><td>96 dołków płytka o czarnych ściankach</td> <td>-</td><td></td> <td>do analizy przepuszczalności nabłonka</td></tr><tr><td>Mikroskop (z kamerą)</td> <td>-</td><td></td> <td>Do jasnego pola&nbsp; obrazowanie</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna (lub koraliki)</td> <td>-</td><td></td> <td>Ustaw na 37&deg; C</td></tr><tr><td>Konfiguracja próżni</td><td>&nbsp; -</td><td>-</td><td>Minimum&nbsp; ciśnienie: -70 kPa</td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek Kolby</td><td>Biotium</td><td>220033</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td>Kolba do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Emuluj odczynnik-1&nbsp;( ER-1)</td> <td>Emuluj Inc.</td><td>-</td><td>Roztwór do powlekania wiórów</td></tr><tr><td>Emuluj odczynnik-2&nbsp;( ER-2)</td> <td>Emuluj Inc.</td><td>-</td><td>Roztwór do powlekania wiórów</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS&nbsp; (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>1X</td></tr><tr><td>Klasa hodowli komórkowej Woda</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma</td><td>93595</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>TryplE&nbsp; Ekspresowy</td><td>ThermoFisher&nbsp; Organoidy 12604013 naukowe</td><td></td><td>&nbsp; dysocjacja&nbsp; i komórki śródbłonka&nbsp; Oderwanie&nbsp; rozwiązanie</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12</td><td>ThermoFisher&nbsp; Naukowe</td><td>12634028</td><td>Medium</td></tr><tr><td>IntestiCult&trade; Organoid Growth Medium (Human)</td><td>Stem Cell technologies</td><td>06010</td><td>Pożywka do wzrostu organoidów</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>Podłoże śródbłonkowe</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Primocin&trade; &nbsp;</td><td>Środek przeciwdrobnoustrojowy</td> <td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-1</td></tr><tr><td>Czynnik przyłączenia i handel;</td><td>Cell Systems</td><td>4Z0-210</td><td>roztwór powlekający do kolby</td></tr><tr><td>Matrigel - Obniżony czynnik wzrostu</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Solubilizowana matryca błony podstawnej</td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Składnik ECM</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>Składnik ECM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72304</td><td>suplement podłoża organoidowego</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-10</td><td>Suplement na podłoża organoidowe</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Podstawa roztwór dysocjacji macierzy mebranowej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td>30%, sterylna</td></tr><tr><td>woda klasy hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td>sterylna, woda</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>3KDa Dextran Cascade Blue</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td>10 mg proszek</td></tr><tr><td>Ryfampicyna (RIF)</td><td>Sigma</td><td>Cat# R3501</td><td>Induktor CYP</td></tr><tr><td>Hydrat testosteronu</td><td>Sigma</td><td>T1500</td><td>Podłoże CYP</td></tr><tr><td>1,25-dihyroksy Witamina D3 (VD3)</td><td>Sigma</td><td>Cat# D1530</td><td>Induktor CYP</td></tr><tr><td>Acetonitryl z 0,1% (v/v) Kwas mrówkowy</td><td>Sigma</td><td>159002</td><td>Rozwiązanie zatrzymujące LCMS</td></tr><tr><td>IFN&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>EMS</td><td>157-4</td><td>Utrwalacz</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Sigma</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>antyokludyna</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>33-1500</td><td>marker do szczelnych skrzyżowań</td></tr><tr><td>anty-Claudin 4</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>36-4800</td><td>marker połączeń ścisłych</td></tr><tr><td>anty-E-kadheryna</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>marker połączeń przylegających do nabłonka</td></tr><tr><td>anty-VE-kadheryna</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>marker połączeń przylegających do śródbłonka</td></tr><tr><td>anty- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td>Marker <td>połączeń szczelnych</td> <td>Thermo Fischer</td><td>339194</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>62248</td><td>barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183020</td><td>zestaw do lizy, izolacji i oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>SuperScript&handel; IV VILO&handel; Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>zestaw do odwrotnej transkryptazy</td></tr><tr><td>TaqMan&trade; Szybki zaawansowany odczynnik Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444557</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>QuantStudio&trade; 5 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28573</td><td>Cykler do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Starter 18S</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Starter eukariotyczny 18S rRNA</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00604506_m1</td><td>Cytochrome&nbsp; rodzina 3 podrodzina A członek 4</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Zestaw testowy Coomassie Plus (Bradford)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23236</td><td>Zestaw do oznaczania ilościowego białek</td></tr><tr><td>Bufor do lizy MSD Tris</td><td>Diagnostyka w skali mezo</td><td>R60TX-3</td><td>Bufor do lizy białek</td></tr><tr><td>Zestaw lizatu całokomórkowego rozszczepionego/całkowitego kaspazy-3 Diagnostyka w</td><td>skali mezo</td><td>K15140D</td><td>Zestaw do wykrywania kaspazy 3</td></tr><tr><td>V-PLEX Panel urazów naczyniowych 2 Zestaw dla ludzi</td><td>Diagnostyka w skali mezo</td><td>K15198D</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td><td>Diagnostyka w skali mezo K15053D</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td></tr> <tr><td>LD plan-Neofluar 20x/0,40 Korr M27</td> <td>Soczewki obiektywowe dalekiego zasięgu</td><td></td> <td>Zeiss-20X</td></tr> <tr><td>Zeiss AXIOvert.A1</td><td>Mikroskop</td> <td>Zeiss-Brightfield</td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LD A-Plan 10X/0,25 Ph1</td><td>Soczewki obiektywowe Zeiss-10X</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie ludzkich organoidów i technologii organ-on-a-chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Błona śluzowa jelit to złożona fizyczna i biochemiczna bariera, która spełnia mnóstwo ważnych funkcji. Umożliwia transport, wchłanianie i metabolizm składników odżywczych i ksenobiotyków, ułatwiając jednocześnie symbiotyczny związek z mikrobiotą i ograniczając inwazję mikroorganizmów. Interakcja funkcjonalna między różnymi typami komórek oraz ich środowiskiem fizycznym i biochemicznym jest niezbędna do ustanowienia i utrzymania homeostazy tkanek jelitowych. Modelowanie tych złożonych interakcji i zintegrowana fizjologia jelit in vitro to ogromny cel, który może zmienić sposób, w jaki odkrywane i opracowywane są nowe cele terapeutyczne i kandydaci na leki.
Technologie organoidów i Organ-on-a-Chip zostały ostatnio połączone w celu wygenerowania istotnych dla człowieka chipów jelitowych, odpowiednich do badania funkcjonalnych aspektów fizjologii i patofizjologii jelit in vitro. Organoidy pochodzące z biopsji jelita cienkiego (dwunastnicy) i jelita grubego są umieszczane w górnej komorze chipa narządu, a następnie z powodzeniem rozszerzają się jako monowarstwy, zachowując jednocześnie wyraźne cechy komórkowe, molekularne i funkcjonalne każdego regionu jelita. Specyficzne dla tkanki jelita ludzkiego mikronaczyniowe komórki śródbłonka są wbudowane w dolny przedział chipa narządu, aby odtworzyć interfejs nabłonkowo-śródbłonkowy. Ta nowatorska platforma ułatwia ekspozycję światła na składniki odżywcze, leki i mikroorganizmy, umożliwiając badania transportu jelitowego, przepuszczalności i interakcji gospodarz-mikroorganizm.
Tutaj podano szczegółowy protokół tworzenia chipów jelitowych reprezentujących ludzką dwunastnicę (chip dwunastnicy) i okrężnicy (chip jelita grubego), a następnie ich hodowlę pod ciągłym przepływem i deformacjami podobnymi do perystaltyki. Przedstawiono metody oceny metabolizmu leków i indukcji CYP3A4 w chipie dwunastnicy z wykorzystaniem prototypowych induktorów i substratów. Na koniec przedstawiamy procedurę krok po kroku do modelowania in vitro przerwania bariery za pośrednictwem interferonu gamma (IFNγ) w chipie jelita grubego, w tym metody oceny zmiany przepuszczalności parakomórkowej, zmiany w wydzielaniu cytokin i profilowanie transkryptomiczne komórek w chipie.

Rysunek 1D podsumowuje harmonogram hodowli na chipie jelitowym i ilustruje komórki śródbłonka jelitowego oraz organoidy przed i po wysianiu na chipie. Co więcej, pokazuje on wyraźne różnice morfologiczne między chipami dwunastniczymi a okrężniczymi, podkreślone przez obecność struktur przypominających kosmki w chipie dwunastniczym, co jest reprezentatywne dla architektury jelita cienkiego.
Rycina 3A,B przedstawia krot...

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Protokół ten pokazuje, w jaki sposób wykorzystać organoidy jelitowe pochodzące z biopsji i technologię narządów na chipie do wygenerowania fizjologicznie istotnego chipa jelitowego, który można następnie wykorzystać do przewidywania farmakokinetyki i interakcji lek-lek oraz do badania dysfunkcji bariery nabłonkowej jelit. Połączenie organoidów w technologii organ-on-a-chip pozwala nam odtworzyć złożoność nabłonka jelitowego. Dodatkowo umożliwia większą eksperymentalną kontrolę wskazówek mechanicznych, rozkładu przepływu i gradientów biochemicznych.Metoda ta naśladuje złożoną fizjologię ludzkiego jelita, dając lepsze zrozumienie komórkowych i molekularnych podstaw normalnych i patologicznych funkcji jelit. Pomaga to lepiej przewidywać farmakokinetykę i farmakodynamikę oraz potencjalnych kandydatów na leki zapobiegające uszkodzeniom zapalnym. Rozsiewanie jest krytycznym krokiem w protokole.Nadmierne rozdrobnienie lub niedokładna gęstość wysiewu fragmentów organoidów jelitowych może zagrozić rozwojowi i różnicowaniu bariery nabłonkowej. Na początek odessaj pożywkę ze statycznej kultury organoidów. Odzyskaj pożywkę z wystarczającej liczby studzienek, aby osiągnąć końcową gęstość wysiewu ośmiu milionów komórek na mililitr.Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego roztworu dysocjacyjnego BMM do każdej studzienki i przymocuj rozpuszczony BMM z powierzchni studzienki. Zebrać zawiesinę do 15-mililitrowej rurki wiążącej o niskiej zawartości białka i umieścić ją na lodzie. Delikatnie potrząsaj tubką co 15 minut przez godzinę.Wirować w temperaturze 300 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać osad organoidowy. Jeśli nad osadem zaobserwuje się przezroczystą warstwę żelu, należy odessać roztwór z probówki. Zawiesić osad i dodać równą objętość roztworu dysocjacyjnego BMM.Inkubować na lodzie przez 10 minut i odwirować. Powtarzaj tę czynność, aż nie będzie żadnych rozpuszczonych pozostałości BMM. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach roztworu do mineralizacji organoidów.Inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do trzech minut i dodaj osiem mililitrów zaawansowanego DMEM F12, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Odwirować i ponownie zawiesić osad w kompletnym pożywce do wzrostu organoidów, aby uzyskać osiem milionów komórek na mililitr. Podwielokrotność 360 mikrolitrów w sterylnych 1,5 mililitrowych probówkach wiążących białka.Następnie usuń pożywkę z górnego kanału pokrytych wiórów i dodaj 30 mikrolitrów zawiesiny komórek. Inkubuj wióry w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby przykleić fragmenty organoidu do membrany. Dodaj trzy mililitry wstępnie zrównoważonej kompletnej pożywki wzrostowej organoidów do górnego zbiornika wlotowego i trzy mililitry wstępnie zrównoważonej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka do dolnego zbiornika wlotowego.Dodaj 300 mikrolitrów tego samego podłoża do odpowiednich górnych i dolnych zbiorników wylotowych. Przenieś tacę z modułami przenośnymi do modułu hodowlanego. W module hodowli kilkakrotnie uruchamiaj cykl podstawowy, aż utworzy się wystarczająca ilość kropel do pomyślnego połączenia chipów.Następnie wsuń nośnik chipów do modułu przenośnego. Następnie rozpocznij dwugodzinny cykl regulacji, aby zwiększyć ciśnienie w pożywce hodowlanej w module przenośnym i chipie, po czym zaprogramowane warunki zostaną wznowione. Następnie zmień ustawienia rozciągania i uruchom moduł hodowli.Po 24 godzinach powtórz cykl z 10% rozciągnięciem i tą samą częstotliwością. W celu przygotowania pożywki dozującej lub kontroli nośnika należy rozcieńczyć roztwory podstawowe induktora CYP lub DMSO w kompletnym pożywce do wzrostu organoidów i pożywce do wzrostu komórek śródbłonka. Wstrzymaj moduł hodowli i przenieś tace do szafki bezpieczeństwa biologicznego.Wymień media we wszystkich zbiornikach wlotowych i wylotowych na dwumililitrowe media dozujące z induktorami lub sterowaniem pojazdu. Zwróć moduły przenośne z powrotem do modułu hodowli i uruchom ponownie przepływ z prędkością 30 mikrolitrów na godzinę. Co 24 godziny należy zastępować pożywkę świeżo przygotowanym roztworem indukcyjnym i kontynuować hodowlę przez 48 do 72 godzin.Następnie przenieś tace do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odessaj pożywkę dozującą ze wszystkich zbiorników. Umyj i wymień górny zbiornik wlotowy na ciepłe zaawansowane podłoże DMEM F12, a dolny zbiornik na pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka. Zastąp medium myjące jednym mililitrem roztworu podłoża sondy.Płucz wióry z dużym natężeniem przepływu 1 000 mikrolitrów na godzinę przez pięć minut i zasysaj zarówno górne, jak i dolne zbiorniki wylotowe. Włożyć chipsy do modułu hodowlanego i inkubować przez godzinę przy stałym przepływie 300 mikrolitrów na godzinę. Po godzinie leczenia zatrzymaj przepływ i przenieś tace do szafki bezpieczeństwa biologicznego.Zebrać 100 mikrolitrów ścieków z górnego zbiornika wylotowego i dodać je do probówki zawierającej 200 mikrolitrów roztworu zatrzymującego. Umieść probówki natychmiast na suchym lodzie i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umyj oba kanały 200 mikrolitrami sterylnego DPBS.Następnie zablokuj wylot dolnego kanału końcówką pipety z filtrem o pojemności 200 mikrolitrów. Przelać 50 mikrolitrów roztworu dysocjacyjnego przez dolny kanał i inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Zapewnić całkowite oderwanie komórek śródbłonka i usunąć roztwór dysocjacyjny z kanału przez pipetowanie.Powtórz pranie. Następnie zablokuj wylot górnego kanału i przelej 75 mikrolitrów buforu do lizy białek. Pozostawić włożoną końcówkę pipety i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Zbierz lizaty komórkowe w probówce o pojemności 1,5 mililitra, pipetując od pięciu do 10 razy. Powtórz perfuzję i zbieranie, aby uzyskać całkowite oderwanie komórek i przechowuj lizaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. W przypadku lizy RNA postępuj zgodnie z tą samą procedurą, używając 150 mikrolitrów buforu do lizy RNA.Najpierw przygotuj roztwór dozujący interferon gamma, rozcieńczając roztwory podstawowe w odgazowanym pożywce do wzrostu komórek śródbłonka. W komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń pożywkę ze zbiorników wlotowych dolnego kanału i zastąp ją trzema mililitrami roztworu dozującego dziennie. Następnie umieść tace w module hodowlanym i perfaktoruj wióry z dużym natężeniem przepływu 1 000 mikrolitrów na godzinę przez pięć minut.Zmień natężenie przepływu na 60 mikrolitrów na godzinę i kontynuuj hodowlę płynów. Dodaj 100 mikrolitrów DPBS na studzienkę do 96-dołkowej płytki o czarnych ściankach. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów ścieków ze wszystkich zbiorników do odpowiednich studzienek.Aby przygotować krzywą wzorcową, należy przeprowadzić trzykrotne rozcieńczenie pożywki zawierającej 100 mikrogramów na mililitr trzykilodaltonowego błękitu kaskadowego dekstranu w DPBS. Następnie wykonaj seryjne urojenia przy użyciu trzykrotnego rozcieńczenia pożywki do wzrostu komórek śródbłonka w DPBS. Wyraźne cechy morfologiczne dwunastnicy i jelita grubego zostały podkreślone przez obecność kosmkowatych formacji w chipie dwunastnicy, reprezentujących architekturę jelita cienkiego.W chipie dwunastnicy wystawionym na działanie induktorów cytochromu P450 ryfampicyny i witaminy D3 stwierdzono podwyższoną ekspresję genu mRNA dla enzymu metabolizującego lek cytochromu P450 3A4 i zwiększoną aktywność katalityczną enzymu cytochromu P450, co wskazuje na odpowiednie odpowiedzi indukcyjne u wszystkich trzech dawców organoidów. Po potraktowaniu monowarstwy nabłonka chipa jelita grubego interferonem gamma zaobserwowano upośledzoną morfologię komórek i utratę nabłonka walcowatego. Ponadto leczenie interferonem gamma doprowadziło do zwiększonego sygnału cytoplazmatycznego białek połączeń ścisłych i przylegających w porównaniu z kontrolą nośnika, wykazując przemieszczenie markerów połączeń ścisłych ZO-1 i klaudyny 4 oraz internalizację okludyny i E-kadheryny.Istotny wzrost przepuszczalności parakomórkowej nabłonka zaobserwowano po 48 godzinach stymulacji interferonem gamma na chipach jelita grubego. Podobnie interferon gamma indukuje aktywację apoptozy, na którą wskazuje wzrost wewnątrzkomórkowej zawartości rozszczepionej kaspazy 3. Interferon gamma indukował spolaryzowane wydzielanie cząsteczek prozapalnych w chipie okrężnicy, na co wskazuje podstawno-boczne wydzielanie VCAM-1 i interleukiny-6 oraz wierzchołkowe wydzielanie ICAM-1 i białka amyloidu A w surowicy. Aby uzyskać udaną hodowlę chipów jelitowych, należy wykorzystać niezróżnicowane organoidy i postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi fragmentacji i gęstości wysiewu.Po pomyślnym ustaleniu chipa jelitowego możemy badać wchłanianie, transport i metabolizm jelitowy, poziomy składników odżywczych i wydzielanie hormonów jelitowych, interakcje z patogenami drobnoustrojów gospodarza, bezpieczeństwo i skuteczność leków, specyficzne dla pacjenta mechanizmy chorobowe i odpowiedzi na terapie.

combining-human-organoids-organ-on-chip-technology-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

neuroHuMiX to zaawansowany model jelita na chipie do badania interakcji komórek bakteryjnych, nabłonkowych i neuronalnych w proksymalnych i reprezentatywnych warunkach wspólnej hodowli. Model ten pozwala na rozwikłanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw komunikacji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym.

Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

Nasz szczegółowy protokół opisuje tworzenie i używanie zaawansowanego modelu jelita na chipie, który symuluje ludzką błonę śluzową jelit ze strukturami 3D i różnymi typami komórek, umożliwiając dogłębną analizę odpowiedzi immunologicznych i funkcji komórkowych w odpowiedzi na kolonizację mikrobiologiczną.

Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Protokół łączy technologię organoidów jelitowych człowieka z analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki, aby zapewnić znaczący wgląd w wcześniej niezbadaną biologię jelit.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

Organoidy jelitowe człowieka muszą być unerwione, aby lepiej oddać strukturę i funkcję rodzimego ludzkiego jelita. W tym miejscu przedstawiamy jedną z metod włączania jelitowego układu nerwowego do tych konstruktów.

unerwienie ludzkich organoidów jelitowych

Poznaj integrację organoidów jelitowych z technologią organ-on-a-chip do modelowania fizjologii jelita. Ta metoda umożliwia badanie farmakokinetyki, interakcji lekowych i dysfunkcji bariery nabłonkowej.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Przeglądaj więcej filmów