In vivo (in vivo) Odczyty uszkodzeń naczyniowych w siatkówce myszy w celu zwiększenia odtwarzalności

Tutaj prezentujemy trzy protokoły analizy danych dla obrazów angiografii fluoresceinowej (FA) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) w badaniu okluzji żył siatkówki (RVO).

Protokół ten pozwala użytkownikowi na ilościowy pomiar klinicznie analogicznych markerów uszkodzenia w obrazowaniu siatkówki myszy, co zwiększa przekładalność kolejnych wyników. Metody te pozwalają nam usprawnić analizę i dają nam możliwość wiarygodnego porównywania obrazowania między zwierzętami doświadczalnymi. Chociaż metody te zostały opracowane w celu zbadania przeglądu modelu mysiego, można je łatwo rozszerzyć na badania nad dowolnymi chorobami siatkówki, które wykorzystują te same techniki obrazowania.

Włącz kaseton świetlny mikroskopu do obrazowania siatkówki, maszynę do optycznej tomografii koherentnej i podgrzewaną platformę myszy. Włącz komputer i otwórz program do tworzenia obrazów. Dodaj po jednej kropli fenylefryny i tropikamidu do każdego oka.

Wstrzyknąć 100 mikrolitrów 1% fluoresceiny dootrzewnowej. Pomieścij mysz na platformie. Dostosuj wysokość i kąt platformy, aż widok dna siatkówki będzie wyraźny i skoncentrowany.

Zrób zdjęcie dna oka. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i optycznej koherentnej tomografii. W programie optycznej koherentnej tomografii ustaw nudge na 10.

Wykonaj zdjęcie optycznej koherentnej tomografii, dodaj 75 mikrometrów dystalnie od oparzenia. Powtórz te czynności dla pozostałych trzech ćwiartek siatkówki. Przełącz aparat na filtr 488 nm.

Zwiększ wzmocnienie kamery do 5. Zrób zdjęcie dna oka dokładnie 5 minut po wstrzyknięciu fluoresceiny. Otwórz obraz fluoresceiny w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.

Zduplikuj obraz. Za pomocą narzędzia do zaznaczania ostrożnie prześledź główne naczynia. Zignoruj wszystkie statki odgałęziające się od tych statków.

Na pierwszym obrazie usuń zaznaczenie, pozostawiając tylko statek. Zapisz ten zamaskowany obraz. Przenieś zaznaczenie na drugi obraz, odwróć zaznaczenie i usuń, izolując tło.

Zapisz ten zamaskowany obraz. Otwórz obraz tła i zmierz gęstość zintegrowaną. Otwórz obraz naczyń, wybierz kontur naczyń, a następnie zmierz średnią intensywność.

Podziel zintegrowaną gęstość tła przez średnią intensywność naczyń, uzyskując współczynnik przeciekania dla oka. Zapisz ten współczynnik przeciekania dla każdego oka w kohorcie eksperymentalnej. Aby dokładniej kontrolować tło, znormalizuj oczy eksperymentalne do średniego współczynnika przecieku nieuszkodzonych oczu kontrolnych.

Otwórz obraz optycznej koherentnej tomografii w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. Prześledź granice warstwy komórek zwojowych, wewnętrznej warstwy splotowatej, wewnętrznej warstwy jądrowej, zewnętrznej warstwy splotowatej, warstwy fotoreceptorów i warstwy RPE. Wyeksportuj pliki jako plik CSV.

Zmierz średnią grubość każdej warstwy i powtórz dla każdego oka w kohorcie eksperymentalnej. Otwórz obraz optycznej tomografii koherentnej na obrazie J. Za pomocą narzędzia do tworzenia linii zmierz odległość, w której górna granica zewnętrznej warstwy splotowatej jest niewyraźna. Mierz poziomo, zachowując szerokość geograficzną, na której zaczyna się dezorganizacja.

Oblicz sumę zdezorganizowanych odległości na obrazie. Podziel długość dezorganizacji przez całkowitą długość siatkówki, aby uzyskać stosunek dezorganizacji. Powtórz pomiary i obliczenia dla obrazów optycznej koherentnej tomografii z pozostałych trzech kwadrantów siatkówki.

Weźmy średnią współczynników dezorganizacji z czterech obrazów optycznej tomografii koherentnej. Liczba ta reprezentuje średnią dezorganizację dla całej siatkówki. Powtórz te czynności dla każdego oka w kohorcie eksperymentalnej.

Zamaskowane obrazy używane do obliczania współczynnika przecieku dla każdego obrazu siatkówki mogą być porównywane z innymi i analizowane, oddzielając główne naczynia krwionośne od innych obszarów siatkówki. Kwantyfikacja fluoresceiny pozwala na porównanie ciężkości urazu i skuteczności leczenia, a także na badanie zmian w przeciekaniu w czasie urazu. Obserwuje się zarysowanie warstw siatkówki na obrazie OCT.

Kwantyfikacja grubości dla każdej warstwy siatkówki pokazuje, że początkowa reakcja obrzękowa ma głębszy wpływ na wewnętrzne warstwy siatkówki. Na podstawie analizy przebiegu w czasie uszkodzenia niedrożności żył siatkówki można zaobserwować początkowy zapalny obrzęk warstw siatkówki i ostateczne przerzedzenie zwyrodnieniowe. Wewnętrzna warstwa jądrowa doświadcza znacznie silniejszej odpowiedzi na początkowe uszkodzenie, ale wewnętrzna warstwa splotowata wykazuje poważniejsze ścieńczenie po ustabilizowaniu początkowego obrzęku i powrocie do linii podstawowej.

Dezorganizacja wewnętrznej warstwy siatkówki objawia się zanikiem górnej granicy zewnętrznej warstwy splotowatego, łącząc ze sobą zewnętrzną warstwę splotowatą i wewnętrzną warstwę jądrową. Dezorganizację siatkówki w dwóch grupach eksperymentalnych porównano w celu zbadania skuteczności inhibitora w łagodzeniu uszkodzeń siatkówki. Jakość obrazu ma kluczowe znaczenie dla jakości analizy.

Podczas uzyskiwania obrazów siatkówki poświęć trochę czasu, aby upewnić się, że dno i warstwy siatkówki są tak wyraźne i skupione, jak to tylko możliwe. Te nieinwazyjne metody mogą być stosowane podłużnie i w połączeniu z biochemicznymi i immunohistochemicznymi badaniami tkanek w celu stworzenia bardziej wieloaspektowych i szczegółowych profili choroby. Technika ta umożliwia wiarygodną kwantyfikację danych z obrazowania siatkówki in vivo w modelach chorób nerwowo-naczyniowych, dzięki czemu dane można łatwiej przełożyć na choroby ludzkie.