Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Blaszki amyloidowe są niezbędne do rozpoznania choroby Alzheimera. Nie są one jednak wystarczające. Mimo to pozostają one enigmatyczne, częściowo ze względu na wyzwania związane z charakteryzacją ich zawartości.

Nasz protokół jest bardzo skuteczny w izolowaniu włókienek amyloidowych o wysokiej czystości i dobrze nadaje się do zrozumienia drobnych szczegółów struktury i składu. Znajomość zawartości białka w blaszkach amyloidowych może pomóc w identyfikacji celów interwencji terapeutycznej, które mogą opóźnić, zakłócić lub zapobiec ich gromadzeniu się. W związku z tym, opóźniając wystąpienie choroby.

Metoda ta doskonale nadaje się do ekstrakcji złogów białkowych ze zdegenerowanych tkanek mózgowych i agregatów białkowych w różnych innych szlakach białkowych. Zacznij od umieszczenia świeżo wypreparowanego lub zamrożonego obszaru tkanki mózgowej w dwumililitrowej probówce zawierającej od sześciu do ośmiu kulek ceramicznych w świeżo przygotowanym lodowatym buforze homogenizacyjnym. Następnie zmiel tkankę za pomocą homogenizatora z młynkiem perełkowym z prędkością 4 000 obr./min z dwoma cyklami po 30 sekund włączania i wyłączania impulsu.

Teraz dodaj dziewięć mililitrów lodowatego buforu homogenizacyjnego do jednego mililitra homogenatu tkanki mózgowej i 15-mililitrowej probówki i uszczelnij laboratoryjnymi paskami filmu woskowego. Aby zapewnić solidną rozpuszczalność, utrzymuj rurkę obracającą się przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia dodać stałą sacharozę do zawiesiny ekstraktu tkankowego do końcowego stężenia 1,2 mola.

Dobrze wymieszaj i odwiruj 250 000 x g przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu, zawiesić osad w dwóch mililitrach buforu homogenizacyjnego zawierającego 1,9 molowej sacharozy przez rozcieranie i odwirować przy 125 000 x g przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieś górną białą warstwę ciała stałego do świeżej probówki i rozpuścij jeden mililitr lodowatego buforu do mycia, kilkakrotnie przesuwając w górę iw dół.

Ponieważ osad jest również wzbogacony w włókienka amyloidowe, odrzuć środkową warstwę wody i połącz osad z warstwą wierzchnią, aby uzyskać wyższą wydajność. Odwirować połączone frakcje w temperaturze 8 000 x g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego buforu do wytrawiania na zimno i inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny na wirze.

Ponownie odwirować próbkę, a następnie dwukrotnie przemyć osad w jednym mililitrze lodowatego buforu Tris i ponownie odwirować. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do solubilizacji, pipetując w górę iw dół, a następnie szybko odwirować probówkę przy 200 000 x g przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zachowaj osad, a następnie zmniejsz stężenie sacharozy z 1,3 do jednego mola, dodając 50-milimolowy bufor Tris do supernatantu.

Ponownie odwirować supernatant, a następnie rozpuścić oba granulki i 100 mikrolitrów buforu Tris zawierającego 0,5% SDS. W celu oczyszczenia amyloidu należy rozpuścić granulki bogate w amyloid za pomocą fal ultradźwiękowych w urządzeniu do sonikacji kąpieli przez 20 cykli, a następnie natychmiast odwirować materiał w temperaturze 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach 0,5% buforu SDS Tris i powtórzyć mycie jeszcze cztery razy, Po ostatnim etapie wirowania umyć osad w 200 mikrolitrach ultraczystej wody i odwirować 20 000 x g przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć pozostały detergent.

Rozpuść końcową osadkę zawierającą oczyszczone włókna amyloidowe w 100 mikrolitrach ultraczystej wody. Rozpuść oczyszczone 100 mikrolitrów włókienek amyloidowych w 400 mikrolitrach metanolu i dobrze odwiruj. Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów chloroformu i ponownie zwiruj.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów ultraczystej wody i dokładnie wymieszaj. Po odwirowaniu przy 12 000 x g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć górną warstwę wodną, nie naruszając warstwy granicy faz zawierającej płatki białkowe i ponownie dodać taką samą objętość metanolu. Powtórzyć wirowanie, wyrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu.

W celu roztrawienia rozpuść osad w 50 mikrolitrach buforu chlorowodorku guanidyny i poddaj sonicjacji w lodowatej kąpieli wodnej. Następnie dokładnie wirować przez 45 minut do jednej godziny w temperaturze pokojowej, dodać 50 mikrolitrów 0,2% roztworu środka powierzchniowo czynnego i ponownie wirować przez kolejne 60 minut. Następnie dodaj jeden mikrolitr 500-milimolowego TCEP i inkubuj przez 60 minut.

Następnie dodaj dwa mikrolitry 500-milimolowego jodoacetamidu i inkubuj w ciemności przez 20 minut. Po inkubacji schłodzić jodoacetamid pięcioma mikrolitrami roztworu TCEP przez 15 minut. Następnie dodaj wymaganą objętość 50-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu do probówki, aby zmniejszyć stężenie guanidyny do 1,5 mola.

Do probówki dodaj również 1% roztwór środka powierzchniowo czynnego. Następnie dodaj trypsynę i pozostaw rurkę do mieszania w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia dodaj kwas mrówkowy do strawionego roztworu peptydu, aby obniżyć pH do 2,0, a następnie aktywuj kolumnę wirową C18, dodając 200 mikrolitrów 50% roztworu metanolu i wirując przy 1500 x g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie zrównoważyć złoża żywicy kolumny C18, dodając 200 mikrolitrów buforu równoważącego i ponownie wirując przez dwie minuty. Po zrównoważeniu zakwaszony roztwór peptydu umieścić w kolumnie C18 i odwirować przy 1500 x g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Przeładuj przepływ, obróć kolumnę i odrzuć drugi przepływ.

Następnie przemyć peptydy związane z żywicą C18 dwukrotnie za pomocą buforu do płukania. Eluować peptyd trzykrotnie, dodając 40 mikrolitrów buforu elucyjnego i odwirowując kolumnę. Wysuszyć peptydy w szybkim koncentratorze próżniowym poprzez odparowanie roztworu wodnego.

Suche granulki można przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez kilka tygodni przed analizą MS. Czerwone zabarwienie oczyszczonych amyloidów Kongo dokumentuje wzbogacenie włókienek amyloidowych w porównaniu z frakcją rozpuszczalną SDS. Frakcja rozpuszczalna SDS nie wykazała obecności amyloidów.

Struktura oczyszczonych włókienek potwierdziła obecność prawie czystych włókienek amyloidowych. Również znakowanie immunozłotem potwierdziło obecność peptydów beta-42 amyloidu. Barwienie przy użyciu przeciwciał anty-amyloidowych beta-42 i antyfibrylowych wykazało względną obfitość peptydów beta-42 amyloidu w włókienkach.

Oczyszczone frakcje amyloidu wykazały obecność około 250 białek, podczas gdy frakcja zebrana przed ultradźwiękami i płukaniem SDS zawierała ponad 2 500 białek. Rdzenie fibryli wykazały wzbogacenie białek związanych z organellami niezwiązanymi z błoną i kompleksami supramolekularnymi. Amyloidy są gatunkami o niskiej liczebności, może od kilku pikogramów do kilku mikrogramów na miligram tkanki mózgowej.

Dlatego należy być bardzo ostrożnym podczas podnoszenia warstw, palet lub wyrzucania supernatantu. Dzięki rozwojowi tej techniki można teraz z większą pewnością identyfikować białka związane z początkowymi nasionami amyloidu, charakteryzować ich strukturę i kierować je do interwencji terapeutycznej. Dlatego zapobieganie wystąpieniu tej śmiertelnej choroby.