Test biologiczny komórek Caco-2 do pomiaru biodostępności żelaza w żywności

Wiedza na temat biodostępności żelaza ma zasadnicze znaczenie dla oceny jakości odżywczej żelaza w żywności. Test biologiczny komórek Caco-2 został opracowany w celu zaspokojenia tej krytycznej potrzeby badawczej. Ten test biologiczny jest opłacalnym i wysokoprzepustowym podejściem do określania biodostępności żelaza w różnych dietach.

Może być stosowany do charakteryzowania czynników wpływających na biodostępność żelaza i udoskonalania celów badań in vivo. Procedurę zademonstruje Yongpei Chang, technik badawczy z mojego laboratorium. Na początek hoduj komórki Caco-2 przez 7 do 10 dni, a gdy wystarczająca ilość komórek będzie dostępna, wysiew je w kolbie niepokrytej kolagenem.

Następnie hoduj komórki w kolbach przez siedem dni i zmień podłoże co drugi dzień. Siódmego dnia użyj komórek do wysiewu płytek wielodołkowych. Zasiej komórki Caco-2 o gęstości 50 000 komórek na centymetr kwadratowy w sześciu dołkach pokrytych kolagenem.

Dodaj DMEM uzupełniony o HEPES, FBS i 1% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy do płytek. Następnie inkubuj przez 12 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmieniaj podłoże co najmniej co dwa dni zgodnie ze stałym harmonogramem dnia.

Następnie przygotuj minimalną niezbędną pożywkę uzupełnioną rurkami, antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym, hydrokortyzonem, insuliną, selenem, trójjodotyroniną i naskórkowym czynnikiem wzrostu. Zastąp pożywkę hodowlaną dwoma mililitrami tej przygotowanej pożywki. Następnego dnia zastąp go jednym mililitrem minimalnej niezbędnej pożywki o pH 7.

Teraz utwórz wysterylizowany pierścień wkładkowy za pomocą silikonowego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym wyposażonego w membranę do dializy przemywanej kwasem. W 13 dniu wyjmij wkładki z lodówki, odcedź i zastąp wodę 0,5 molowym kwasem solnym. Pozostaw go w okapie z przepływem laminarnym na co najmniej godzinę przed użyciem.

Następnie odcedź 0,5 molowego kwasu solnego i spłucz sterylną wodą o stężeniu 18 megaomów. Przechowywać w sterylnej wodzie o mocy 18 megaomów w okapie z przepływem laminarnym, aż będzie gotowy do użycia. Stwórz system dwukomorowy, wkładając pierścień do studzienek zawierających komórki płytki sześciodołkowej, a następnie włóż płytkę z wkładkami do inkubatora.

Aby przygotować roztwór pankreatyny i żółci, dodaj 87,5 grama słabej żywicy kationowymiennej do rozpuszczonej pankreatyny i ekstraktu żółciowego i użyj shakera przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby wymieszać składniki. Wlej gnojowicę do dużej kolumny i opróżnij kolumnę. Następnie odwirować eluent kolumnowy.

Odważyć próbkę w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Dostosuj pH za pomocą kwasu solnego i dodaj 10 mililitrów soli fizjologicznej zawierającej 140 milimolowy chlorek sodu i pięć milimolowych chlorków potasu. Następnie ustaw proces trawienia żołądkowego, dodając 0,5 mililitra przygotowanego roztworu pepsyny świńskiej do próbki.

Następnie inkubować na kołyszącym się wytrząsarce w delikatnym ustawieniu przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozpocząć proces trawienia jelitowego każdej próbki, dostosowując pH do 5,5 do 6,0 za pomocą 1,0 molowego wodorowęglanu sodu. Dodać 2,5 mililitra roztworu żółci pankreatyny do każdej probówki z próbką i dostosować pH do 6,9 do 7,0 za pomocą 1,0 molowego wodorowęglanu sodu. Używając roztworu zawierającego 140 milimolowy chlorek sodu i pięciomilimolowy chlorek potasu, dodaj płyny tak, aby każda probówka zawierała dokładnie 15 gramów całkowitego materiału.

Teraz przenieś 1,5 mililitra każdego trawienia jelitowego do górnej komory studzienki zawierającej komórki Caco-2 z sześciodołkowej płytki hodowlanej. Załóż pokrywę płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla na kołyszącym się wytrząsarce z sześcioma oscylacjami na minutę przez dwie godziny. Zdejmij pierścień wkładki z digestem.

Następnie dodaj jeden mililitr minimalnej niezbędnej pożywki o pH 7 do każdej studzienki i trzymaj płytkę z powrotem w inkubatorze przez 22 godziny. Teraz usuń pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj dwa mililitry wody o mocy 18 megaomów do monowarstwy komórki. Przenieś go do sonikatora i zbierz cały lizat komórkowy do mikroprobówek wirówkowych w celu analizy białka komórkowego i ferrytyny komórkowej.

Odmiany manteca wykazały wyższą dostępność żelaza w porównaniu z kontrolami referencyjnymi klas kolorów modelowanych w kolorze białym i czerwonym przez dwa kolejne lata zbiorów. Biodostępność żelaza w odmianach fasoli białej i żółtej wykazała wzrost po przetworzeniu ich na mąkę. Jednak biodostępność żelaza wykazała spadek w przypadku żurawiny, czerwonej nerki i czarnych odmian.

Właściwa hodowla komórek jednowarstwowych Caco-2 jest niezbędna do pomyślnego zastosowania tego testu biologicznego. Precyzyjna dbałość o szczegóły wzrostu i utrzymania jest kluczem do spójnej odpowiedzi testu biologicznego. Model ten niweluje wady i wysokie koszty innych podejść oraz umożliwia naukowcom identyfikację mechanizmów i pełniejszą ocenę czynników, które hamują i promują biodostępność żelaza.