Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Jednym z wyzwań w badaniach siatkówki jest badanie wzajemnych oddziaływań między różnymi komórkami, takimi jak neurony siatkówki, komórki glejowe i komórki naczyniowe. W szczególności wyzwaniem jest izolowanie i hodowla neuronów siatkówki. Wierzymy, że hodowany eksplant siatkówki może przezwyciężyć to ograniczenie i zaoferować unikalny system ex vivo, który pozwala nam badać przesłuchy między różnymi komórkami siatkówki, przy dobrze kontrolowanych parametrach biochemicznych i niezależnie od układu naczyniowego.

Ponadto eksplant siatkówki jest ważnym narzędziem przesiewowym do badania nowych interwencji farmakologicznych w różnych chorobach siatkówkowo-naczyniowych i neurodegeneracyjnych, takich jak retinopatia cukrzycowa, która charakteryzuje się uszkodzeniem naczyń krwionośnych i neuronów. Nasze laboratorium od lat prowadzi badania nad zmianami patofizjologicznymi, sprzyjającymi dysfunkcji mikrokrążenia siatkówki. Wykorzystanie szerokiej gamy modeli, w tym modeli in vivo i in vitro, umożliwiło nam optymalizację wielu technik w naszym laboratorium.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół dla eksplantatów siatkówki pochodzących od dorosłej myszy typu dzikiego, którą można trzymać w hodowli przez dwa tygodnie. Trzymaj zwierzęta w pomieszczeniach o stałej temperaturze i w środowisku o kontrolowanym oświetleniu. Sprawdź każde zwierzę pod kątem zdrowia, odpowiedniego jedzenia i wody.

Upewnij się, że zapewniłeś zwierzętom świeże jedzenie i czystą wodę. Zmieniaj zabrudzone klatki codziennie lub w razie potrzeby ze względu na zdrowie zwierząt. Użyj samców czarnych 6 myszy w wieku powyżej 12 tygodni

Poddaj eutanazji zwierzęta w ich domowej klatce przez wdychanie dwutlenku węgla. Po zakończeniu zabiegu należy potwierdzić śmierć zwierzęcia odpowiednią metodą, taką jak potwierdzenie zatrzymania akcji serca i oddechu lub obserwacja stałych i rozszerzonych źrenic zwierzęcia. Po potwierdzeniu zgonu za pomocą wtórnej metody eutanazji, takiej jak zwichnięcie szyjki macicy.

Wywieraj nacisk na orbitę za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż kula ziemska wystaje. Delikatnie zamknij kleszcze w tylnej części oka i unieś się w ciągłym ruchu. Zanurz gałkę oczną w 1,5-mililitrowej tubce zawierającej jednomililitrowy lodowaty HBSS.

Przenieś gałkę oczną do 1,5- lub dwumililitrowej rurki zawierającej kompletne media. Teraz jest gotowy do sekcji. Ten diagram ilustruje kolejne kroki, które zostaną pokazane w celu wypreparowania gałki ocznej myszy w celu utworzenia eksplantatu siatkówki.

Nacięcie obwodowe wykonuje się wzdłuż rąbka, aby otworzyć gałkę oczną. Rogówkę usuwa się poprzez wypreparowanie wzdłuż nacięcia rąbka. Soczewka i ciało szkliste są następnie usuwane, pozostawiając pustą muszlę oczną.

Poprzez przytrzymanie okolicy głowy nerwu wzrokowego cienkimi kleszczami, delikatnie odkleja się zewnętrzną powłokę oka. Duża ostrożność podczas usuwania powłoki zewnętrznej, aby nie uszkodzić siatkówki nerwowej i mieć siatkówkę całkowicie nienaruszoną. Następnie siatkówka zostanie pocięta na mniejsze kawałki.

Będzie to wielka zaleta, ponieważ pozwoli Ci na przeprowadzenie eksperymentu, w którym Twoja grupa kontrolna i grupy eksperymentalne pochodzą od tego samego zwierzęcia. Jednak przecięcie siatkówki na małe kawałki sprawi, że obchodzenie się z nią będzie trudniejsze. Dlatego opracowaliśmy technikę obchodzenia się z tymi małymi kawałkami siatkówki, aby zapewnić prawidłową orientację posiewu siatkówki.

Idź z otwartym ostrzem nożyczek preparacyjnych tuż pod kawałkiem siatkówki. Powoli podnieś fragment siatkówki czubkiem otwartego ostrza nożyczek i delikatnie przenieś go na płytkę hodowlaną. Eksplantaty zostaną oddzielnie przeniesione na wkładki do hodowli komórkowych na płytkach wielodołkowych, z których każda zawiera 300 mikrolitrów pożywki z eksplantatu siatkówki stroną siatkówki skierowaną do góry.

Hodowle eksplantatów siatkówki będą utrzymywane w nawilżanych inkubatorach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Upewnij się, że powierzchnia siatkówki jest skierowana do góry. Jeśli część siatkówki jest odwrócona lub złożona, spróbuj delikatnie ustawić ją we właściwej orientacji.

Nieumieszczenie eksplantatu siatkówki we właściwej orientacji z siatkówką nerwową skierowaną do góry spowoduje niepowodzenie prawidłowego wzrostu komórek siatkówki w hodowli. Tutaj możemy zobaczyć immunofluorescencję barwiącą eksplantaty siatkówki barwione w kulturze przez dwa tygodnie. Eksplantaty utrwalono i wybarwiono NeuN dla neuronów siatkówki, GFAP dla komórek glejowych i lektyną dla naczyń krwionośnych.

Zabarwienie wykazało dobrze rozwinięte komórki siatkówki i naczynia siatkówki. Tutaj możemy zobaczyć barwienie immunofluorescencyjne eksplantatów siatkówki utrwalonych i wybarwionych GFAP dla komórek glejowych i lektyną dla naczyń krwionośnych. Obrazy pokazują wadliwe barwienie i niedorozwój zarówno komórek siatkówki, jak i naczyń siatkówki.

Dzieje się tak, ponieważ eksplant siatkówki był złożony i nie był prawidłowo zorientowany na płytce hodowlanej. Dużą uwagę należy zwrócić na prawidłową orientację eksplantatu z siatkówką skierowaną do góry. Fakt, że grupa kontrolna wywodzi się z tego samego zwierzęcia, co grupa leczona, sprawia, że bardzo korzystne jest bardziej wiarygodne porównanie różnych warunków doświadczalnych.

Implanty siatkówki mogą stanowić przyzwoitą platformę do badania możliwych celów terapeutycznych dla wielu różnych chorób siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa i choroby zwyrodnieniowe siatkówki.