Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Tutaj demonstrujemy stosunkowo prostą i nieskomplikowaną procedurę składania sieci aktomiozyny na uwięzi błonowej i badania dynamiki przy użyciu zaawansowanych technik mikroskopu świetlnego. Kluczową zaletą jest to, że nasz test pozwala na sekwencyjne dodawanie białek i małych cząsteczek bez naruszania sieci połączonych błoną. Metodę tę można łatwo zaadaptować do badania innych białek cytoszkieletu lub sieci kompozytowych.

Najważniejszą częścią protokołu jest upewnienie się, że podparta dwuwarstwa lipidowa jest prawidłowo utworzona, więc najpierw musieliśmy opanować ten krok, zanim zaczniemy dodawać białka cytoszkieletu. Na początek weź od trzech do pięciu prostokątnych szklanych szkiełek nakrywkowych i umieść je w słoiku z kopeliną. Włącz sonograf do kąpieli i ustaw temperaturę na 65 stopni Celsjusza.

Napełnij słoik z kopiną 2% roztworem czyszczącym, aby całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe i umieść go w sonikatorze na 30 minut w trybie pełnego impulsu. Użyj kleszczyków pokrytych PTFE, aby usunąć szkiełka nakrywkowe jeden po drugim. Dokładnie opłucz je wodą destylowaną i umieść w innym słoiku z kopiną wypełnionym dwoma normalnymi wodorotlenkami sodu.

Sonikować szkiełka nakrywkowe przez 20 minut w trybie pełnego impulsu. Usuń szkiełka nakrywkowe, dokładnie spłucz wodą destylowaną i umieść w innym słoiku z kopinem wypełnionym wodą destylowaną. Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść słoik w okapie chemicznym wyposażonym w dopływ azotu.

Użyj rękawiczek i kleszczy, aby usunąć szkiełka nakrywkowe, aby wysuszyć je pod strumieniem azotu. Osusz obie strony i umieść je na czystej plastikowej siatce z pokrywą. Umieść pudełko ze szkiełkami nakrywkowymi w eksykatorze, aby uniknąć kontaktu z cząsteczkami kurzu, a następnie weź autoklawowane probówki do PCR i odetnij ich pokrywki i dolne stożkowe połówki ostrym ostrzem chirurgicznym.

Weź cylindryczne rurki nacięte na pół, nałóż klej utwardzany promieniami UV na gładką krawędź każdej przeciętej rurki i umieść go odwrócony na świeżo oczyszczonym szkiełku nakrywkowym tak, aby obręcz przylegała płasko do szkiełka nakrywkowego. Nie przesuwaj cylindra na boki po umieszczeniu go na szkiełku nakrywkowym, aby upewnić się, że klej nie rozleje się do środkowej przestrzeni komory. Umieść szkiełka nakrywkowe z łożyskiem komory w środku do czyszczenia ozonem UV z dopływem tlenu i odkurzaniem.

Włącz światło UV i świec przez trzy do pięciu minut, aby klej mógł się polimeryzować. Wyjmij szkiełka nakrywkowe i przetestuj komory pod kątem szczelności, a nieszczelne komory wyrzuć. Umyj każdą komorę buforem tworzącym SLB, pozostawiając na końcu 100 mikrolitrów buforu.

Oznaczyć poziom buforu na 100 mikrolitrów markerem permanentnym, następnie dodać dwa mikrolitry 0,1 molowego chlorku wapnia do komory, a następnie osiem mikrolitrów roztworu SUV do każdej komory i inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Usunąć 50 mikrolitrów buforu tworzącego SLB, pozostawiając tylko 50 mikrolitrów w komorze próbki, a następnie dodać 100 mikrolitrów jednego XKMEH do komory i delikatnie wymieszać. Usuń 100 mikrolitrów buforu, nie dotykając dna.

Powtórz pranie od ośmiu do 10 razy, dodając 100 mikrolitrów jednego XKMEH i usuwając 100 mikrolitrów. Dodaj 10 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr beta-kazeiny do dwuwarstwy, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmyj beta-kazeinę trzykrotnie jednym XKMEH i przywróć poziom buforu do 100 mikrolitrów.

Podczas inkubacji beta-kazeiny wyjmij podwielokrotność białka łączącego błona-aktyna o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, szybko rozmrożonego w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzymaj ją na lodzie. Rozcieńczyć podwielokrotność buforem rozcieńczającym białka do stężenia jednego mikromola. Dodać białko łącznikowe do roztworu o określonym stężeniu końcowym i delikatnie wymieszać.

Inkubować przez 30 do 40 minut w temperaturze pokojowej i przemyć trzy do pięciu razy jednym buforem XKMEH w celu usunięcia niezwiązanego białka HSE. Doprowadzić poziom bufora w każdej komorze z powrotem do oznaczenia 100 mikrolitrów. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania.

Włącz mikroskop, lasery wzbudzające i kamery wykrywające. Upewnij się, że laser jest wyrównany, obiektyw jest wyczyszczony, a oprogramowanie jest gotowe do robienia zdjęć. Nałóż olej na 100-krotny obiektyw, zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu i skup obiektyw na dwuwarstwie.

Upewnij się, że położenie lasera jest takie, że ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu od próbki. Użyj wzbudzenia 488 nanometrów. Aby określić integralność dwuwarstwy, wykonaj szybki test FRAP, wybierając obszar zainteresowania na dwuwarstwie i rejestrując kilka obrazów pola widzenia przy użyciu warunków obrazowania, które zapewniają stosunek sygnału do szumu wynoszący pięć do jednego lub więcej.

Wstrzymaj zapis i zamknij przysłonę polową mikroskopu TIRF, aby skupić skoncentrowaną wiązkę laserową na małym okrągłym obszarze dwuwarstwy, aby miejscowo wybielić fluorofory. Włącz laser do maksymalnej wydajności, aby fotowybielać mały obszar przez trzy do 10 sekund, a następnie wyłącz laser. Ponownie otwórz przysłonę pola do jej pierwotnego promienia, dostosuj warunki obrazowania z powrotem do ustawień sprzed wybielania i natychmiast wznów rejestrację odzyskiwania sygnału fluorescencyjnego w polu view.

Sprawdź, czy dwuwarstwa jest płynna i zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki TIF z kropkami. Wymieszaj nieznakowaną i znakowaną fluorescencyjnie G-aktynę w stosunku 10 do jednego mola i uzupełnij buforem G, tak aby stężenie G-aktyny wynosiło 20 mikromolów. Dodaj jedną dziesiątą z 10 razy bufor ME do mieszanki, aby uzyskać jednorazowy roztwór, i inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie szybko rozmrozić fiolkę z białkiem do zakręcania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzymać ją na lodzie. Rozcieńczyć G tak, aby stężenie białka zamykającego było teraz dwukrotnie wyższe niż pożądane stężenie końcowe, a następnie dodać równą objętość rozcieńczonego roztworu białka zamykającego do mieszanki aktyny. Na koniec dodać równą objętość świeżego dwukrotnie pomnożonego buforu docelowego do mieszaniny reakcyjnej.

Ostateczna objętość roztworu powinna być czterokrotnie większa od objętości mieszaniny aktyny. Upewnij się, że końcowe stężenie składników jest zgodne z opisem w manuskrypcie tekstowym. Próbki inkubować w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut, aby umożliwić polimeryzację.

Delikatnie odpipetować pięć mikromolowych spolimeryzowanych aktyn końcówką pipety i dodać do czystej autoklawowanej probówki do PCR. Dodaj jeden XKMEH do probówki, aby końcowa objętość była większa niż 20 mikrolitrów, i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć ścinania F-aktyny. Z zamontowanej komory na próbkę usunąć równą objętość buforu.

Dodaj spolimeryzowany roztwór aktyny do komory i delikatnie pipetuj trzykrotnie w górę iw dół, nie dotykając dwuwarstwy na dole. Zamontuj próbkę pod mikroskopem TIRF i pozwól jej odpocząć przez 20 do 30 minut. Nagraj kilka obrazów z różnych pól widzenia po tym, jak dodatek F-aktyny osiągnie stan ustalony.

Po 30 minutach inkubacji aktyny zamontuj próbkę z powrotem na mikroskopie. Sprawdź sygnał na kanałach białka łącznikowego i F-aktyny. W razie potrzeby dostosuj warunki obrazowania.

Wybierz dobry region do długiego nagrania poklatkowego. Nagraj od 10 do 15 klatek z częstotliwością od 0,1 do 0,2 herca przed dodatkiem miozyny i wstrzymaj nagrywanie. Odpipetować wymaganą objętość przetworzonej miozyny mięśniowej dwie z fiolki podstawowej za pomocą końcówki pipety i dodać do czystej, autoklawowanej probówki do PCR.

Natychmiast dodaj jeden XKMEH do probówki, aby objętość przekroczyła 20 mikrolitrów i delikatnie wymieszaj. Ostrożnie usunąć równą objętość buforu KMEH z zamontowanej komory na próbkę, nie naruszając jej, i delikatnie dodać roztwór miozyny do komory próbki. Nie pipetuj w górę i w dół, ponieważ zakłóci to filamenty związane z powierzchnią.

Natychmiast wznów nagrywanie poklatkowe i zapisz wszystkie obrazy, a następnie utwórz obrazy tła dla wszystkich kanałów, używając próbki tylko buforowej. Zapisz wszystkie obrazy jako pliki TIF. Dopasowana wartość współczynnika dyfuzji wynosiła 1,34 mikrometra kwadratowego na sekundę, co ściśle pokrywało się z obliczoną wartością opartą na wzorze wynoszącą 1,39 mikrometra kwadratowego na sekundę.

Profil linii po fotowybielaniu i profil regeneracji wybielonego obszaru pasują odpowiednio do równań czwartego i piątego. Ruchoma frakcja dwuwarstwy lipidowej reprezentująca frakcję wybielonej populacji, która wraca do zdrowia, była większa niż 0,9, co wskazuje na dobrą dwuwarstwę lipidową. Aktywność miozyny indukowała kurczliwe przepływy aktomiozyny, które pojawiały się w strukturach astropodobnych w stanie stacjonarnym, napędzając lokalne grupowanie sprzężonego komponentu błonowego.

Można użyć różnych technik mikroskopowych, takich jak interferometryczna mikroskopia rozpraszająca, aby zbadać dynamikę nieznakowanych sieci aktomiozyny bez wywoływania jakichkolwiek uszkodzeń fotograficznych lub użyć mikroskopii fluorescencyjnej o super rozdzielczości. Technika ta toruje drogę naukowcom zainteresowanym zrozumieniem, w jaki sposób kompleksy białek błonowych oddziałują z dynamiczną siecią aktomiozyny w celu modulowania ich architektury i składu.