Name: Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji minimalnych sieci aktynowo-miozynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych. Technika umożliwia badanie dynamiki cytoszkieletu za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusz badawczy AXA oraz Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) dla DVK, NCBS-TIFR dla AB i ST oraz stypendium Wellcome-DBT Margdarshi (IA/M/15/1/502018) dla SM. DVK pragnie również podziękować Towarzystwu Biofizycznemu za umożliwienie wirtualnego wydarzenia networkingowego "Wyzwania w zrozumieniu wieloskładnikowych sieci cytoszkieletowych od molekularnej do mezoskali", , które przyczyniły się do powstania tej kolekcji protokołów.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Protokół ten stanowi wszechstronną platformę i punkt wyjścia do projektowania eksperymentów w celu zbadania interfejsu błona-kora komórkowa. Krytycznymi etapami są przygotowanie czystych szkiełek szkiełkowych, przy użyciu świeżych lipidów do wydajnego tworzenia SUV-ów (oba wpływają na jakość SLB) oraz wykorzystanie świeżo przetworzonych białek miozyny II do dynamicznej reorganizacji włókien aktynowych. Podczas obrazowania dynamiki w długim czasie bardzo ważne jest włączenie systemu pochłaniacza tlenu (np. kwasu protokatechowego i protokatechuianu 3 4-dioksygenazy 5,31).
Konstrukcja z otwartą komorą umożliwia sekwencyjne dodawanie komponentów do istniejącego systemu bez indukowania przepływu lipidów. Może to stanowić istotną przewagę nad powszechnie stosowanymi metodami z zamkniętą komorą lub pracą z wykorzystaniem zamkniętych białek w liposomach36. Przeciwstawne efekty, takie jak deformacja błony wywołana białkiem, nie mogą być badane za pomocą dwuwarstw lipidowych zaadsorbowanych przez szkło.
Dwuwarstwy lipidowe mogą być tworzone z szerokiej gamy kompozycji lipidowych. Rozpoczyna się od adsorpcji pęcherzyków lipidowych na powierzchni szkła hydrofilowego, po której następuje albo spontaniczne pęknięcie pęcherzyka w wyniku interakcji powierzchniowo-pęcherzykowych i bezpośrednich interakcji pęcherzyk-pęcherzyk, albo zaadsorbowane pęcherzyki osiągają krytyczne pokrycie, po czym niewielka część pęcherzyków pęka, tworząc aktywne krawędzie, co ostatecznie prowadzi do powstania dwuwarstwy32. Oprócz szkła, różne podłoża mogą być używane do tworzenia podpartych dwuwarstw lipidowych, takich jak mika (np. do mikroskopii sił atomowych), miękkie podłoża (np. poli-di-metylosiloksan), poduszki polimerowe 33,34,35, rozciągające się między otworami siatek mikroskopii elektronowej 14. Dwuwarstwy z interfejsem kropelkowym to kolejna interesująca metoda tworzenia stabilnych, wolnostojących dwuwarstw lipidowych36. Włączenie sieci aktoo-miozyny do pęcherzyków lub emulsji jest bardzo potężną metodą badania tego minimalnego systemu w geometrii podobnej do komórki37,38, która jest szczegółowo opisana w innym miejscu39.

Błona plazmatyczna żywej komórki zwierzęcej nieustannie oddziałuje z przylegającym do niej cytoszkieletem aktynowym, tworząc wspólnie aktywny materiał kompozytowy, który realizuje szereg funkcji komórkowych1,2. Aby badać procesy zachodzące na tym interfejsie błony lipidowej i aktyny, bardzo pomocna okazała się rekonstrukcja sieci cytoszkieletu na powierzchni wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLB). To podejście oparte na systemie minimalnym pozwala na precyzyjną kontrolę składników sieci cytoszkieletu oraz składu lipidów. W porównaniu do wolnostojących błon lipidowych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych, płaska geometria SLB umożliwia efektywne wykorzystanie najnowocześniejszych technik mikroskopowych, takich jak super-rozdzielczość3,4, fluorescencja z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF)5,6,7 lub mikroskopia rozproszeniowa interferometryczna8, w celu badania organizacji przestrzennej i dynamiki sieci cytoszkieletu. TIRF zapewnia najwyższy kontrast dla komponentów znakowanych fluorescencyjnie, ponieważ sygnał z niezwiązanych cząsteczek znakowanych w roztworze, które przyczyniają się do tła, jest minimalny.
W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół tworzenia sieci akto-miozynowych przytwierdzonych do wspieranych dwuwarstw lipidowych, które są powszechnie stosowane w tej dziedzinie do badania fizyki aktywnych sieci quasi-2D9,10,11 oraz ich wpływu na organizację błony3,5,12,13,14,15,16 (Rycina 1). Podejście to nie ogranicza się do sieci opartych na aktynie, lecz może zostać łatwo dostosowane do badania mikrotubul, filamentów pośrednich lub sieci kompozytowych o mieszanej naturze, a także do analizy różnych oddziaływań między białkami błon lipidowych a komponentami cytoszkieletu przy użyciu metod mikroskopii czułej powierzchniowo.
Aby zachować przejrzystość niniejszego protokołu, pominięto szczegółowy opis oczyszczania i znakowania białek aktyny i miozyny oraz szczegóły dotyczące strojenia i kontrolowania kurczliwości oraz organizacji sieci aktynomiozynowych. Należy odwołać się do innych protokołów opublikowanych wraz z niniejszym w kolekcji metod JoVE: In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat aktywnego układu kompozytowego aktyna-błona in vitro. Utworzono w programie Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N- (lisamina rodamina B sulfonyl)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1 karboksypentylo)kwas iminodiacetowy) sukcynylo] (sól niklu)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>DOPC Avanti Polar Lipids</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Fiolki ze szkła bursztynowego</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP sól disodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Komora komórkowa Attofluor</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>beta-kazeina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>alternatywnie z Electron Microscopy Sciences, 50980296</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, #1, średnica 25 mm, Gold Seal</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, #1, 40x22 mm, Gold Seal</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki ze szkła gazoszczelnego, z igłą removebla,, objętości 10 i mikro; L, 100 i mikro; L, 500 i mikro; L</td><td>Hammilton</td><td>1700 series</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Roztwór czyszczący</td>do <td>Z805939</td><td>Hellma Analytics</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Wytłaczarka do lipidów</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokońcówka Sonics</td><td></td><td>VC750</td><td>3 mm Średnica końcówki</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Ti Eclipse TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td>Z jednostką TIRF podłączoną światłowodem oszczędzającym polaryzację do monolitycznego sumatora laserowego Agilent MLC400 z wieloma liniami laserowymi z obiektywem olejowym 100X, 1,45 NA z dwoma aparatami EMCCD o rozdzielczości 512 x 512 pikseli (Photometrics Evolve 512) z obiektywem olejowym Nikon 100x, 1,45 NA z dwoma aparatami EMCCD o rozdzielczości 512 x 512 pikseli (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta z powłoką PTFE #2A</td><td>sonda strukturalna</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz UV</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>wymaga próżni i zasilania O2</td></tr></tbody></table>

rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

Powierzchnia żywej komórki stanowi wszechstronną platformę aktywną dla licznych procesów komórkowych, które powstają w wyniku interakcji błony plazmatycznej z leżącą poniżej korą aktyny. W ciągu ostatnich dziesięcioleci odtworzone, minimalne systemy oparte na wspieranych dwuwarstwach lipidowych w połączeniu z sieciami włókien aktynowych okazały się bardzo pomocne w odkrywaniu podstawowych mechanizmów i konsekwencji sieci aktynowych na uwięzi błonowej, a także w badaniu funkcji poszczególnych białek związanych z błoną. W tym miejscu opisujemy, jak odtworzyć takie aktywne układy kompozytowe in vitro, które składają się z dwuwarstwowych warstw lipidowych połączonych za pomocą białek wiążących aktynę związanych z błoną z dynamicznymi włóknami aktyny i silnikami miozyny, które można łatwo zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Konstrukcja z otwartą komorą pozwala na montaż systemu krok po kroku i systematyczną kontrolę wielu parametrów, takich jak stężenie białka łącznikowego, stężenie aktyny, długość filamentu aktyny, stosunek aktyny do miozyny, a także poziom ATP. Na koniec omówimy, jak kontrolować jakość systemu, jak wykrywać i rozwiązywać często występujące problemy oraz niektóre ograniczenia tego systemu w porównaniu z powierzchnią żywej komórki.

W celach reprezentacyjnych przedstawiono typowy profil po wybielaniu z pierwszego obrazu po fotowybielaniu (obraz w t = 0 s na Rysunku 3A) oraz jego dopasowanie do następującej funkcji28 (patrz Rysunek 6A):
<img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;" />
Wartość re (23,94 µm) obliczona na podstawie dopasowania do tej krzywej jest bardzo zbliżona do wartości re obliczonej w kroku 2.8.4. (23,24 µm). Tutaj K jest parametrem głębokości wybielania, który można bezpośrednio oszacować z F0 (opisanego w kroku 2.8.4.). Podobnie, Rycina 6B przedstawia profil regeneracji oraz jego dopasowanie do następującej funkcji28:
<img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;" />
Ustaliliśmy, że dopasowana wartość współczynnika dyfuzji wynosi 1,34 µm2/s, co jest wartością bliską 1,39 µm2/s obliczonej zgodnie ze wzorem w kroku 2.8.4. Tutaj MF oznacza frakcję mobilną dwuwarstwy lipidowej, która reprezentuje ułamek wybielonej populacji ulegający powrotowi. Mobilność cząsteczek zakotwiczonych w lipidach zależy oczywiście od składu lipidów i ich stanu fizycznego (fazy ciekłej lub żelowej). W przypadku naszych eksperymentów z wykorzystaniem membran lipidowych opartych na DOPC, mobilność powinna wynosić &#62;1 µm2/s, a frakcja mobilna nie powinna być mniejsza niż 0,9, co świadczy o dobrej jakości dwuwarstwy lipidowej. Do szybkiego sprawdzenia jakości i mobilności dwuwarstwy zalecamy zastosowanie ręcznej metody bez dopasowania. Metoda dopasowania może być przydatna podczas automatyzacji analizy wielu krzywych FRAP. Ponadto, jeśli chcemy przeprowadzić bardziej zaawansowany eksperyment FRAP w celu systematycznej charakterystyki dyfuzji w układzie, odsyłamy czytelnika do przeglądu Lorén i wsp.30 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat modeli dopasowania i potencjalnych pułapek w projekcie eksperymentalnym.
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Wyznaczanie współczynnika dyfuzji w dwuwarstwach lipidowych. (A)&#160;Profil liniowy pierwszego obrazu po fotowybielaniu (t = 0 s na Rysunku 3A) oraz jego dopasowanie do równania 4 w celu obliczenia efektywnego promienia wybielania. (B) Profil regeneracji wybielonego obszaru oraz jego dopasowanie do równania 5 w celu obliczenia współczynnika dyfuzji i frakcji mobilnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Typowy wynik opisanych powyżej eksperymentów, przedstawiający dynamiczny montaż i organizację sieci akto-miozynowej powiązanej z podłożną dwuwarstwą lipidową, obrazowany za pomocą mikroskopii TIRF, ukazano na Rysunku 7 oraz w filmie uzupełniającym S1.
Rysunek 7 przedstawia montaż obrazów białka łącznikowego, aktyny F oraz miozyny-II.
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg" /> 
Rycina 7: Kurczliwe przepływy akto-miozynowe napędzają lokalną klasteryzację białka łączącego błonę z aktyną HYE. Migawki TIRF dla HYE (oznaczonego YFP), filamentów aktynowych (oznaczonych maleimidem Atto-635) i filamentów miozyny II (oznaczonych maleimidem Atto-565) po dodaniu miozyny II do SLB zawierającej HYE i F-aktynę. Czas jest wskazany na górze: 0 min to moment bezpośrednio przed pojawieniem się fluorescencyjnych miofilamentów w polu TIRF. Przed dodaniem miozyny (0 min) HYE i F-aktyna są jednorodnie rozmieszczone w dwuwarstwie lipidowej. Aktywność miozyny indukuje kurczliwe przepływy akto-miozynowe, które w stanie stacjonarnym (15 min) przybierają formę struktur przypominających aster, napędzając lokalną klasteryzację sprzężonego komponentu błonowego (HYE). Najniższy rząd to nałożenie obrazów aktyny (żółty) i miozyny II (magenta), pokazujące organizację aktyny i miozyny w różnych punktach czasowych. Obrazy wykorzystane do stworzenia tych zestawień zostały skorygowane w programie Fiji pod kątem sygnału tła, nierównomiernych wzorców intensywności oraz ruchu translacyjnego. Pasek skali = 10 µm. Szczegóły znajdują się w Supplementary Video S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa buforu</td>
			<td colspan="2">Skład</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor do rehydratacji lipidów</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% sacharozy, pH 7,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do tworzenia SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do przechowywania SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do rozcieńczania białek</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1 mM TCEP lub DTT, pH 7,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do wymiany jonowej 1X ME lub aktyny&#160;</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (przechowywać w 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X bufor KMEH lub bufor do polimeryzacji aktyny&#160;</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór zapasowy ATP 100 mM</td>
			<td colspan="2">100 mM ATP dwuwodny sól sodowa, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (przechowywać w temperaturze -20&#176;C)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x bufor docelowy</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2 mM ATP, 5 mM TCEP (przechowywane w 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor G</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04% NaN3, pH 8 (przechowywać w 4&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do miozyny II</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do chromatografii żelowej</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do przechowywania białka capping protein&#160;</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris&#183;Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glicerolu&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista składów buforów wykorzystanych w tym protokole.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typowe problemy i sposoby ich rozwiązywania&#160; filmowanie&#160;</td>
			<td>Problem</td>
			<td colspan="4">Przyczyna</td>
			<td colspan="4">Możliwe rozwiązania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Dwuwarstwa lipidowa nie wykazuje dyfuzji</td>
			<td colspan="4">Najbardziej prawdopodobną przyczyną tego problemu jest zanieczyszczone szkiełko podstawowe, co może wystąpić w przypadku przedawnienia roztworu czyszczącego lub braku podgrzewania podczas sonikacji w kąpieli. Bilayery te mają wygląd „pęcherzykowy”, ponieważ pęknięte pęcherzyki przylegają do szkiełka podstawowego, lecz nie łączą się ze sobą. Użycie MLV starszych niż 6 tygodni lub SUV starszych niż 6 dni, a także dodanie niewielkich ilości SUV, może również prowadzić do powstania pęcherzykowych bilayerów.</td>
			<td colspan="4">Należy użyć świeżego roztworu czyszczącego. Upewnij się, że grzałka jest włączona, a temperatura wynosi od 45-65&#176;CNależy stosować świeże mieszaniny lipidów. (Zastosowanie fluorescencyjnej sondy lipidowej zamiast fluorescencyjnej sondy białkowej może czasami przynieść odmienne rezultaty. Na przykład, jeśli dwuwarstwa posiada defekty poniżej granicy dyfrakcji, a etap pasywacji powierzchni został pominięty (lub okazał się nieskuteczny), sonda lipidowa wykaże jednorodny rozkład intensywności, podczas gdy sonda białkowa może wykazywać jasne plamki fluorescencyjne).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Dwuwarstwa lipidowa posiada jasne obszary</td>
			<td colspan="4">Długotrwała inkubacja SUV w celu formowania dwuwarstwy może prowadzić do powstania lipidowej dwuwarstwy, która wykazuje ogólną dyfuzję, lecz posiada sporadyczne jasne obszary. Obszary te mogą być dwuwarstwami wielowarstwowymi, które mogą przyciągać duże ilości sondy fluorescencyjnej.</td>
			<td colspan="4">Inkubacja z SUV przez 15–20 min jest wystarczająca. Należy upewnić się, że sonda nie ulega agregacji: należy krótko i intensywnie odwirować białko łącznikowe (300 x g przez 15 min w temperaturze 4 &#176;C) może usunąć agregaty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Dwuwarstwa lipidowa posiada ciemne otwory</td>
			<td colspan="4">Dzieje się tak, gdy dwuwarstwa jest tworzona ze starych SUV i obrazowana przez wiele godzin (&#62; 4 godziny po utworzeniu), lub gdy pH roztworu drastycznie zmienia się z powodu przedłużonego obrazowania (np. w stanie wysokiego poziomu ATP i w obecności niektórych usuwaczy tlenu), lub gdy powierzchnia jest nadmiernie pasywowana beta-kazeiną (dodanie zbyt dużej ilości beta-kazeiny na ponad 10–15 min i/lub brak jej wypłukania).</td>
			<td colspan="4">Należy użyć świeżych lipidów. Należy zmniejszyć częstotliwość klatek obrazowania lub efektywny czas naświetlania laserem. Należy stosować bufory o wyższej pojemności buforowej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Dwuwarstwa lipidowa wykazuje powolną dyfuzję&#160;</td>
			<td colspan="4">Błon lipidowe o wysokim procencie cholesterolu, długich lipidach nasyconych lub lipidach naładowanych wykazują wolniejszą dyfuzję.</td>
			<td colspan="4">W takich przypadkach należy przygotować próbkę w wysokiej temperaturze. Jako kontrolę, obok złożonych i nieprzebadanych składów lipidowych, można zastosować prosty, sprawdzony skład lipidowy. Należy upewnić się, że szkło jest czyste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Aktyna nie polimeryzuje</td>
			<td colspan="4">&#160;Bufor docelowy jest przeterminowany, zapas G-aktyny jest zbyt stary, stara i nowa G-aktyna zostały poddane wspólnej polimeryzacji.&#160;</td>
			<td colspan="4">Upewnij się, że Ca2+ zostaje zastąpiony przez Mg2+ przed polimeryzacją (używając buforu ME). Należy użyć świeżego ATP-Mg2+ roztwór zapasowy. Należy użyć świeżo recyklingowanej G-aktyny. Należy upewnić się, że stężenie F-aktyny (wyrażone jako G-aktyna) dodanej do dwuwarstwy jest wyższe niż 0.2 &#181;MW przypadku niższych stężeń należy zastosować F-aktynę stabilizowaną falloidyną.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Aktyna nie wiąże się z dwuwarstwą</td>
			<td colspan="4">Łącznik błona-aktyna nie został dodany lub dodano go w bardzo niskim stężeniu — można to wywnioskować z fluorescencji białka łącznikowego. Jeśli fluorescencja jest wyraźna, oznacza to, że łącznik błona-aktyna utracił zdolność wiązania aktyny. Ponadto, jeśli białko łącznikowe wiąże się niespecyficznie z powierzchnią szkła (w przypadku wadliwej dwuwarstwy), może nie rekrutować filamentów aktynowych.</td>
			<td colspan="4">Upewnij się, że warstwa dwuwarstwowa ulega dyfuzji. Użyj świeżego białka łączącego.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Sygnał fluorescencyjny F-aktyny jest słaby</td>
			<td colspan="4">Stosunek aktyny znakowanej do nieznakowanej jest zbyt niski. Albo aktyna znakowana, albo nieznakowana jest zbyt stara, przez co nie ulegają one wspólnej polimeryzacji.</td>
			<td colspan="4">Ponownie odzyskaj aktynę i powtórz polimeryzację, używając świeżo odzyskanej aktyny. Uszkodzenia fotochemiczne mogą niszczyć lub depolimeryzować F-aktynę; jeśli to możliwe, w przypadku aktyny (i miozyny) stosuj barwniki czerwone lub dalekie czerwone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>Miozyna nie wykazuje zdolności do kurczenia się</td>
			<td colspan="4">można zauważyć, że po dodaniu ATP do układu nasyconego miozyną, akto-miozyna nie wykazuje zdolności do kurczenia się.&#160;</td>
			<td colspan="4">Należy sprawdzić, czy stężenie lub poziom czystości miozyny jest odpowiedni. Należy użyć świeżo odzyskanym miozyny (wykorzystać w ciągu 6 tygodni od odzyskania). Pomocne może być dodanie świeżego ATP do mieszaniny miozyny. Odgazowanie buforów oraz stosowanie pochłaniaczy tlenu itp. może ograniczyć fotouszkodzenia motorów molekularnych.&#160; Dalsze informacje można znaleźć w protokołach opracowanych przez Plastino i wsp. lub Stam i wsp. z tego samego zbioru metod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Łańcuszek szkiełka podstawowego nie jest hydrofilowy</td>
			<td colspan="4">Kapturek szkiełka nie został odpowiednio oczyszczony.</td>
			<td colspan="4">Czyste hydrofilowe szkiełko nakrywkowe jest&#160; kluczowe dla formowania dwuwarstwy lipidowej. Przydatnym, wizualnym wskaźnikiem hydrofilowości szkiełka podstawowego po zastosowaniu protokołu czyszczenia jest obserwacja zwilżalności szkła przez wodę. Należy dodać niewielką objętość wody na płasko leżące szkiełko. Jeśli szkiełko nie zostało odpowiednio oczyszczone, woda pozostanie w kształcie okrągłej kropli. Natomiast na potraktowanym hydrofilowym szkiełku ta sama objętość wody rozprzestrzeni się, tworząc cienką warstwę. Taka charakterystyka zwilżania powierzchni szkiełka przez wodę może służyć do potwierdzenia skuteczności etapów czyszczenia z użyciem roztworu czyszczącego/NaOH.&#160;.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów podsumowujący typowe problemy i odpowiadające im rozwiązania.
Wideo uzupełniające S1: Kurczliwe przepływy akto-miozynowe napędzają lokalne skupianie białka łącznika błona-aktyna HYE.Timelapse TIRF białka HYE (oznaczonego YFP), filamentów aktyny (oznaczonych maleimidem Atto-635) oraz filamentów miozyny II (oznaczonych maleimidem Atto-565) po dodaniu miozyny II do SLB zawierającej HYE i F-aktynę. Czas jest wskazany u góry: 0 min to moment bezpośrednio przed pojawieniem się fluorescencyjnych miofilamentów w polu TIRF. Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Tutaj demonstrujemy stosunkowo prostą i nieskomplikowaną procedurę składania sieci aktomiozyny na uwięzi błonowej i badania dynamiki przy użyciu zaawansowanych technik mikroskopu świetlnego. Kluczową zaletą jest to, że nasz test pozwala na sekwencyjne dodawanie białek i małych cząsteczek bez naruszania sieci połączonych błoną. Metodę tę można łatwo zaadaptować do badania innych białek cytoszkieletu lub sieci kompozytowych.Najważniejszą częścią protokołu jest upewnienie się, że podparta dwuwarstwa lipidowa jest prawidłowo utworzona, więc najpierw musieliśmy opanować ten krok, zanim zaczniemy dodawać białka cytoszkieletu. Na początek weź od trzech do pięciu prostokątnych szklanych szkiełek nakrywkowych i umieść je w słoiku z kopeliną. Włącz sonograf do kąpieli i ustaw temperaturę na 65 stopni Celsjusza.Napełnij słoik z kopiną 2% roztworem czyszczącym, aby całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe i umieść go w sonikatorze na 30 minut w trybie pełnego impulsu. Użyj kleszczyków pokrytych PTFE, aby usunąć szkiełka nakrywkowe jeden po drugim. Dokładnie opłucz je wodą destylowaną i umieść w innym słoiku z kopiną wypełnionym dwoma normalnymi wodorotlenkami sodu.Sonikować szkiełka nakrywkowe przez 20 minut w trybie pełnego impulsu. Usuń szkiełka nakrywkowe, dokładnie spłucz wodą destylowaną i umieść w innym słoiku z kopinem wypełnionym wodą destylowaną. Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść słoik w okapie chemicznym wyposażonym w dopływ azotu.Użyj rękawiczek i kleszczy, aby usunąć szkiełka nakrywkowe, aby wysuszyć je pod strumieniem azotu. Osusz obie strony i umieść je na czystej plastikowej siatce z pokrywą. Umieść pudełko ze szkiełkami nakrywkowymi w eksykatorze, aby uniknąć kontaktu z cząsteczkami kurzu, a następnie weź autoklawowane probówki do PCR i odetnij ich pokrywki i dolne stożkowe połówki ostrym ostrzem chirurgicznym.Weź cylindryczne rurki nacięte na pół, nałóż klej utwardzany promieniami UV na gładką krawędź każdej przeciętej rurki i umieść go odwrócony na świeżo oczyszczonym szkiełku nakrywkowym tak, aby obręcz przylegała płasko do szkiełka nakrywkowego. Nie przesuwaj cylindra na boki po umieszczeniu go na szkiełku nakrywkowym, aby upewnić się, że klej nie rozleje się do środkowej przestrzeni komory. Umieść szkiełka nakrywkowe z łożyskiem komory w środku do czyszczenia ozonem UV z dopływem tlenu i odkurzaniem.Włącz światło UV i świec przez trzy do pięciu minut, aby klej mógł się polimeryzować. Wyjmij szkiełka nakrywkowe i przetestuj komory pod kątem szczelności, a nieszczelne komory wyrzuć. Umyj każdą komorę buforem tworzącym SLB, pozostawiając na końcu 100 mikrolitrów buforu.Oznaczyć poziom buforu na 100 mikrolitrów markerem permanentnym, następnie dodać dwa mikrolitry 0,1 molowego chlorku wapnia do komory, a następnie osiem mikrolitrów roztworu SUV do każdej komory i inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Usunąć 50 mikrolitrów buforu tworzącego SLB, pozostawiając tylko 50 mikrolitrów w komorze próbki, a następnie dodać 100 mikrolitrów jednego XKMEH do komory i delikatnie wymieszać. Usuń 100 mikrolitrów buforu, nie dotykając dna.Powtórz pranie od ośmiu do 10 razy, dodając 100 mikrolitrów jednego XKMEH i usuwając 100 mikrolitrów. Dodaj 10 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr beta-kazeiny do dwuwarstwy, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Zmyj beta-kazeinę trzykrotnie jednym XKMEH i przywróć poziom buforu do 100 mikrolitrów.Podczas inkubacji beta-kazeiny wyjmij podwielokrotność białka łączącego błona-aktyna o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, szybko rozmrożonego w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzymaj ją na lodzie. Rozcieńczyć podwielokrotność buforem rozcieńczającym białka do stężenia jednego mikromola. Dodać białko łącznikowe do roztworu o określonym stężeniu końcowym i delikatnie wymieszać.Inkubować przez 30 do 40 minut w temperaturze pokojowej i przemyć trzy do pięciu razy jednym buforem XKMEH w celu usunięcia niezwiązanego białka HSE. Doprowadzić poziom bufora w każdej komorze z powrotem do oznaczenia 100 mikrolitrów. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania.Włącz mikroskop, lasery wzbudzające i kamery wykrywające. Upewnij się, że laser jest wyrównany, obiektyw jest wyczyszczony, a oprogramowanie jest gotowe do robienia zdjęć. Nałóż olej na 100-krotny obiektyw, zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu i skup obiektyw na dwuwarstwie.Upewnij się, że położenie lasera jest takie, że ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu od próbki. Użyj wzbudzenia 488 nanometrów. Aby określić integralność dwuwarstwy, wykonaj szybki test FRAP, wybierając obszar zainteresowania na dwuwarstwie i rejestrując kilka obrazów pola widzenia przy użyciu warunków obrazowania, które zapewniają stosunek sygnału do szumu wynoszący pięć do jednego lub więcej.Wstrzymaj zapis i zamknij przysłonę polową mikroskopu TIRF, aby skupić skoncentrowaną wiązkę laserową na małym okrągłym obszarze dwuwarstwy, aby miejscowo wybielić fluorofory. Włącz laser do maksymalnej wydajności, aby fotowybielać mały obszar przez trzy do 10 sekund, a następnie wyłącz laser. Ponownie otwórz przysłonę pola do jej pierwotnego promienia, dostosuj warunki obrazowania z powrotem do ustawień sprzed wybielania i natychmiast wznów rejestrację odzyskiwania sygnału fluorescencyjnego w polu view.Sprawdź, czy dwuwarstwa jest płynna i zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki TIF z kropkami. Wymieszaj nieznakowaną i znakowaną fluorescencyjnie G-aktynę w stosunku 10 do jednego mola i uzupełnij buforem G, tak aby stężenie G-aktyny wynosiło 20 mikromolów. Dodaj jedną dziesiątą z 10 razy bufor ME do mieszanki, aby uzyskać jednorazowy roztwór, i inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Następnie szybko rozmrozić fiolkę z białkiem do zakręcania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie trzymać ją na lodzie. Rozcieńczyć G tak, aby stężenie białka zamykającego było teraz dwukrotnie wyższe niż pożądane stężenie końcowe, a następnie dodać równą objętość rozcieńczonego roztworu białka zamykającego do mieszanki aktyny. Na koniec dodać równą objętość świeżego dwukrotnie pomnożonego buforu docelowego do mieszaniny reakcyjnej.Ostateczna objętość roztworu powinna być czterokrotnie większa od objętości mieszaniny aktyny. Upewnij się, że końcowe stężenie składników jest zgodne z opisem w manuskrypcie tekstowym. Próbki inkubować w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut, aby umożliwić polimeryzację.Delikatnie odpipetować pięć mikromolowych spolimeryzowanych aktyn końcówką pipety i dodać do czystej autoklawowanej probówki do PCR. Dodaj jeden XKMEH do probówki, aby końcowa objętość była większa niż 20 mikrolitrów, i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć ścinania F-aktyny. Z zamontowanej komory na próbkę usunąć równą objętość buforu.Dodaj spolimeryzowany roztwór aktyny do komory i delikatnie pipetuj trzykrotnie w górę iw dół, nie dotykając dwuwarstwy na dole. Zamontuj próbkę pod mikroskopem TIRF i pozwól jej odpocząć przez 20 do 30 minut. Nagraj kilka obrazów z różnych pól widzenia po tym, jak dodatek F-aktyny osiągnie stan ustalony.Po 30 minutach inkubacji aktyny zamontuj próbkę z powrotem na mikroskopie. Sprawdź sygnał na kanałach białka łącznikowego i F-aktyny. W razie potrzeby dostosuj warunki obrazowania.Wybierz dobry region do długiego nagrania poklatkowego. Nagraj od 10 do 15 klatek z częstotliwością od 0,1 do 0,2 herca przed dodatkiem miozyny i wstrzymaj nagrywanie. Odpipetować wymaganą objętość przetworzonej miozyny mięśniowej dwie z fiolki podstawowej za pomocą końcówki pipety i dodać do czystej, autoklawowanej probówki do PCR.Natychmiast dodaj jeden XKMEH do probówki, aby objętość przekroczyła 20 mikrolitrów i delikatnie wymieszaj. Ostrożnie usunąć równą objętość buforu KMEH z zamontowanej komory na próbkę, nie naruszając jej, i delikatnie dodać roztwór miozyny do komory próbki. Nie pipetuj w górę i w dół, ponieważ zakłóci to filamenty związane z powierzchnią.Natychmiast wznów nagrywanie poklatkowe i zapisz wszystkie obrazy, a następnie utwórz obrazy tła dla wszystkich kanałów, używając próbki tylko buforowej. Zapisz wszystkie obrazy jako pliki TIF. Dopasowana wartość współczynnika dyfuzji wynosiła 1,34 mikrometra kwadratowego na sekundę, co ściśle pokrywało się z obliczoną wartością opartą na wzorze wynoszącą 1,39 mikrometra kwadratowego na sekundę.Profil linii po fotowybielaniu i profil regeneracji wybielonego obszaru pasują odpowiednio do równań czwartego i piątego. Ruchoma frakcja dwuwarstwy lipidowej reprezentująca frakcję wybielonej populacji, która wraca do zdrowia, była większa niż 0,9, co wskazuje na dobrą dwuwarstwę lipidową. Aktywność miozyny indukowała kurczliwe przepływy aktomiozyny, które pojawiały się w strukturach astropodobnych w stanie stacjonarnym, napędzając lokalne grupowanie sprzężonego komponentu błonowego.Można użyć różnych technik mikroskopowych, takich jak interferometryczna mikroskopia rozpraszająca, aby zbadać dynamikę nieznakowanych sieci aktomiozyny bez wywoływania jakichkolwiek uszkodzeń fotograficznych lub użyć mikroskopii fluorescencyjnej o super rozdzielczości. Technika ta toruje drogę naukowcom zainteresowanym zrozumieniem, w jaki sposób kompleksy białek błonowych oddziałują z dynamiczną siecią aktomiozyny w celu modulowania ich architektury i składu.

reconstitution-membrane-tethered-minimal-actin-cortices-on-supported

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Poznaj metodę rekonstytucji minimalnych sieci aktynowo-miozynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych. Technika umożliwia badanie dynamiki cytoszkieletu za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Przeglądaj więcej filmów