Pierwotna hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń

Zaburzenia związane z RPE pozostają główną częścią łączenia chorób, ale bez skutecznych pozostałości w wirtualnej hodowli pierwotnych komórek RPE, które mogłyby służyć jako dobry model do fizjologicznych i patologicznych badań zaburzeń związanych z RPE. W tym protokole zapewniamy łatwy do naśladowania protokół hodowli pierwotnych IPC, który może szybko przywrócić i utrzymać późniejsze cechy RP, wierzymy, że przy użyciu tej metody ludzie mogą szybko wygenerować komórki RP z badań klinicznych i badań przesiewowych leków ochronnych, co może ułatwić opracowanie nowego leczenia zaburzeń RPE. Demonstracja wartości krok po kroku znacznie ułatwi powtórzenie tej metody w różnych laboratoriach, które chcą badać komórki RP.

Aby rozpocząć rozmrażanie enzymu trawienia tkanek malaquad i sterylizować 1X PBS. Uzupełniony 2% penicyliną i 2% streptomycyną przez filtrowanie roztworu przez strzykawkowy filtr o średnicy 0,22 mikrometra. Umyj dołki płytki hodowlanej i wkładek transwell za pomocą 1X PBS.

Usunąć PBS ze studzienek i transwelli za pomocą pipety i dodać jeden mililitr świeżego 1X PBS do dolnej komory i 600 mikrolitrów po 10 mikrogramów na mililitr roztworu Lamininy do górnej komory. Inkubuj płytki i wkładki transwell w tym inkubatorze helicikultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie wyjmij roztwór laminatu z górnej komory i umyj jednym mililitrem zimnego 1X PBS dwa razy przed umieszczeniem ogniwa Wyczyść okap przepływowy laminatu za pomocą 75% etanolu i światła UV.

Przygotuj trzy 50-mililitrowe sterylne probówki wirówkowe zawierające około 25 mililitrów 75% etanolu, trzy 50-mililitrowe sterylne probówki wirówkowe zawierające około 25 mililitrów 1X PBS i trzy 10-centymetrowe sterylne naczynia do hodowli komórkowych zawierające około 15 mililitrów 1X PBS. Namocz cztery gałki oczne świni w około 15 mililitrach 75% etanolu na 10-centymetrowej szalce Petriego i użyj nożyczek i kleszczy, aby odciąć wszystkie pozostałe tkanki łączne i mięśnie. Aby odkazić gałki oczne, namocz i umyj cztery gałki oczne w trzech 50-mililitrowych sterylnych probówkach wirówkowych wypełnionych kolejno 75% etanolem.

Następnie umyj gałki oczne w trzech 50-mililitrowych sterylnych probówkach wirówkowych wypełnionych sekwencyjnie 1X PBS. Odwracaj rurki co minutę, aby dokładnie umyć gałki oczne. Przenieś cztery gałki oczne do 10-centymetrowego sterylnego naczynia do hodowli komórek zawierającego 1X PBS.

Ponownie przytnij zewnętrzną powierzchnię każdej gałki ocznej, aby usunąć nerw wzrokowy i drobne zanieczyszczenia. Użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie na przecięciu rąbka i twardówki. A następnie usuń rogówkę, tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i siatkówkę nerwową.

Przenieś kompleks twardówki naczyniówkowej RPE do nowego 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej i wykonaj cztery cięcia, aby spłaszczyć muszlę oczną w kształt czterolistnej koniczyny. Wykonuj wycieczki w trawieniu roztworu EDTA, umieszczając cztery kompleksy twardówki naczyniówki RPE w nowym 10-centymetrowym naczyniu i wlewając 20 mililitrów świeżego roztworu EDTA trypsyny, aby połączyć kompleksy twardówki naczyniówki RPE. Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na prawie 30 minut.

Po 30 minutach wyjmij naczynie z inkubatora i dodaj do naczynia 20 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych z 10% FBS. Aby zneutralizować wyzwalacze w roztworze EDTA, użyj pięciomililitrowej pipety transferowej, aby oddzielić komórki RPE poprzez delikatne kilkakrotne pipetowanie. Zbierz zawiesiny komórek do 15-mililitrowych probówek wirówkowych, a następnie delikatnie odpipetuj kolejne 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej za pomocą FBS, aby przemyć kompleksy twardówki RPE Choroids na szalce.

Zebrać komórki RPE, odwirowując probówki o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać SuperAgent za pomocą pipety i dodać kolejne pięć mililitrów pożywki hodowlanej z FBS, aby ponownie zawiesić komórki. Wirować przy 300 G przez kolejne pięć minut.

Zdekantować SuperAgent i ponownie zawiesić komórki za pomocą 12 mililitrów pożywki hodowlanej. Następnie wysiewaj od 100 000 do 200 000 komórek na studzienkę do 12 dołków na płytki hodowlane lub wkładki transwell. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa dni i zmniejsz stężenie surowicy do 1%, gdy komórki całkowicie pokryją powierzchnię studzienek na wkładkę.

Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa dni, aż do pobrania komórek. Reprezentatywne obrazy pierwotnych komórek RPE świń w dniu drugim, szóstym i dziesiątym przedstawiono tutaj. Analiza QRTPCR poziomów mRNA genów sygnaturowych w pierwotnych komórkach RPE świni, pierwotnych ludzkich komórkach RPE, komórkach ARPE 19 i tkance naczyniówki RPE świni jest wykrywana na tym obrazie graficznym

W tym przypadku GAP DH został użyty jako gen porządkowy dla RTPCR. Cztery kontrpróby biologiczne zastosowano do pierwotnych komórek RPE świni i komórki RPE 19, w których trzy kontrpróby biologiczne zastosowano do pierwotnych ludzkich komórek RPE i tkanki naczyniówki świni RPE. Poziomy ekspresji genów w komórkach ARPE 19 ustalono jako kontrolę.

Na tym rysunku przedstawiono zachodnią analizę krwi białek RPE 65 w komórkach ARPE 19 i świńskich komórkach RPE oraz w pierwotnych ludzkich komórkach RPE i tkankach naczyniówki świni RPE. Winkulina była tutaj używana jako kontrola obciążenia. Rysunek ten przedstawia dwutygodniową hodowlę komórek RPE świni w pożywce DMEM Basic z 1% FBS.

Komórki hodowane z laminą lub bez niej barwiono RPE 65, APTA sodowo-potasowymi, Z01 i Hex. Pomiary TR w arkuszach komórek, hodowanych z lamininą lub bez, przedstawiono na tym rysunku. Na tym rysunku pokazano zachodnią analizę krwi czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego lub VEGF i czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego lub PEDF w pierwotnych komórkach RPE i ARPE 19 świń.

Na obrazach przedstawiono funkcje sektorowe hodowanych pierwotnych komórek RPE i ARPE 19 świń. Dużą częścią tego protokołu jest rozpuszczenie komórek RP z kompleksów glejowych chodów RPE. Zalecamy każdorazowe stosowanie świeżych porcji i roztworu oraz odpowiednie kontrolowanie czasu trawienia, aby rozpuścić osiem komórek RP.