Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Wysokoprzepustowy test podwójnej addycji fluorescencji wapnia umożliwia identyfikację nowych małocząsteczkowych ligandów receptora sprzężonego z białkiem G, który sygnalizuje przez wewnątrzkomórkową kaskadę wapnia. Główną zaletą testu podwójnej addycji jest wykrycie agonisty i antagonisty HTS w jednym teście z tymi samymi komórkami, pod warunkiem, że sygnał fluorescencyjny trwa dwie minuty. Metodę tę można zastosować do dowolnego GPCR, który sygnalizuje przez kaskadę wapnia, która obejmuje większość rodziny peptydów neuronów stawonogów, GPCR.

Aby zapewnić odtwarzalność testu, ważne jest, aby zoptymalizować gęstość komórek, szybkość wstrzykiwania i stężenie znanego agonisty dla drugiej edycji. Procedurę zademonstruje Bianca Henriques-Santos, adiunkt w moim laboratorium. Rozpocznij test fluorescencji wapnia od usunięcia zużytej pożywki z kolby T-75 zawierającej od 70 do 90% zlewających się trzech komórek BMLK.

Umyj komórki 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco lub DPBS. Po usunięciu DPBS odłącz komórki za pomocą dwóch mililitrów 0,25% trypsyny, kwasu etylenodiaminotetraoctowego lub EDTA i inkubuj przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj osiem mililitrów selektywnej pożywki i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Przed odwirowaniem zawiesiny komórkowej o sile 1000 x g przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki F-12K zawierającej 1% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i 400 mikrogramów na mililitr siarczanu G418. Aby określić gęstość komórek zawiesiny do dalszego rozcieńczenia, wymieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z 20 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego, a następnie załaduj mieszaninę 20 mikrolitrów do komory zliczania komórek, która ma być odczytana przez licznik komórek pod kątem gęstości komórek.

Rozcieńczyć zawiesinę komórek przy użyciu tej samej pożywki F-12K i uzupełnić końcową objętość do 15 mililitrów przy gęstości cztery razy 10 do piątej komórki na mililitr. Aby zasiać komórki w płytce 384-dołkowej z kodem Poly-D lub PDL. Dodać 25 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do 384 dołków płytki za pomocą systemu obsługi cieczy.

Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w nawilżanym inkubatorze. Następnego dnia szybko odwróć 90% zlewającą się płytkę 384 dołków. Aby usunąć zużyte podłoże i delikatnie osuszyć na sterylnych ręcznikach papierowych dwa do trzech razy, aby usunąć cały płyn z talerza.

Wykonaj kolejne kroki w miękkim, przyciemnionym świetle wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Następnie dodaj 25 mikrolitrów barwnika ładującego do każdej studzienki za pomocą systemu obsługi cieczy, dozując 12,5 mikrolitrów do każdej studzienki z prędkością zasysania i dozowania 3,8 mikrolitra na sekundę. Powtórz ten etap pipetowania, aby osiągnąć końcową objętość 25 mikrolitrów w każdym dołku.

Po zakończeniu przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem otoczenia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Po wyrównaniu przykrytej płytki przez kolejne 30 minut, komórki są gotowe do wysokoprzepustowego badania przesiewowego lub HTS. Następnie odwirować płytkę leku o sile 1200 x g w wirówce płytkowej przez jedną minutę.

Przenieś 10-krotny roztwór peptydu agonistycznego Rhimi-K-1 do 150-mililitrowego zbiornika automatycznego ładowania. W czytniku tabliczek kliknij przycisk Zarządzaj protokołami. Następnie w protokole intensywności fluorescencji punktu końcowego wybierz wstępny odczyt Flow Forte, kliknij przycisk rozpocznij pomiar, aby zmierzyć sygnał tła dla całego testu HTS.

Włóż płytkę kuwety do czytnika płytek. W zestawie wskaźników kliknij losowe zagłębienie na tabliczce, a następnie kliknij nową wysokość ostrości. Kliknij regulację ostrości.

Kliknij regulację wzmocnienia. Przypisz go jako 5% do 10% maksymalnej mierzalnej wartości fluorescencji. Kliknij przycisk Rozpocznij regulację.

Kliknij przycisk rozpocznij pomiar, aby odczytać całą płytkę pod kątem sygnału fluorescencji tła w jednostkach fluorescencji względnej lub RFU. Podczas odczytu płyty kliknij bieżący stan, aby zobaczyć wartość odczytu w czasie rzeczywistym. W przypadku testu z podwójnym dodawaniem, należy trzykrotnie odpipetować 10 mikrolitrów roztworu leku w górę iw dół za pomocą systemu obsługi cieczy i zassać 1,5 mikrolitra z każdej studzienki płytki leku z prędkością aspiracji 1,0 mikrolitra na sekundę.

Dozować 0,5 mikrolitra związków do testu komórkowego, aby osiągnąć końcowe stężenie dwóch mikromoli w 0,2% dimetylosulfotlenku lub DMSO. Po dodaniu związków przesiewowych należy natychmiast umieścić płytkę testową w czytniku płytek. Kliknij zaprogramowany program odczytu i odczytaj tabliczkę w kierunku czytania do przodu i do tyłu.

Usunąć jeden mikrolitr roztworu leku pozostałego w końcówkach, zanurzając końcówki w 150-mililitrowym zbiorniku na odpady zawierającym około 50 mililitrów DPBS. Inkubować związki przesiewowe z komórkami przez łącznie pięć minut, wliczając w to czas spędzony w czytniku płytek w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy wyłączonym świetle. Następnie dodaj trzy mikrolitry peptydu agonistycznego Rhimi-K-1 ze zbiornika do płytki testowej za pomocą systemu obsługi cieczy za pomocą końcówek 384 12,5 mikrolitrów.

Natychmiast umieścić płytkę w czytniku płytek. Kliknij zaprogramowany program odczytu i odczytaj tabliczkę w kierunku czytania do przodu i do tyłu. Po wykonaniu ręcznego obliczenia współczynnika Z' dla kontroli jakości każdego testu na płytce.

Ręcznie wybierz cząsteczki trafienia z map cieplnych na internetowej platformie danych HTS i oblicz znormalizowany procent aktywacji lub NPA i aktywność hamującą lub I0 dla trafień agonistów i uderzeń antagonisty. Do zademonstrowania tego testu HTS użyto wewnętrznej płytki leku SAC2-34-6170 składającej się z 320 losowych małych cząsteczek. HTS miał doskonałą jakość testu ze współczynnikiem Z' wynoszącym 0,7, co odzwierciedlało, że jakość testu była niezależna od badanych związków.

Konieczne jest odczytanie płytki natychmiast po dodaniu agonisty, ponieważ sygnał fluorescencyjny jest krótkotrwały. Po tej procedurze zidentyfikowana cząsteczka trafienia powinna zostać zwalidowana za pomocą testów dawka-odpowiedź i przetestowana w komórkach, które nie wyrażają docelowego GPCR, aby wykluczyć trafienia niezgodne z celem.