Name: Test fluorescencji wapnia z podwójnym dodaniem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj test fluorescencji wapnia z podwójnym dodaniem do wysokoprzepustowego przesiewania ligandów receptorów sprzężonych z białkiem G. Ta metoda umożliwia jednoczesną detekcję agonistów i antagonistów w komórkach CHO-K1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (numer nagrody 2022-67015-36336, PVP [Dyrektor Projektu]) oraz z konkurencyjnych funduszy z Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) dla P.V.P. Grupa wydziałowa A.W.E.S.O.M.E. z Kolegium Rolnictwa i Nauk Przyrodniczych, TAMU, jest wdzięczna za pomoc w edycji manuskryptu. Tabela uzupełniająca S2 zawiera dane z wewnętrznej, losowej biblioteki małych cząsteczek uzyskanych z laboratorium dr Jamesa Sacchettiniego na Texas A&M University i Texas A&M AgriLife Research.

1. Hodowla komórek
UWAGA: Linia komórkowa CHO-K1 stabilnie wykazująca ekspresję receptora kininowego z R. microplus, nazwana BMLK3, została opracowana przez Holmesa i wsp.16. Szczegóły opracowania tej linii komórkowej przedstawiono w innej publikacji14. Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.
<ol>
	<li>Hodować rekombinowaną linię komórkową w pożywce selektywnej (pożywka F-12K zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] i 800 µg/mL siarczanu G418), aby zapewnić ekspresję docelowego receptora. Komórki stabilnie eksponujące receptor przechowywać w 1 mL pożywki do mrożenia (90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) w 2 mL krio-probetce w zamrażarce o temperaturze −80 °C. 
	UWAGA: W celu długoterminowego przechowywania zamrożonych komórek należy przechowywać je w ciekłym azocie.</li>
	<li>Podgrzać wszystkie pożywki przed hodowlą komórkową. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść 13 mL podgrzanej pożywki selektywnej (pożywka F-12K zawierająca 10% FBS i 800 µg/mL siarczanu G418) do kolby T-75 i pozostawić ją w komorze. Rozmrozić jedną probetkę zamrożonych komórek BMLK3 (~1,5 × 106 komórek) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 min. Przenieść rozmrożone komórki do kolby T-75. Hodować komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2, chyba że określono inaczej.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 90% konfluencji (po 1-2 dniach), podgrzać wszystkie pożywki do 37 °C z wyjątkiem soli fosforanowej w buforze Dulbecco (DPBS), którą należy przechowywać w temperaturze pokojowej. W komorze z laminarnym przepływem powietrza usunąć zużytą pożywkę z kolby T-75, przemyć komórki przez 5 s 10 mL DPBS, delikatnie kołysząc kolbą, a następnie usunąć DPBS za pomocą pipety serologicznej. 
	UWAGA: Obraz komórek CHO-K1 przy 90% konfluencji przedstawiono w pracy Lu et al.14.</li>
	<li>Oddzielić komórki od ścianek kolby T-75, dodając 2 mL 0,25% trypsyny-EDTA, i inkubować przez 3-5 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Następnie dodać 8 mL pożywki selektywnej i dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując i wypuszczając ciecz 2-3 razy tą samą pipetą serologiczną.</li>
	<li>Przenieść 2 mL zawiesiny komórkowej (~1 × 106 komórek) z kroku 1.4 do nowej kolby T-75 zawierającej 10 mL ciepłej pożywki selektywnej. Hodować komórki przez 1-2 dni w inkubatorze, aż osiągną 90% konfluencji.</li>
	<li>Wykorzystać komórki do analizy zgodnie z następnymi krokami lub powtórzyć kroki 1.4-1.5 jeden lub dwa razy przed użyciem komórek w analizie. 
	UWAGA: Nie przekraczać trzech do czterech pasażów, ponieważ w przypadku niektórych linii komórkowych sygnał analizy może osłabnąć przy kolejnych pasażach.</li>
</ol>
2. Analiza fluorescencji wapnia
<ol>
	<li>Pokryj płytkę z komórkami.
	<ol>
		<li>Do wszystkich etapów pipetowania w płytkach 384-dołkowych należy używać systemu do obsługi cieczy umieszczonego w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Należy stworzyć dedykowane programy do pipetowania do płytek 384-dołkowych.31 (Tabela uzupełniająca S1). Sterylne płytki 384-dołkowe należy pokryć warstwą białka z wyprzedzeniem. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy załadować 10 µL/well roztworu wodnego poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 0,05 mg/ml do każdej płytki, a następnie inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Opróżnij płytkę, szybko ją odwracając i delikatnie osuszając sterylnymi ręcznikami papierowymi. Następnie przepłucz każdą studzienkę za pomocą 10 µL wody, opróżnić płytkę i pozostawić ją do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez noc bez przykrywki. Zamknąć płytkę przykrywką i przechowywać w 4 °C w lodówce. 
		UWAGA: Płytki powlekane można przechowywać w 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Wyjmij płytkę z lekiem (100 µM w 90% DPBS + 10% DMSO, stężenie końcowe w studzience dla HTS wyniesie 2 µM) przechowywano w temperaturze −20 °C zamrażarkę i pozostawić w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Układ płytki z lekami: Każda płytka 384-dołkowa (24 kolumny x 16 rzędów) zawiera 320 dołków z różnymi związkami z biblioteki oraz 64 dołki z samym rozpuszczalnikiem (DPBS zawierający 10% DMSO), rozmieszczone w czterech kolumnach, po dwie kolumny na brzegach każdej strony. Patrz Tabela uzupełniająca S2 dla układu płytek.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną ok. 70%–90% konfluencji w kolbie T-75, należy odłączyć je od ścianek kolby zgodnie z poniższym opisem. Wszystkie pożywki należy uprzednio ogrzać do 37 °C z wyjątkiem DPBS (temperatura pokojowa).
		<ol>
			<li>Usunąć zużyte pożywkę, przemyć komórki 10 ml DPBS, a następnie usunąć DPBS. Odłączyć komórki od ścianek kolby T-75, używając 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 3–5 min w temperaturze 37 °C do inkubatora, dodaj 8 ml pożywki selekcyjnej, a zawiesinę komórkową przenieś do 15 ml probówki stożkowej i wiruj przy 1000 × g przez 3 min.</li>
			<li>Odrzuć nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 ml pożywki F-12K zawierającej 1% FBS oraz 400 µg/mL Siarczan G418. Przechowywać zawiesinę w komorze z laminarnym przepływem powietrza podczas oznaczania liczby komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyznacz gęstość komórek w zawiesinie w celu dalszego rozcieńczenia: Wymieszaj 20 µL zawiesiny komórkowej do 20 µL 0,4% błękitu trypanowego, a następnie nałożyć 20 µL mieszaniny do komory licznikowej w celu odczytu gęstości komórek za pomocą licznika komórek.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w tym samym medium (medium F-12K zawierającym 1% FBS i 400 µg/mL siarczan G418) do objętości końcowej co najmniej 15 ml przy gęstości 4 × 105 komórek/ml</li>
		<li>Wysiej komórki na płytkę 384-dołkową pokrytą PDL. Przenieś 15 µL powyższej zawiesiny komórkowej (4 × 105 komórek/ml) do 150 ml auto-friendly zbiornika na odczynniki. Wydzielić 25 µL zawiesiny komórkowej (~10 000 komórek/studzienkę) do każdej z 384 studzienek płytki, wykorzystując system do obsługi cieczy w dwóch etapach. Napełnić 384/12.5 µL zamontuj końcówki o niskiej retencji na głowicy robota do obsługi cieczy, aspiruj 12.5 µL ze zbiornika (prędkość 5.2 µL/s), a następnie dozować do każdej studzienki (prędkość: 3.1 µL/s).</li>
		<li>Powtórz pipetowanie zgodnie z poprzednim krokiem 2.2.5, aby osiągnąć 25 µL na dołek. Następnie inkubować płytkę przez noc (14–16 h) w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 w inkubatorze z nawilżaczem. 
		UWAGA: Ponieważ maksymalna objętość pipetowania wynosi 12.5 µL dla tej konkretnej głowicy, pipetowanie dla 25 µL przeprowadza się w dwóch etapach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Następnego dnia rano sprawdzić pod mikroskopem przykrytą płytkę z komórkami; jeśli nie są one konfluencyjne, należy odczekać, aż osiągną 90% konfluencji.</li>
		<li>Przygotowanie roztworu zapasu barwnika fluorescencyjnego: Resuspender liofilizowany barwnik fluorescencyjny w 100 µL DMSO oraz unikaj bezpośredniego naświetlania roztworu treściwego. Owiń probówkę folią aluminiową, aby zapobiec fotobleachingowi. 
		UWAGA: Roztwór zapasowy można podzielić na aalikwoty do 15 µL alikwoty do każdego testu na płytce, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania; alikwoty można przechowywać w temperaturze −80 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.</li>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przy wyłączonym oświetleniu, w 15 ml probówce stożkowej owiniętej folią aluminiową, przygotować barwnik do ładowania (1x), łącząc 15 µL roztworu zapasowego barwnika fluorescencyjnego (z kroku 2.3.2) oraz pozostałych wstępnie ogrzanych komponentów zestawu (37 °C): 13,5 ml 1x HHBS (bufor Hanksa z 20 mM HEPES) oraz 1,5 ml odczynnika B (inhibitor odpływu barwnika). 
		UWAGA: Podczas tego etapu światło w pomieszczeniu jest włączone.</li>
		<li>Zamknąć probówkę i dokładnie wymieszać zawartość, delikatnie odwracając probówkę kilka razy (zazwyczaj 3–5 razy). 
		UWAGA: Przechowywać w temperaturze pokojowej i zużyć mieszaninę barwnika do ładowania w ciągu 30 min.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, usunąć zużyte medium z płytki analitycznej z 384 dołkami poprzez szybkie odwrócenie płytki i delikatne osuszenie sterylnymi ręcznikami papierowymi; powtórzyć ten zabieg 2–3 razy, aby usunąć całą ciecz z płytki. Mokre ręczniki należy wyrzucić.</li>
		<li>Wyłączyć większość sztucznego oświetlenia bezpośredniego w pomieszczeniu (pozostawiając włączoną miękką, słabą lampkę biurkową lub podobne źródło światła, aby zapewnić widoczność podczas pracy) oraz w komorze bezpieczeństwa biologicznego na wszystkich etapach aż do zakończenia analizy (przez około 1,5 h).</li>
		<li>Do 150 ml zbiornika kompatybilnego z autopipetą należy wlać 15 ml barwnika do załadunku (1x) z kroku 2.3.3.
		<ol>
			<li>Transfer 25 µL barwnika do ładowania (1x) z rezerwuaru do każdej studzienki przy użyciu systemu do manipulacji cieczami z 384/12.5 µL dozowanie za pomocą końcówek o niskiej retencji 12.5 µL do każdego dołka płytki (prędkość aspiracji i dozowania: 3.8 µL/s).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz etap pipetowania zgodnie z opisem w punkcie 2.3.7.1, aby uzyskać objętość końcową wynoszącą 25 µL w każdej studni płytki. Przykryć i owinąć płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem zewnętrznym.</li>
		<li>Inkubować przykrytą płytkę z komórkami w temperaturze 37 °C w CO2 do inkubatora z nawilżaczem na 30 min, wyjąć z inkubatora i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 min w czytniku płytek lub na blacie laboratoryjnym, utrzymując płytkę przykrytą i owiniętą folią. Następnie komórki są gotowe do wysokoprzepustowego przesiewania (HTS).</li>
		<li>Przygotowanie chemiczne: Odwiruj płytkę z lekiem z kroku 2.2.1 przy 1 200 × g wirować w wirówce do płytek przez 1 min w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Przygotuj 10-krotny roztwór roboczy peptydu agonistycznego Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) (10 µM) poprzez resuspensję 100 nmol liofilizowanego peptydu w 10 ml 1x HHBS zawierającego 0,1% DMSO, a następnie przeniesienie roztworu do 150 ml dozownika kompatybilnego z systemem automatycznym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pomiar sygnału tła: Dla całego testu HTS w czytniku płytek, w ramach Protokoływybrać tryb pomiaru fluorescencji końcowej. 
		UWAGA: Sygnał fluorescencyjny odczytuje się z dna płytki przy długościach fal wzbudzenia/emisji 495 nm/525 nm.
		<ol>
			<li>Włóż płytkę z komórkami do czytnika płytek. W panel instrumentówwybierz wyreguluj wzmocnienie, wybierz a losowa studzienka na płytce, przypisać go/ją w stężeniu 5%–10% z/zby/ze maksymalna mierzalna wartość fluorescencjioraz wybierz wyreguluj wysokość (odczytu).</li>
			<li>Kliknij rozpocznij pomiar w celu odczytania całej płytki pod kątem sygnału fluorescencji tła w względnych jednostkach fluorescencji (RFU).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza „podwójnego dodawania”
		<ol>
			<li>Korzystanie z systemu do obsługi cieczy z płytkami 384-dołkowymi/12.5 µL końcówki, aby wymieszać roztwór leku w każdym dołku płytki z lekiem, pipetować 3 razy w górę i w dół 10 µL roztworu leku (w DPBS zawierającym 10% DMSO) (prędkość pipetowania: 5.2 µL/s), oraz „odessać” 1.5 µL z każdej studzienki płytki z lekiem (prędkość aspiracji: 1.0 µL/s).</li>
			<li>Odmierzyć 0.5 µL związków do płytki z testem komórkowym (prędkość pipetowania: 1 µL/s) do uzyskania stężenia końcowego wynoszącego 2 µM w 0,2% DMSO.</li>
			<li>Bezzwłocznie umieść płytkę testową w czytniku po dodaniu związków przesiewowych. Odczytaj tę samą płytkę w kierunku prostym i odwrotnym. Aby uzyskać te odczyty, zdefiniuj program odczytu od „dołka 1–384”, a następnie bezpośrednio od „384–1”. 
			UWAGA: Odczyt w obu kierunkach trwa łącznie 2 min. Taki sposób odczytu ma na celu zrekompensowanie spadku siły sygnału, który występuje podczas odczytu płytki w każdym z kierunków. Analizę odczytów przedstawiono w punkcie 3.1.</li>
			<li>pozostałą ilość należy zutylizować 1 µL roztworu leku w końcówkach poprzez zanurzenie końcówek w 150-mililitrowym zbiorniku na odpady zawierającym ok. 50 mL DPBS (prędkość dozowania: 1.0 µL/s).</li>
			<li>Inkubować związki przesiewowe z komórkami przez łącznie 5 min (wliczając 2 min odczytu płytek) w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy wyłączonym świetle. Dodać 3 µL peptydu agonisty Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) z rezerwuaru (prędkość aspiracji: 3.1 µL/s) do płytki analitycznej za pomocą systemu dozowania cieczy (prędkość dozowania: 3.1 µL/s) z 384/12.5 µL Wskazówki.</li>
			<li>Umieść płytkę w czytniku płytek natychmiast po dodaniu peptydu agonistycznego. Odczytaj płytkę w kierunku prostym i odwrotnym, korzystając z tego samego programu, co w kroku 2.3.12.3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania analitycznego powiązanego z czytnikiem płytek zainstalowanym na komputerze, oblicz odpowiedzi fluorescencji komórkowej (w RFU) dla obu odczytów po pierwszym dodaniu związku (pierwszy odczyt; RFUago [Tabela uzupełniająca S2]) oraz po etapach dodania agonisty (drugi odczyt = RFUant [Tabela uzupełniająca S2]). Każdy odczyt uzyskuje się poprzez wyciągnięcie średniej z dwóch wartości otrzymanych (nie pokazano) z odczytów płytki w kierunku przód i tył odpowiednio w kroku 2.3.12.3 i kroku 2.3.12.6. 
	UWAGA: RFUago i RFUant odnoszą się odpowiednio do jednostek względnej fluorescencji dla potencjalnych trafień agonistycznych (odczyt w kroku 2.3.12.3) i potencjalnych trafień antagonistycznych (odczyt w kroku 2.3.12.6).</li>
	<li>Wyeksportuj wszystkie trzy zestawy danych, RFUbg, RFUago i RFUant, z oprogramowania analitycznego do trzech oddzielnych arkuszy kalkulacyjnych. Każdy arkusz będzie zawierał tylko dwie kolumny: położenie studzienki i surowe RFU (pliki tutaj nie pokazane). 
	UWAGA: RFUbg odnosi się do RFU odczytu tła w kroku 2.3.11.2.</li>
	<li>Sformatuj dane z trzech arkuszy i zorganizuj powyższe dane w jednym pliku csv (patrz przykład w Tabeli uzupełniającej S2). Odejmij odczytany sygnał tła odpowiednio od RFUago i RFUant (kolumny G i H w Tabeli uzupełniającej S2).</li>
	<li>Zaimportuj plik csv do komercyjnie dostępnej „internetowej platformy danych HTS” (patrz Tabela materiałów) w celu dalszej analizy danych (Tabela 1) i ich przechowywania.</li>
	<li>Oblicz ręcznie współczynnik Z' dla kontroli jakości każdego testu na płytce, korzystając z równania (1): 
	równanie (1): 
	<img alt="Równanie współczynnika Z', ocena jakości testu, formuła w biostatystyce." src="/files/ftp_upload/64505/64505eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">    (1) 
	UWAGA: µc- i µc+ reprezentują średnie RFU odczytów z tych samych studzienek, które służą odpowiednio jako kontrole negatywne w pierwszym dodaniu po dodaniu rozpuszczalnika (czysty rozpuszczalnik, n = 64; liczby na niebiesko w Tabeli uzupełniającej S2) i jako kontrole pozytywne po dodaniu agonisty (czysty rozpuszczalnik + agonista, n = 64; liczby na magenta). Dodatkowo σc- i σc+ reprezentują ich odpowiadające odchylenia standardowe (SD).</li>
	<li>Ręcznie wybierz cząsteczki trafienia z map ciepła na „internetowej platformie danych HTS” i oblicz znormalizowany procent aktywacji (NPA) oraz aktywność inhibicyjną (Io) dla trafień agonistycznych i antagonistycznych, korzystając z równania (2) i równania (3): 
	<img alt="Formuła statycznej równowagi, równanie NPA, schemat edukacyjny, naukowe obliczanie procentowe." src="/files/ftp_upload/64505/64505eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">    (2) 
	<img alt="Statyczna równowaga; równanie: Io=[1-(RFUant-RFUbg)/µC+]×100%; schemat; obliczenia badawcze." src="/files/ftp_upload/64505/64505eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">    (3)</li>
</ol>

<ol><li>Hanlon, C. D., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outside-in+signaling+-+A+brief+review+of+GPCR+signaling+with+a+focus+on+the+Drosophila+GPCR+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family.</a> Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).</li>
<li>Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein+coupled+receptors+%28GPCRs%29+in+insects-A+potential+target+for+new+insecticide+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development.</a> Molecules. 26 (10), 2993(2021).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+in+arthropod+vectors%3A+Omics+and+pharmacological+approaches+to+elucidate+ligand-receptor+interactions+and+novel+organismal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions.</a> Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).</li>
<li>Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of GPCR signaling complexes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein+coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Signaling+pathways%2C+characterization%2C+and+functions+in+insect+physiology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260(2021).</li>
<li>Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHansen%2C+KB+%22G+Protein-Coupled+Receptors+in+Drug+Discovery%22">G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery</a>. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).</li>
<li>Bauknecht, P., Jekely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+combinatorial+deorphanization+of+Platynereis+neuropeptide+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs.</a> Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).</li>
<li>Frooninckx, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+GPCRs+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide GPCRs in C. elegans.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 167(2012).</li>
<li>Caers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 151(2012).</li>
<li>Šimo, L., Koči, J., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+for+the+neuropeptides%2C+myoinhibitory+peptide+and+SIFamide%2C+in+control+of+the+salivary+glands+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).</li>
<li>Šimo, L., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidergic+control+of+the+hindgut+in+the+black-legged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).</li>
<li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486(2013).</li>
<li>Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+%28Aedes+aegypti%29+and+tick+%28Rhipicephalus+microplus%29+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2732(2011).</li>
<li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cattle+fever+tick%2C+Rhipicephalus+microplus%2C+as+a+model+for+forward+pharmacology+to+elucidate+kinin+GPCR+function+in+the+Acari%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1008(2019).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).</li>
<li>Cox, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+characterization%2C+and+expression+of+a+G-protein-coupled+receptor+from+Lymnaea+stagnalis+and+identification+of+a+leucokinin-like+peptide%2C+PSFHSWSamide%2C+as+its+endogenous+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand.</a> Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).</li>
<li>Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDircksen%2C+H+%22Handbook+of+Biologically+Active+Peptides+%28Second+Edition%29%22">Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition)</a>. Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).</li>
<li>Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+evolutionary+origins+of+insect+renal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tracing the evolutionary origins of insect renal function.</a> Nature Communications. 6, 6800(2015).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).</li>
<li>Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+G-protein-coupled+receptor+analysis+in+Drosophila+melanogaster+identifies+a+leucokinin+receptor+with+novel+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).</li>
<li>Brock, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leucokinin-like+peptide+receptor+from+the+cattle+fever+tick%2C+Rhipicephalus+microplus%2C+is+localized+in+the+midgut+periphery+and+receptor+silencing+with+validated+double-stranded+RNAs+causes+a+reproductive+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost.</a> International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).</li>
<li>Nässel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucokinin+and+associated+neuropeptides+regulate+multiple+aspects+of+physiology+and+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940(2021).</li>
<li>Kim, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+peptidergic+ensembles+associated+with+organization+of+an+innate+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).</li>
<li>Al-Anzi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leucokinin+pathway+and+its+neurons+regulate+meal+size+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).</li>
<li>Yurgel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+pair+of+leucokinin+neurons+are+modulated+by+feeding+state+and+regulate+sleep-metabolism+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions.</a> PLoS Biology. 17 (2), 2006409(2019).</li>
<li>Nässel, D. R., Zandawala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuropeptide+signaling+in+Drosophila%2C+from+genes+to+physiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior.</a> Progress in Neurobiology. 179, 101607(2019).</li>
<li>Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+downstream+leucokinin+neurons+modulate+larval+turning+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).</li>
<li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).</li>
<li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucokinin+mimetic+elicits+aversive+behavior+in+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+and+inhibits+the+sugar+taste+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).</li>
<li>Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+small+molecule+library+screen+identifies+novel+antagonists+of+the+kinin+receptor+from+the+cattle+fever+tick%2C+Rhipicephalus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).</a> Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).</li>
<li>Torfs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinin+peptide+family+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The kinin peptide family in invertebrates.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).</li>
<li>Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+Ca2%2B+mobilization+assays+in+GPCR+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).</li>
<li>Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+GPCR+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li>
<li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B115+and+G%CE%B116+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li>
<li>Murgia, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+phenotypic+screening+identifies+novel+chemistries+that+disrupt+mosquito+activity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037(2022).</li>
<li>Lismont, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+BRET-based+biosensors+be+used+to+characterize+G-protein+mediated+signaling+pathways+of+an+insect+GPCR%2C+the+Schistocerca+gregaria+CRF-related+diuretic+hormone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Celem HTS jest identyfikacja trafionych cząsteczek poprzez badanie przesiewowe ogromnej liczby małych cząsteczek. W związku z tym wyniki z tego przykładu reprezentują tylko niewielką część konwencjonalnego eksperymentu HTS. Ponadto zidentyfikowane cząsteczki trafienia muszą zostać poddane walidacji w dalszych testach, takich jak test zależny od dawki na tej samej rekombinowanej linii komórkowej i na linii komórkowej CHO-K1 przenoszącej tylko pusty wektor, które można przeprowadzić jednocześnie w celu uratowania małych cz...

Receptory sprzężone z białkami G (GPCR), występujące od drożdży po ludzi, stanowią największą superrodzinę receptorów u wielu organizmów1. Odgrywają one kluczową rolę w regulacji niemal wszystkich procesów biologicznych u zwierząt. W genomie stawonogów znajduje się od 50 do 200 GPCR, co oznacza, że stanowią one największą superrodzinę receptorów błonowych2. Są one klasyfikowane w sześciu głównych klasach, A-F, na podstawie podobieństwa sekwencji oraz funkcji3. GPCR przekazują różnorodne sygnały zewnątrzkomórkowe, takie jak sygnały hormonów, neuropeptydów, amin biogennych, glutaminianu, protonów, lipoglikoprotein oraz fotonów4. GPCR sprzęgają się z heterotrymerycznymi białkami G (Gα, Gβ i Gγ), aby przekazywać sygnały w dół kaskady. GPCR sprzężone z białkami Gαs lub Gαi/o odpowiednio zwiększają lub zmniejszają wewnątrzkomórkowe poziomy 3', 5'-cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP) poprzez aktywację lub hamowanie cyklazy adenylowej. GPCR sprzężone z Gαq/11 indukują uwalnianie wapnia z zapasów wapniowych retikulum endoplazmatycznego poprzez aktywację szlaku fosfolipazy C (PLC)-inozytoletriofosforanu-1,4,5 (IP3). GPCR sprzężone z Gα12/13 aktywują czynniki wymiany nukleotydów RhoGTPazy5,6. GPCR są celem działania ponad 50% leków stosowanych u ludzi oraz akarycydu, amitrazu4. Ponieważ GPCR przekazują tak różnorodne sygnały, stanowią one obiecujące cele w opracowywaniu nowych pestycydów zaburzających specyficzne dla bezkręgowców funkcje fizjologiczne.
Celem HTS jest identyfikacja cząsteczek-hitów, które mogą modulować funkcje receptorów. HTS obejmuje opracowanie testów, miniaturyzację oraz automatyzację7. GPCR neuropeptydowe stawonogów biorą udział w większości funkcji fizjologicznych, takich jak rozwój, linienie i ecdysis, wydalanie, mobilizacja energii oraz rozród4. Większość GPCR neuropeptydowych stawonogów i metazoa sygnalizuje poprzez kaskadę sygnałową wapnia2,6,8,9,10, na przykład w receptorach dla peptydu mioinhibitoryjnego i SIFamide kleszcza Ixodes scapularis; ich ligandy wykazują działanie antagonistyczne w testach motoryki jelita tylnego, gdzie SIF wywołuje skurcz, a MIP go hamuje11,12. Receptor podobny do NPY u komara żółtego, Aedes aegypti, reguluje poszukiwanie gospodarza przez samice13. W porównaniu do innych alternatywnych testów mobilizacji wapnia, takich jak test bioluminescencyjny wapnia z użyciem aequoriny14, test fluorescencji wapnia jest łatwy do przeprowadzenia, nie wymaga transfekcji innych rekombinowanych białek wykrywających wapń i jest kosztowo efektywny. Test fluorescencji wapnia generuje sygnał o przedłużonym czasie trwania w porównaniu do szybkiego sygnału kinetycznego uzyskiwanego w teście bioluminescencyjnym wapnia z użyciem aequoriny14,15.
W poniższym przykładzie receptor kininowy kleszcza bydlęcego, Rhipicephalus microplus, został wyekspresowany rekombinacyjnie w linii komórkowej CHO-K1 i wykorzystany w teście fluorescencji wapnia. W genomie R. microplus znajduje się tylko jeden gen receptora kininowego; receptor ten sygnalizuje poprzez zależną od białka Gq ścieżkę sygnalizacyjną i wyzwala odpływ Ca2+ z magazynów wapnia do przestrzeni wewnątrzkomórkowej16. Proces ten może być wykrywany i ilościowo określany za pomocą fluoroforu, który generuje sygnał fluorescencyjny po związaniu jonów wapnia (Rycyna 1).
Receptor kinin jest specyficznym dla bezkręgowców białkiem GPCR, które należy do klasy A receptorów typu rhodopsyny. Kinin jest starożytnym neuropeptydem sygnałowym występującym u Mollusca, Crustacea, Insecta oraz Acari4,17,18. Chrząszcze (Coleoptera) nie posiadają systemu sygnalizacji kinin; u komara Aedes aegypti występuje tylko jeden receptor kinin, który wiąże trzy aedeskininy, podczas gdy Drosophila melanogaster posiada jeden receptor kinin z drosokininą jako jedynym ligandem19,20,21. U kręgowców nie występują homologiczne kininy ani receptory kinin. Choć dokładna funkcja kininy u kleszczy nie jest znana, samice R. microplus z wyciszonym za pomocą RNAi receptorem kinin wykazują znacznie obniżoną sprawność rozrodczą22. Kininy są peptydami pleiotropowymi u owadów. U Drosophila melanogaster uczestniczą one zarówno w centralnych, jak i obwodowych układach regulacji nerwowej23, w fazie przed-ecdysis24, w żerowaniu25, metabolizmie26 i wzorcach aktywności snu26,27, a także w lokomocji larw28. Kininy regulują skurcze jelita tylnego, diurezę i żerowanie u komara A. aegypti29,30,31. Peptydy kininy posiadają konserwatywny pentapeptyd C-końcowy Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, który jest minimalną sekwencją wymaganą do aktywności biologicznej32. Specyficzność dla stawonogów, niewielki rozmiar endogennego ligandu, co czyni go podatnym na interferencję za pomocą małych cząsteczek, oraz pleiotropowe funkcje u owadów sprawiają, że receptor kinin jest obiecującym celem w zwalczaniu szkodników4.
Analiza „podwójnego dodawania” (Rysunek 2) umożliwia identyfikację agonistów lub antagonistów w ramach tego samego testu HTS15. Została ona zaadaptowana z analizy „podwójnego dodawania”, powszechnie stosowanej w przemyśle farmaceutycznym w procesie poszukiwania nowych leków33. W skrócie, pierwsze dodanie leków do płytki z komórkami pozwala na identyfikację potencjalnych agonistów w bibliotece chemicznej w przypadku wykrycia silniejszego sygnału fluorescencji w porównaniu do zastosowania kontroli rozpuszczalnika. Po 5 min inkubacji z tymi małymi cząsteczkami, do wszystkich studzienek dodaje się znany agonista (peptyd kininowy). Te studzienki, do których losowo trafił antagonista z płytki z lekami, wykazują słabszy sygnał fluorescencji po dodaniu agonisty w porównaniu do studzienek kontrolnych, do których w pierwszym kroku dodano rozpuszczalnik. Analiza ta pozwala zatem na identyfikację potencjalnych agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek. W standardowym projekcie HTS cząsteczki te (tzw. hity) byłyby następnie walidowane poprzez analizy zależności dawka-odpowiedź oraz dodatkowe testy aktywności biologicznej, których tutaj nie przedstawiono.
<img alt="Schemat sygnalizacji receptora kinin; GPCR, wiązanie liganda, uwalnianie Ca2+, ścieżka PLC, odpowiedź komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ilustracja mechanizmu testu fluorescencji wapniowej. Białko Gq uruchamia wewnątrzkomórkową ścieżkę sygnalizacji wapniowej. Receptor kinin (receptor sprzężony z białkiem G) został wyekspresowany rekombinacyjnie w komórkach CHO-K1. Po związaniu liganda-agonisty z receptorem, białko Gq powiązane z receptorem kinin aktywuje PLC, która katalizuje przekształcenie cząsteczki PIP2 w IP3 i DAG. IP3 wiąże się następnie z IP3R na powierzchni retikulum endoplazmatycznego, co prowadzi do uwolnienia Ca2+ do cytoplazmy, gdzie jony Ca2+ wiążą się z fluoroforami i wywołują sygnał fluorescencyjny. Sygnał fluorescencyjny można uzyskać poprzez wzbudzenie przy 490 nm i detekcję przy 514 nm. Skróty: GPCR = receptor sprzężony z białkiem G; PLC = fosfolipaza C; PIP2 = fosfatydyloinozyto-4,5-bisfosforan; IP3 = inozytofolifosforan; DAG = diacyloglicerol; IP3R = receptor IP3. Utworzone przy użyciu BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przepływu pracy testu komórkowego; komórki CHO-K1, fluorofor, pomiar RFU, test z podwójnym dodaniem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64505/64505fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przepływ pracy w wysokoprzepustowym przesiewaniu małych cząsteczek w odniesieniu do receptora sprzężonego z białkiem G ekspresowanego w komórkach CHO-K1. (A) Rekombinowane komórki CHO-K1 stabilnie ekspresujące receptor kininowy zostały dodane do płytki 384-dołkowej (10 000 komórek/dołek) przy użyciu systemu manipulacji cieczami (25 µL/dołek) i inkubowane w nawilżonym inkubatorze CO2 przez 12-16 h. (B) Bufor do testu zawierający barwnik fluorescencyjny (25 µL/dołek) został dodany do płytki z komórkami za pomocą systemu manipulacji cieczami. Płytkę inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C, a następnie wyrównywano temperaturę w RT przez kolejne 30 min. (C) Sygnał fluorescencji tła komórek w każdym dołku zmierzono za pomocą czytnika płytek. (D) Roztwory leków z biblioteki w płytce 384-dołkowej oraz pusty rozpuszczalnik (wszystkie po 0,5 µL/dołek) dodano do płytki testowej z komórkami za pomocą systemu manipulacji cieczami. (E) Odpowiedzi fluorescencyjne wapnia komórkowego zmierzono czytnikiem płytek natychmiast po dodaniu roztworów leków; związki wywołujące sygnały fluorescencyjne wyższe od średniej wybrano jako trafienia agonistyczne. Trafienia antagonistyczne blokujące GPCR (ikona poniżej) ujawniono po dodaniu peptydowego agonisty w kroku G. (F) W tej samej płytce testowej, po 5 min inkubacji komórek ze związkami przesiewowymi, do każdego dołka dodano endogenny peptyd agonistyczny Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) receptora kininowego kleszcza (1 µM). (G) Odpowiedzi fluorescencyjne komórek po dodaniu peptydu agonistycznego zmierzono natychmiast za pomocą czytnika płytek. Związki hamujące sygnał fluorescencji wybrano jako trafienia antagonistyczne. Skróty: GPCR = receptor sprzężony z białkiem G; RT = temperatura pokojowa; RFU = względne jednostki fluorescencji. Stworzono za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64505/64505fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15050-065</td><td>z czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>0,4% błękit trypanowy</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154</td><td>płyn, sterylne</td></tr><tr><td>probówki mikrowirówkowe 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12400</td><td>Probówki do mikrofuge bez RNaz</td></tr><tr><td>5 ml pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>29443-045</td><td>Corning Costar Stripette pakowane pojedynczo&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Corning</td><td>29443-047</td><td>Corning Costar Stripette pakowana pojedynczo&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>20 &micro; L końcówki filtrów</td><td>USA Scientifc Inc.</td><td>P1121</td><td>sterylna, barierowa</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Corning</td><td>29443-049</td><td>Corning Costar Stripette pakowana pojedynczo&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>z podziałką, sterylne</td></tr><tr><td>150 ml automatycznie przyjazne rezerwarium</td><td>Integra Bioscience</td><td>6317</td><td>sterylne, pakowane pojedynczo do wysiewu komórek w dniu 1</td></tr><tr><td>150 ml automatycznie przyjazne rezerwarium</td><td>Integra Bioscience</td><td>6318</td><td>sterylne, ułożone w stos, do ładowania barwnika w dniu 2</td></tr><tr><td>384/ 12,5 i mikro; L końcówki o niskiej retencji</td><td>Integra Bioscience</td><td>6405</td><td>długi, sterylny filtr</td></tr><tr><td>384/ 12,5 &micro; L końcówki</td><td>Integra Bioscience</td><td>6404</td><td>długa, sterylna</td></tr><tr><td>płytka 384-dołkowa</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>CELLSTAR, polistyren bezbarwny, &mikro; Przezroczyste, czarne/</td></tr><tr><td>płaskie uszczelki z płyty aluminiowej</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td> folia aluminiowa na <td>bazie poliestru</td></tr><tr><td>Szafka</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafty II</td><td>NuAire</td><td>NU-540-300</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Prowadnice do</td> liczenia komórek Nexcelom <td>AutoT4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>20 i mikro; Komora L</td></tr><tr><td>Inkubator nawilżany CO2</td><td>Lampa biurkowa Thermo Fisher</td><td>Forma Series II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SunvaleeyTEK</td><td>RS1000B</td><td></td></tr><tr><td>Milipore</td><td>, MiliporeSigma</td><td>276855</td><td>bezhydrauliczna, >99.9%</td></tr><tr><td>Talerz leku</td><td>Corning</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031- CV</td><td>DPBS, 1x bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Mieszanka składników odżywczych&nbsp;</td><td>Corning</td><td>45000-354</td> <td>(mod. Kaighna) z L-glutaminą</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Equitech-Bio</td><td>SFBU30</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny zestaw do oznaczania wapnia</td><td>ENZO Lifescience</td><td>ENZ-51017</td><td>10x96</td></tr><tr><td>testy siarczan G418</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10131-027</td><td>Selektywny antybiotyk Geneticin 50 mg / ml</td></tr><tr><td>Bufor Hanka</td><td>MilliporeSigma</td><td>55037C</td><td>HBSS modyfikowany, z wapniem, z magnezem, bez fenolu odczyt</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>1</td></tr><tr><td>Molowa płyta do przechowywania danych HTS</td><td>CDD vault&nbsp;</td><td></td><td>https://www.collaborativedrug.com/</td></tr> <tr><td>System transportu cieczy</td><td>Integra Bioscience</td><td>Viaflo</td><td>384/12.5 &micro; L</td></tr><tr><td>Wirówka płytkowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>Sorvall ST8</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Technologia BMG</td><td>Clariostar</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lizyna</td><td>MiliporeSigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd agonistyczny Rhimi-K-1</td> Na <td>zamówienie niestandardowe</td><td>QFSPWGamide</td><td></td></tr><tr><td>T-75</td><td>kolba Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr></tbody></table>

test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem g

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) reprezentują największą nadrodzinę receptorów i są celem wielu leków stosowanych u ludzi. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) losowych bibliotek małych cząsteczek pod kątem GPCR są wykorzystywane przez przemysł farmaceutyczny do odkrywania leków specyficznych dla celu. W tym badaniu HTS wykorzystano do identyfikacji nowych małocząsteczkowych ligandów gpcr specyficznych dla bezkręgowców neuropeptydów jako sond do badań fizjologicznych wektorów śmiertelnych patogenów ludzkich i weterynaryjnych.
Specyficzny dla bezkręgowców receptor kininowy został wybrany jako cel, ponieważ reguluje wiele ważnych procesów fizjologicznych u bezkręgowców, w tym diurezę, karmienie i trawienie. Co więcej, farmakologia wielu GPCR bezkręgowców jest słabo scharakteryzowana lub w ogóle nie jest scharakteryzowana; w związku z tym farmakologia różnicowa tych grup receptorów w odniesieniu do pokrewnych GPCR u innych metazoanów, zwłaszcza u ludzi, dodaje wiedzy do relacji struktura-aktywność GPCR jako nadrodziny. Opracowano test HTS dla komórek na płytkach 384-dołkowych w celu wykrycia ligandów receptora kininy z kleszcza pomoru bydła lub południowego kleszcza bydła, Rhipicephalus microplus. Receptor kininy kleszcza ulegał stabilnej ekspresji w komórkach CHO-K1.
Receptor kininowy, gdy jest aktywowany przez endogenne neuropeptydy kininowe lub innych małocząsteczkowych agonistów, wyzwala uwalnianie Ca2+ z magazynów wapnia do cytoplazmy. Ten test fluorescencji wapnia w połączeniu z podejściem "podwójnej addycji" może wykryć funkcjonalne cząsteczki agonistów i antagonistów "trafionych" na tej samej płytce testowej. Każdy test przeprowadzono przy użyciu płytek z lekami zawierającymi 320 losowych małych cząsteczek. Uzyskano wiarygodny współczynnik Z' wynoszący 0,7 i zidentyfikowano trzy cząsteczki uderzenia agonisty i dwie antagonisty, gdy HTS osiągnął końcowe stężenie 2 μM. Opisany tutaj test fluorescencji wapnia można dostosować do badań przesiewowych innych GPCR, które aktywują kaskadę sygnalizacyjną Ca2 +.

W celu zademonstrowania tego testu HTS jako przykładu wykorzystano wewnętrzną płytkę z lekami (SAC2-34-6170) zawierającą 320 losowych małych cząsteczek. Test HTS wykazał doskonałą jakość, z czynnikiem Z' wynoszącym 0,7 (Tabela 1). Ten czynnik Z' odzwierciedla jakość testu niezależnie od badanych związków34. Czynnik Z' równy 0,5 lub wyższy wskazuje na dobry zakres dynamiki sygnału testu pomiędzy wartościami RFU kontroli pozytywnych a kontroli negatywnych. Test...

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Wysokoprzepustowy test podwójnej addycji fluorescencji wapnia umożliwia identyfikację nowych małocząsteczkowych ligandów receptora sprzężonego z białkiem G, który sygnalizuje przez wewnątrzkomórkową kaskadę wapnia. Główną zaletą testu podwójnej addycji jest wykrycie agonisty i antagonisty HTS w jednym teście z tymi samymi komórkami, pod warunkiem, że sygnał fluorescencyjny trwa dwie minuty. Metodę tę można zastosować do dowolnego GPCR, który sygnalizuje przez kaskadę wapnia, która obejmuje większość rodziny peptydów neuronów stawonogów, GPCR.Aby zapewnić odtwarzalność testu, ważne jest, aby zoptymalizować gęstość komórek, szybkość wstrzykiwania i stężenie znanego agonisty dla drugiej edycji. Procedurę zademonstruje Bianca Henriques-Santos, adiunkt w moim laboratorium. Rozpocznij test fluorescencji wapnia od usunięcia zużytej pożywki z kolby T-75 zawierającej od 70 do 90% zlewających się trzech komórek BMLK.Umyj komórki 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco lub DPBS. Po usunięciu DPBS odłącz komórki za pomocą dwóch mililitrów 0,25% trypsyny, kwasu etylenodiaminotetraoctowego lub EDTA i inkubuj przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj osiem mililitrów selektywnej pożywki i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Przed odwirowaniem zawiesiny komórkowej o sile 1000 x g przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki F-12K zawierającej 1% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i 400 mikrogramów na mililitr siarczanu G418. Aby określić gęstość komórek zawiesiny do dalszego rozcieńczenia, wymieszaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z 20 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego, a następnie załaduj mieszaninę 20 mikrolitrów do komory zliczania komórek, która ma być odczytana przez licznik komórek pod kątem gęstości komórek.Rozcieńczyć zawiesinę komórek przy użyciu tej samej pożywki F-12K i uzupełnić końcową objętość do 15 mililitrów przy gęstości cztery razy 10 do piątej komórki na mililitr. Aby zasiać komórki w płytce 384-dołkowej z kodem Poly-D lub PDL. Dodać 25 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do 384 dołków płytki za pomocą systemu obsługi cieczy.Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w nawilżanym inkubatorze. Następnego dnia szybko odwróć 90% zlewającą się płytkę 384 dołków. Aby usunąć zużyte podłoże i delikatnie osuszyć na sterylnych ręcznikach papierowych dwa do trzech razy, aby usunąć cały płyn z talerza.Wykonaj kolejne kroki w miękkim, przyciemnionym świetle wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Następnie dodaj 25 mikrolitrów barwnika ładującego do każdej studzienki za pomocą systemu obsługi cieczy, dozując 12,5 mikrolitrów do każdej studzienki z prędkością zasysania i dozowania 3,8 mikrolitra na sekundę. Powtórz ten etap pipetowania, aby osiągnąć końcową objętość 25 mikrolitrów w każdym dołku.Po zakończeniu przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem otoczenia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Po wyrównaniu przykrytej płytki przez kolejne 30 minut, komórki są gotowe do wysokoprzepustowego badania przesiewowego lub HTS. Następnie odwirować płytkę leku o sile 1200 x g w wirówce płytkowej przez jedną minutę.Przenieś 10-krotny roztwór peptydu agonistycznego Rhimi-K-1 do 150-mililitrowego zbiornika automatycznego ładowania. W czytniku tabliczek kliknij przycisk Zarządzaj protokołami. Następnie w protokole intensywności fluorescencji punktu końcowego wybierz wstępny odczyt Flow Forte, kliknij przycisk rozpocznij pomiar, aby zmierzyć sygnał tła dla całego testu HTS.Włóż płytkę kuwety do czytnika płytek. W zestawie wskaźników kliknij losowe zagłębienie na tabliczce, a następnie kliknij nową wysokość ostrości. Kliknij regulację ostrości.Kliknij regulację wzmocnienia. Przypisz go jako 5% do 10% maksymalnej mierzalnej wartości fluorescencji. Kliknij przycisk Rozpocznij regulację.Kliknij przycisk rozpocznij pomiar, aby odczytać całą płytkę pod kątem sygnału fluorescencji tła w jednostkach fluorescencji względnej lub RFU. Podczas odczytu płyty kliknij bieżący stan, aby zobaczyć wartość odczytu w czasie rzeczywistym. W przypadku testu z podwójnym dodawaniem, należy trzykrotnie odpipetować 10 mikrolitrów roztworu leku w górę iw dół za pomocą systemu obsługi cieczy i zassać 1,5 mikrolitra z każdej studzienki płytki leku z prędkością aspiracji 1,0 mikrolitra na sekundę.Dozować 0,5 mikrolitra związków do testu komórkowego, aby osiągnąć końcowe stężenie dwóch mikromoli w 0,2% dimetylosulfotlenku lub DMSO. Po dodaniu związków przesiewowych należy natychmiast umieścić płytkę testową w czytniku płytek. Kliknij zaprogramowany program odczytu i odczytaj tabliczkę w kierunku czytania do przodu i do tyłu.Usunąć jeden mikrolitr roztworu leku pozostałego w końcówkach, zanurzając końcówki w 150-mililitrowym zbiorniku na odpady zawierającym około 50 mililitrów DPBS. Inkubować związki przesiewowe z komórkami przez łącznie pięć minut, wliczając w to czas spędzony w czytniku płytek w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy wyłączonym świetle. Następnie dodaj trzy mikrolitry peptydu agonistycznego Rhimi-K-1 ze zbiornika do płytki testowej za pomocą systemu obsługi cieczy za pomocą końcówek 384 12,5 mikrolitrów.Natychmiast umieścić płytkę w czytniku płytek. Kliknij zaprogramowany program odczytu i odczytaj tabliczkę w kierunku czytania do przodu i do tyłu. Po wykonaniu ręcznego obliczenia współczynnika Z' dla kontroli jakości każdego testu na płytce.Ręcznie wybierz cząsteczki trafienia z map cieplnych na internetowej platformie danych HTS i oblicz znormalizowany procent aktywacji lub NPA i aktywność hamującą lub I0 dla trafień agonistów i uderzeń antagonisty. Do zademonstrowania tego testu HTS użyto wewnętrznej płytki leku SAC2-34-6170 składającej się z 320 losowych małych cząsteczek. HTS miał doskonałą jakość testu ze współczynnikiem Z' wynoszącym 0,7, co odzwierciedlało, że jakość testu była niezależna od badanych związków.Konieczne jest odczytanie płytki natychmiast po dodaniu agonisty, ponieważ sygnał fluorescencyjny jest krótkotrwały. Po tej procedurze zidentyfikowana cząsteczka trafienia powinna zostać zwalidowana za pomocą testów dawka-odpowiedź i przetestowana w komórkach, które nie wyrażają docelowego GPCR, aby wykluczyć trafienia niezgodne z celem.

a-dual-addition-calcium-fluorescence-assay-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami K+ wewnątrzstymulowanymi, bramkowanymi przez białka G (GIRK). Test wykorzystuje fluorescencyjne barwniki czułe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK. Technika ta może być dostosowana do zastosowania w wielu liniach komórkowych.

Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Ten film ilustruje test komórkowy z udziałem komórek glejaka wyrażających receptory chemokiny CXCR4. Test wykorzystuje barwnik wrażliwy na wapń do pomiaru zmian fluorescencji po interakcji z czynnikiem, oferując wgląd w dynamikę sygnalizacji komórkowej.

Test komórkowy do identyfikacji czynników oddziałujących z CXCR4

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

Opracowano ulepszony protokół testu mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka, używanego do identyfikacji ligandów receptorów aktywowanych proteazą (PAR). Nowy protokół skraca całkowity czas oznaczania o 90-120 minut i pozwala uzyskać powtarzalne krzywe stężenie-odpowiedź.

Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Poznaj test fluorescencji wapnia z podwójnym dodaniem do wysokoprzepustowego przesiewania ligandów receptorów sprzężonych z białkiem G. Ta metoda umożliwia jednoczesną detekcję agonistów i antagonistów w komórkach CHO-K1.

Test fluorescencji wapnia z podwójnym dodaniem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G (Wideo) | JoVE Journal

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Przeglądaj więcej filmów