Name: Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych modeli guzów z komórek pierwotnych w celu oceny wrażliwości na leczenie przeciwnowotworowe. Ta technika wspiera personalizowaną terapię onkologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pobieranie próbek ludzkich guzów używanych do hodowli pierwotnych komórek nowotworowych zostało przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) w Centrum Medycznym Rabin za pisemną świadomą zgodą pacjentów. Pacjenci kwalifikujący się do udziału w badaniu obejmowali dorosłych i dzieci płci męskiej i żeńskiej z rakiem piersi, jelita grubego, wątroby, płuc, raka neuroendokrynnego, jajnika lub trzustki, dowolnego raka dziecięcego lub dowolnego raka z przerzutami. Jedynym kryterium wykluczającym był brak zdolności do wyrażenia świadomej zgody.
1. Generowanie i zbieranie sferoid
UWAGA: Izolację pierwotnych komórek nowotworowych można przeprowadzić zgodnie z opisem Kodak et al.8. Co ważne, pierwotne komórki nowotworowe używane do generowania sferoid mogą pochodzić bezpośrednio z próbek pacjenta uzyskanych w wyniku biopsji, resekcji itp., lub pośrednio przy użyciu próbek guza z modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX), jak opisano przez Moskovits et al.9.
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę jednokomórkową przylegających pierwotnych kultur komórek nowotworowych o zbiegu 75%-100%, biorąc małą kolbę (T25) z jednokomórkową przylegającą pierwotną hodowlą komórkową, usuwając pożywkę do hodowli komórkowych, przemłukując PBS, a następnie dodając 1 ml 1x Accutase (roztwór do odrywania komórek) (patrz Tabela materiałów) przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór Accutase, dodając 5 ml pożywki do hodowli komórkowych (pożywka hodowlana RPMI-1640 uzupełniona 10% FBS, 1:100 penicyliny-streptomycyny, 1% aminokwasów endogennych i 1% L-glutaminy; patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odessać komórki pipetą serologiczną o pojemności 10 ml i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń pożywkę do hodowli komórkowych, dodaj 5 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych na wierzch osadu komórkowego i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru10. Aby to zrobić, weź porcję 50 μl zawiesiny komórek i wymieszaj ją z 50 μl błękitu trypanowego. Policz żywe komórki (komórki, które są ujemne dla koloru niebieskiego) i oblicz całkowitą liczbę żywych komórek w zawiesinie.</li>
	<li>Przygotować "pożywkę 3D do hodowli" (pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną 5% matrycą błony podstawnej; patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: "Pożywka hodowlana 3D" ma postać cieczy w temperaturze pokojowej. W temperaturze 37 °C konsystencja staje się bardziej żelowa (tak, że komórki pozostają razem), chociaż nadal można ją pipetować (ponieważ zawiera tylko 5% macierzy błony podstawnej).</li>
	<li>Obliczyć liczbę komórek potrzebnych do testu i całkowitą wymaganą objętość; każda studzienka musi zawierać 2 000-8 000 komórek w 200 μl pożywki.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek z żądaną liczbą komórek (np. 4 000 komórek) w 200 μl "pożywki hodowlanej 3D" i delikatnie wymieszać pipetą, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do zbiornika do pipetowania. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 200 μl zawiesiny komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki o bardzo niskim nasadce (patrz Tabela materiałów). Przed każdym pobraniem komórek należy dobrze wymieszać zawiesinę.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby wymusić grupowanie komórek, poprawiając w ten sposób agregację komórek, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
	<li>Co 2-3 dni odświeżaj "Pożywkę hodowlaną 3D". Odwirować płytkę przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie usunąć i wyrzucić 50% pożywki (100 μl) i dodać 100 μl świeżej "pożywki 3D" w celu zastąpienia istniejącego roztworu. Powtórz krok 1.11 i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze nawilżanym o temperaturze 37 °C, 5% CO2. 
	UWAGA: Usuwanie pożywki należy wykonać, gdy płytka jest trzymana pod kątem 45°, a pożywka musi być pobierana tylko z górnej części, aby uniknąć gromadzenia się komórek. Nie należy stosować próżniowego systemu ssącego. Świeżą pożywkę należy dodawać powoli i delikatnie, aby nie zakłócić sferoid, które już zaczną się formować.</li>
	<li>Sprawdzaj komórki pod mikroskopem co 1-2 dni, aby monitorować tworzenie się sferoidów. Zmierz średnicę utworzonych sferoid za pomocą narzędzia "skala" w oprogramowaniu do obrazowania (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Oględziny mikroskopowe powinny najpierw ujawnić nieregularne, okrągłe lub owalne ciała, które w miarę upływu czasu przybierają kształt sferoidalny11,12.
	<ol>
		<li>Gdy średnica sferoidy osiągnie 100-200 μm, przeprowadź eksperymenty skuteczności leku. 
		UWAGA: Eksperymenty skuteczności leku są przeprowadzane, gdy sferoidy osiągają tę średnicę, ponieważ w tym czasie większość komórek ulega proliferacji, co sprzyja ocenie odpowiedzi na leczenie. Sferoidy o większej średnicy zawierają nekrotyczny rdzeń i warstwę spoczynkową11,12, co skutkuje mniejszym odsetkiem proliferujących komórek, które reagują na leczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do zbierania sferoidów użyj pipety o pojemności 1 000 μl, aby zebrać sferoidy z każdej studzienki i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Sferoidy są z natury delikatne i wymagają delikatnego obchodzenia się z nimi. Podczas przenoszenia pożywki ze sferoidami do probówki stożkowej, trzymaj probówkę pod kątem 45° i powoli pipetuj na ściance probówki. Kurunoidy są widoczne gołym okiem.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml pożywki do hodowli komórkowych i dobrze zawiesić osad w miejscu, ale delikatnie. Unikaj robienia bąbelków.</li>
	<li>Wykonaj liczenie sferoidów, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Użyj płytki 96-dołkowej i narysuj znak plus na spodzie studni, aby podzielić studnię na ćwiartki (aby pomóc w śledzeniu liczenia).</li>
		<li>Dodaj 50 μl zawiesiny do studzienki i policz sferoidy ręcznie pod mikroskopem (za pomocą soczewki obiektywowej 10x).</li>
		<li>Policz sferoidy w każdej ćwiartce, uważając, aby nie liczyć podwójnie i oblicz całkowitą liczbę sferoid w studzience. 
		UWAGA: Aby uzyskać dokładność liczenia, policz co najmniej 50 sferoid w studzince. Jeśli jest mniej niż 50 sferoid, delikatnie wymieszaj zawiesinę, aby zapewnić jednorodny rozkład, i policz ponownie, używając większej objętości zawiesiny dodanej do nowego dołka. Alternatywnie, jeśli w studzience znajduje się mniej niż 50 sferoid, sferoidy można odwirować i delikatnie zawiesić w objętości <0,5 ml. Jeśli jest ponad 100 sferoid, dodaj pożywkę do hodowli komórkowych do zawiesiny sferoidów, delikatnie wymieszaj i przelicz ponownie.</li>
		<li>Obliczyć stężenie sferoidy (liczba sferoidów/objętość zliczania [μL]), a następnie obliczyć całkowitą liczbę sferoid w zawiesinie (stężenie sferoidów × objętość całkowita).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test skuteczności leku (test MTT)
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz van Meerloo et al.13. Ponadto w teście MTT należy użyć tylko pożywki do hodowli komórkowych, a nie "pożywki do hodowli 3D" (dodanie macierzy błony podstawnej nie jest konieczne i może potencjalnie zakłócić test MTT).
<ol>
	<li>W nowej probówce należy przygotować zawiesinę sferoidalną o stężeniu 200 sferoid na 200 μl pożywki do hodowli komórkowych (pożywka RPMI-1640 uzupełniona 10% FBS, 1:100 penicylina-streptomycyna, 1% aminokwasów endogennych i 1% L-glutamina).
	<ol>
		<li>Do każdej kuracji farmakologicznej należy przygotować zapas sferoid w probówce o pojemności 15 ml. Oblicz ilość potrzebną dla każdego leku na podstawie liczby dołków potrzebnych do powtórzeń: (5-8) × 200 μL. Dodaj lek do probówki do wymaganego końcowego stężenia. 
		UWAGA: Proszę zapoznać się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników dotyczących leków stosowanych w niniejszym badaniu i ich dawkowania. Również szczegóły handlowe leków są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 200 μl zawiesiny sferoidalnej do studzienek 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 . Do testu nie należy używać zewnętrznych rzędów i kolumn płytki 96-dołkowej, ponieważ studzienki te charakteryzują się zwiększonym parowaniem, co może prowadzić do zwiększonej zmienności między powtórzonymi eksperymentami; zamiast tego dodaj PBS do tych studzienek. 
	UWAGA: Kluczowe jest, aby kultura sferoidów była jednorodna, zanim kultura zostanie podaszona do 96-dołkowej płytki. Ponadto w każdym eksperymencie musi być uwzględniony warunek kontrolny (tj. sferoidy niepoddane działaniu substancji).</li>
	<li>Po inkubacji sferoid z badanym lekiem przez 24-72 godzin, odwirować płytkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć 170 μl pożywki do hodowli komórkowych, pozostawiając 30 μl (w tym sferoidy) na dnie studzienki. 
	UWAGA: Usunięcie 170 μl pożywki do hodowli komórkowych musi być wykonane ostrożnie, aby nie usunąć sferoid. Trzymaj płytkę pod kątem 45° i umieść jedną rękę (w ciemnej rękawicy dla kontrastu) pod studzienkami tak, aby sferoidy były widoczne (białe kropki).</li>
	<li>Przygotować roztwór MTT (0,714 mg/ml w RPMI bez fenolu, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 70 μl roztworu MTT do każdej studzienki do końcowej objętości 100 μl na studzienkę (końcowe stężenie MTT w studzience wyniesie 0,05 mg na 100 μl). Ponadto należy przygotować "ślepe" studzienki z roztworem MTT bez komórek. 
	UWAGA: MTT jest wrażliwy na światło. Dlatego światło w okapie musi być wyłączone, a rurka zawierająca roztwór MTT musi być przykryta folią aluminiową.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 3-4 godziny, aż do zaobserwowania zmiany koloru roztworu w studzienkach (kolor fioletowy oznacza żywe komórki).</li>
	<li>Gdy zaobserwuje się zmianę, dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (0,1 N HCl w izopropanolu) do każdej studzienki i delikatnie wymieszać zawartość studzienek, nie tworząc pęcherzyków.</li>
	<li>Odczytać absorbancję płytki w czytniku Fluorometer-ELISA (patrz Tabela materiałów) przy długości fali 570 nm i długości fali tła 630-690 nM. 
	UWAGA: Jeśli dostępny czytnik Fluorometer-ELISA nie może odczytać 96-dołkowej płytki o bardzo niskim nasadce, przenieś zawartość każdej studzienki na odpowiednią 96-dołkową płytkę z płaskim dnem.</li>
	<li>Oblicz żywotność komórki, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Dla każdej studzienki oblicz "specyficzny sygnał" ("specyficzny sygnał" = sygnał przy 570 nm - sygnał przy 630-690 nm). Następnie oblicz średnią wartość "pustych" studzienek i odejmij tę wartość od każdego dołka.</li>
		<li>Obliczyć średnią "specyficznych sygnałów" w studzienkach kontrolnych, które zawierają komórki, które nie były leczone badanym lekiem ("AV-SS-unt").</li>
		<li>Obliczyć żywotność (procent) komórek w każdym basenie w stosunku do studzienek z komórkami niepoddanymi działaniu środka. 
		UWAGA: Żywotność = (określony sygnał w każdym dołku/"AV-SS-unt") × 100</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Monitorowanie i analiza zmian morfologicznych w sferoidach
UWAGA: Jeśli chodzi o test MTT, w tej ocenie powinna być używana tylko pożywka do hodowli komórkowych, a nie "pożywka do hodowli 3D" (dodanie macierzy błony podstawnej nie jest konieczne i mogłoby potencjalnie zakłócić analizę).
<ol>
	<li>Po policzeniu sferoid zawiesinę rozcieńczyć w pożywce do hodowli komórkowych (pożywka RPMI-1640 uzupełniona 10% FBS, 1:100 penicylina-streptomycyna, 1% aminokwasów endogennych i 1% L-glutamina) do około 1-2 sferoidów na 20 μl.</li>
	<li>Umieścić 80 μl pożywki do hodowli komórkowych w studzienkach 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu, a następnie dodać 20 μl zawiesiny sferoidalnej do studzienek. 
	UWAGA: Studzienki będą zatem zawierały 1-2 sferoidy w objętości 100 μL.</li>
	<li>Dokładnie sprawdź studzienki pod mikroskopem i zaznacz studzienki, które zawierają jedną sferoidę, ponieważ będą one używane do tej analizy.</li>
	<li>Przygotować badany lek w stężeniu, które jest dwukrotnie większe od stężenia będącego przedmiotem zainteresowania. Dodaj 100 μl roztworu leku do odpowiednich studzienek (całkowite stężenie w studzience wyniesie wtedy 1x).</li>
	<li>Zrób obraz każdego dołka w dniu 0 (przed dodaniem badanego leku) i użyj narzędzia "skala" w oprogramowaniu do obrazowania (patrz Tabela materiałów), aby określić średnice sferoid.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 i badać morfologię oraz mierzyć średnicę sferoid (za pomocą narzędzia "skala") codziennie przez 3-7 dni, w zależności od tego, kiedy obserwuje się działanie leku (np. rozsiew komórek, inwazyjne strąki, niszczenie struktury itp.).</li>
	<li>Na koniec eksperymentu wykreśl zmiany średnic sferoid (w stosunku do dnia 0) w czasie. 
	UWAGA: Zmiana (w procentach) = (średnica sferoidy w określonym dniu/średnica tego sferoidy w dniu 0) × 100</li>
</ol>

<ol><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tumor+models%3A+Advantages%2C+disadvantages%2C+variables%2C+and+selecting+the+right+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4(2020).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+What+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381(2021).</li>
<li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+de+Investigacio%CC%81n+Cli%CC%81nica%22%5BJournal%5D)">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).</li>
<li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284(2022).</li>
<li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+goes+three-dimensional%3A+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li>
<li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li>
<li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665(2022).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).</li>
<li>Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Periodicum+Biologorum%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę generowania pierwotnych kultur komórkowych 3D (sferoidów) pochodzących z próbek ludzkich guzów. Sferoidy te mogą być wykorzystywane do różnych analiz, w tym do oceny potencjalnych kandydatów na leki i kombinacji leków, identyfikacji potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych oraz badania mechanizmów odpowiedzi i oporności. W protokole wykorzystuje się pierwotne komórki nowotworowe pochodzące bezpośrednio z próbek pobranych od pacjentów lub komórki nowotworowe z modeli PDX...

Badania in vitro i in vivo reprezentują komplementarne podejścia do opracowywania metod leczenia raka. Modele in vitro pozwalają na kontrolę większości zmiennych eksperymentalnych i ułatwiają analizy ilościowe. Często służą one jako tanie platformy przesiewowe i mogą być również wykorzystywane do badań mechanistycznych1. Jednak ich znaczenie biologiczne jest z natury ograniczone, ponieważ takie modele tylko częściowo odzwierciedlają mikrośrodowisko guza1. Natomiast modele in vivo, takie jak ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), oddają złożoność mikrośrodowiska guza i są bardziej odpowiednie do badań translacyjnych i indywidualizacji leczenia u pacjentów (tj. badania odpowiedzi na leki w modelu pochodzącym od indywidualnego pacjenta)1. Jednak modele in vivo nie sprzyjają wysokoprzepustowym podejściom do badań przesiewowych leków, ponieważ parametry eksperymentalne nie mogą być kontrolowane tak ściśle, jak w modelach in vitro, a ich opracowanie jest czasochłonne, pracochłonne i kosztowne1,2.
Modele in vitro są dostępne od ponad 100 lat, a linie komórkowe są dostępne od ponad 70 lat3. Jednak w ciągu ostatnich kilku dekad złożoność dostępnych modeli in vitro guzów litych dramatycznie wzrosła. Ta złożoność waha się od dwuwymiarowych (2D) modeli hodowli (struktury jednowarstwowe), które są albo ustalonymi liniami komórkowymi pochodzącymi z nowotworu, albo pierwotnymi liniami komórkowymi, do nowszych podejść obejmujących modele trójwymiarowe (3D)1. W modelach 2D kluczowe jest rozróżnienie między ustalonymi i pierwotnymi liniami komórkowymi4. Ustalone linie komórkowe są uwiecznione; W związku z tym ta sama linia komórkowa może być wykorzystywana na całym świecie przez wiele lat, co z perspektywy historycznej ułatwia współpracę, gromadzenie danych i opracowywanie wielu strategii leczenia. Jednak aberracje genetyczne w tych liniach komórkowych kumulują się z każdym przejściem, pogarszając w ten sposób ich znaczenie biologiczne. Co więcej, ograniczona liczba dostępnych linii komórkowych nie odzwierciedla heterogeniczności nowotworów u pacjentów4,5. Pierwotne linie komórek rakowych pochodzą bezpośrednio z wyciętych próbek guza uzyskanych za pomocą biopsji, wysięku opłucnowego lub resekcji. Dlatego pierwotne linie komórek rakowych są bardziej istotne biologicznie, ponieważ zachowują elementy mikrośrodowiska guza i cechy guza, takie jak zachowania międzykomórkowe (np. Wzajemne oddziaływanie między zdrowymi i nowotworowymi komórkami) oraz podobne do macierzystych fenotypy komórek rakowych. Jednak zdolność replikacyjna pierwotnych linii komórkowych jest ograniczona, co prowadzi do wąskiego czasu hodowli i ogranicza liczbę komórek nowotworowych, które można wykorzystać do analiz4,5.
Modele korzystające z kultur 3D są bardziej istotne biologicznie niż modele hodowlane 2D, ponieważ warunki in vivo są zachowane. W ten sposób modele hodowli 3D zachowują naturalny kształt i wzrost komórek oraz replikują elementy środowiska guza, takie jak niedotlenienie, martwica i adhezja komórek. Najczęściej używane modele 3D w badaniach nad rakiem obejmują sferoidy wielokomórkowe, struktury oparte na rusztowaniach i kultury osadzone w matrycy4,6,7.
Obecny protokół generuje modele hodowli 3D guzów (wielokomórkowe sferoidy) z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenia ich wrażliwość na leki za pomocą dwóch uzupełniających się podejść: testu żywotności komórek (MTT) i badań mikroskopowych. Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym dokumencie dotyczą raka piersi i jelita grubego; Jednak protokół ten ma szerokie zastosowanie w przypadku innych typów guzów litych (np. raka dróg żółciowych, raka żołądka, płuc i trzustki) i jest również opłacalny, ponieważ można go wykonać w całości w typowym laboratorium badawczym / biologii komórki bez polegania na specjalistycznym sprzęcie. Wielokomórkowe sferoidy wygenerowane przy użyciu tego podejścia mogą być wykorzystane do oceny potencjalnych kandydatów na leki, identyfikacji potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych oraz badania mechanizmów odpowiedzi i oporności.
Ten protokół jest podzielony na trzy sekcje: (1) generacja, zbieranie i liczenie sferoid w ramach przygotowań do ich użycia jako modelu do testowania skuteczności leków; (2) Test MTT w celu oceny skuteczności leku na sferoidach; oraz (3) mikroskopowa ocena zmian morfologicznych po leczeniu sferoid lekami jako inne podejście do oceny skuteczności leku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>5 Fluorouracyl</td><td>TEVA Izrael</td><td>partia 16c22NA</td><td>Fluorouracyl, Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase Dysocjacja komórek</td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>TEVA Izrael</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatyna,&nbsp;</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>Matryca błony podstawnej, typ 3</td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>Flurometr&nbsp; Czytnik ELISA</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>do rozwiązania zatrzymującego</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA&</td><td>nbsp; Wersja 1.52a</td><td>Oprogramowanie typu open source ImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>do roztworu zatrzymującego</td></tr><tr><td>L-glutaminę</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp;</td><td>Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy Sigma Aldrich M5655-1G Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aminokwasy endogenne&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Palbociclib&nbsp; &nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)*Bez penicyliny wapniowo-magnezowej</td></tr><tr><td>&ndash; Streptomycyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>Bez fenolu RPMI 1640</td><td>Przemysł biologiczny, Izrael</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik pippetowy</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Bazylea, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Trypan blue 0,5% roztwór</td><td>Przemysł biologiczny, Izrael</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka o bardzo niskim nasadce</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>Navelbine</td></tr></tbody></table>

ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Pomimo znacznych postępów w zrozumieniu biologii nowotworów, zdecydowana większość kandydatów na leki onkologiczne wchodzących w próby kliniczne kończy się niepowodzeniem, często z powodu braku skuteczności klinicznej. Ten wysoki wskaźnik niepowodzeń rzuca światło na niezdolność obecnych modeli przedklinicznych do przewidywania skuteczności klinicznej, głównie ze względu na ich nieadekwatność w odzwierciedlaniu heterogeniczności guza i mikrośrodowiska guza. Ograniczeniom tym można zaradzić za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli hodowlanych (sferoid) ustalonych na podstawie próbek ludzkich guzów pochodzących od indywidualnych pacjentów. Te kultury 3D reprezentują rzeczywistą biologię lepiej niż ustalone linie komórkowe, które nie odzwierciedlają heterogeniczności guza. Co więcej, hodowle 3D są lepsze niż dwuwymiarowe (2D) modele hodowli (struktury jednowarstwowe), ponieważ replikują elementy środowiska guza, takie jak niedotlenienie, martwica i adhezja komórek, oraz zachowują naturalny kształt i wzrost komórek. W niniejszym badaniu opracowano metodę przygotowania pierwotnych kultur komórek nowotworowych od indywidualnych pacjentów, które są 3D i rosną w sferoidach wielokomórkowych. Komórki mogą pochodzić bezpośrednio z guzów pacjenta lub ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta. Metoda ma szerokie zastosowanie w przypadku guzów litych (np. okrężnicy, piersi i płuc), a także jest opłacalna, ponieważ można ją wykonać w całości w typowym laboratorium badawczym / biologii komórki bez polegania na specjalistycznym sprzęcie. W niniejszym artykule przedstawiono protokół generowania modeli hodowli 3D nowotworów (sferoid wielokomórkowych) z pierwotnych komórek nowotworowych i oceny ich wrażliwości na leki przy użyciu dwóch uzupełniających się podejść: testu żywotności komórek (MTT) i badań mikroskopowych. Te wielokomórkowe sferoidy mogą być wykorzystywane do oceny potencjalnych kandydatów na leki, identyfikacji potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych oraz badania mechanizmów odpowiedzi i oporności.

Niniejszy protokół przedstawia procedury generowania homogenicznej kultury sferoidów z pierwotnych komórek nowotworowych, ilościowej oceny skuteczności leków w kulturze sferoidów (test MTT) oraz określania wpływu badanych leków na morfologię sferoidów. Przedstawiono dane z reprezentatywnych eksperymentów przeprowadzonych na sferoidach wygenerowanych z kultur komórek raka jelita grubego i piersi. Podobne eksperymenty wykonano z wykorzystaniem innych typów nowotworów, w tym cholangiokarcinoma oraz raka żołądka, płuc i trzu...

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Nasz protokół jest znaczący, ponieważ opisuje generację modeli hodowli guzów 3D z pierwotnych komórek rakowych, a model ten reprezentuje rzeczywistą biologię guza lepiej niż linie komórkowe. Podejście to ma zastosowanie do różnych guzów litych. Jest to również opłacalne, ponieważ można je wykonać od początku do końca w typowym laboratorium biologii komórki.Modele 3D nowotworów wygenerowane przy użyciu tego podejścia wspierają badania nad wrażliwością i odpornością nowotworów na terapie przeciwnowotworowe lub kombinację terapii. Podejście to generuje modele 3D z pierwotnych komórek nowotworowych. W związku z tym może określić, która terapia może być skuteczna dla danego pacjenta, a tym samym pomóc spersonalizować jego leczenie.Procedurę zademonstruje Ella Itzhaki, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek weź małą kolbę T25 z jednokomórkową przylegającą pierwotną hodowlą komórkową i usuń pożywkę do hodowli komórkowej. Umyj komórki PBS i dodaj jeden mililitr 1x Accutase przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przygotować jednokomórkową zawiesinę przylegających pierwotnych kultur komórek nowotworowych o konfluencji od 75 do 100%.Zneutralizować roztwór Accutase,

establishing-3-dimensional-spheroids-from-patient-derived-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych modeli guzów z komórek pierwotnych w celu oceny wrażliwości na leczenie przeciwnowotworowe. Ta technika wspiera personalizowaną terapię onkologiczną.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Przeglądaj więcej filmów