Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Nasz protokół jest znaczący, ponieważ opisuje generację modeli hodowli guzów 3D z pierwotnych komórek rakowych, a model ten reprezentuje rzeczywistą biologię guza lepiej niż linie komórkowe. Podejście to ma zastosowanie do różnych guzów litych. Jest to również opłacalne, ponieważ można je wykonać od początku do końca w typowym laboratorium biologii komórki.

Modele 3D nowotworów wygenerowane przy użyciu tego podejścia wspierają badania nad wrażliwością i odpornością nowotworów na terapie przeciwnowotworowe lub kombinację terapii. Podejście to generuje modele 3D z pierwotnych komórek nowotworowych. W związku z tym może określić, która terapia może być skuteczna dla danego pacjenta, a tym samym pomóc spersonalizować jego leczenie.

Procedurę zademonstruje Ella Itzhaki, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek weź małą kolbę T25 z jednokomórkową przylegającą pierwotną hodowlą komórkową i usuń pożywkę do hodowli komórkowej. Umyj komórki PBS i dodaj jeden mililitr 1x Accutase przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przygotować jednokomórkową zawiesinę przylegających pierwotnych kultur komórek nowotworowych o konfluencji od 75 do 100%.

Zneutralizować roztwór Accutase, dodając pięć mililitrów pożywki do hodowli komórkowych. Odessać komórki 10-mililitrową pipetą serologiczną i umieścić je w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Odwirować probówkę o masie 800 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i dodaj osiem mililitrów świeżej pożywki do hodowli komórkowych na wierzch osadu komórkowego, a następnie delikatnie wymieszaj. Aby policzyć żywotne komórki za pomocą hemocytometru, weź porcję 50 mikrolitrów zawiesiny komórek i wymieszaj ją z 50 mikrolitrami błękitu trypanowego. Następnie policz żywe komórki i oblicz całkowitą liczbę żywych komórek w zawiesinie.

Następnie przygotuj pożywkę hodowlaną 3D. Po obliczeniu liczby komórek potrzebnych do testu i całkowitej wymaganej objętości przygotuj zawiesinę komórek z żądaną liczbą komórek w 200 mikrolitrach pożywki hodowlanej 3D. Delikatnie wymieszać pipetą, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.

Przenieść zawiesinę do zbiornika pipetującego i dodać 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o bardzo niskim natężeniu za pomocą pipety wielokanałowej. Odwiruj płytkę o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby wymusić grupowanie komórek, poprawiając w ten sposób agregację komórek, i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla. Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie usuń i wyrzuć 50% pożywki i dodaj 100 mikrolitrów świeżej pożywki 3D, aby zastąpić istniejący roztwór.

Powtórz ten krok i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze nawilżanym dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%. Sprawdzaj komórki pod mikroskopem co jeden do dwóch dni, aby monitorować tworzenie się sferoidów. Zmierz średnicę utworzonych sferoid za pomocą narzędzia do skalowania w oprogramowaniu do obrazowania.

A gdy średnica sferoidy osiągnie od 100 do 200 mikrometrów, przeprowadź eksperymenty ze skutecznością leku. Do zbierania sferoidów użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby zebrać sferoidy z każdej studzienki i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Odwirować stożkową probówkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie zassać i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.

Dodać 0,5 mililitra pożywki do hodowli komórkowych i dobrze zawiesić osad w miejscu, ale delikatnie. Aby wykonać liczenie sferoidów, użyj płytki 96-dołkowej i narysuj znak plus na spodzie studni, aby podzielić studnię na ćwiartki. Dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny do studzienki.

A dzięki soczewce obiektywowej 10x policz sferoidy ręcznie pod mikroskopem. Policz sferoidy w każdym kwadrancie i oblicz całkowitą liczbę sferoid w studni. Następnie oblicz stężenie sferoidów, podwajając liczbę sferoid, licząc objętość, i oblicz całkowitą liczbę sferoid w zawiesinie.

W nowej probówce przygotować zawiesinę sferoidalną o stężeniu 200 sferoid na 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych. Dla każdej kuracji farmakologicznej przygotuj zapas sferoid w innej probówce. Oblicz całkowitą ilość potrzebną dla każdego leku przez liczbę dołków potrzebnych do powtórzeń i dodaj lek do probówki do końcowego wymaganego stężenia.

Przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny sferoidalnej do studzienek 96-dołkowej płytki o bardzo niskim nakładzie i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji sferoid z badanym lekiem przez 24 do 72 godzin, odwirować płytkę o masie 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć 170 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych, pozostawiając 30 mikrolitrów na dnie studzienki. Przygotuj roztwór MTT i dodaj 70 mikrolitrów roztworu do każdej studzienki do końcowej objętości 100 mikrolitrów na studzienkę.

Końcowe stężenie MTT w studni wyniesie 0,05 miligrama na 100 mikrolitrów. Ponadto przygotuj ślepe studzienki z roztworem MTT bez komórek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech godzin, aż zaobserwuje się zmianę koloru roztworu w studzienkach.

Gdy zaobserwuje się zmianę, dodaj 100 mikrolitrów roztworu Stop do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj zawartość studzienek, nie tworząc pęcherzyków. Odczytaj absorbancję płytki w czytniku parametrów ELISA przy długości fali 570 nanometrów i długości fali tła od 630 do 690 nanometrów. Aby obliczyć żywotność komórki, oblicz konkretny sygnał dla każdej studzienki.

Następnie oblicz średnią wartość ślepych studzienek i odejmij tę wartość od każdej studzienki. Oblicz średnią określonych sygnałów w studzienkach kontrolnych, które zawierają komórki, które nie były leczone badanym lekiem. Na koniec oblicz żywotność komórek w każdym dołku w stosunku do studzienek z komórkami niepoddanymi działaniu środka.

Pokazano tutaj tworzenie sferoid z pierwotnej hodowli komórek raka jelita grubego w czasie przez liczbę początkowo zasianych komórek. Z tego rysunku widać, że liczba generowanych sferoid zależy od liczby komórek początkowo zasianych w każdym dołku. Pokazano tutaj sferoidy z komórek pierwotnego raka jelita grubego po 10 dniach hodowli z początkowym wysiewem komórek 2 000 na dołek.

Po długotrwałym posiewie sferoid raka jelita grubego zaczęły się one łączyć ze sobą i tworzyć skupiska sferoid i struktur przypominających winogrona, co uniemożliwiało jednorodną hodowlę, a tym samym uniemożliwiało stosowanie sferoidów w testach MTT. Przedstawiono tutaj wpływ palbocyklibu, sunitynibu i ich kombinacji na sferoidy z pierwotnych komórek nowotworowych, w tym raka okrężnicy i piersi. Test MTT przeprowadzono na sferoidach pochodzących z komórek raka okrężnicy i piersi.

Sygnały MTT zostały znormalizowane do wartości z komórek traktowanych DMSO. Wartości reprezentują średnie z zakresu od czterech do ośmiu powtórzeń. Wpływ różnych terapii na wzrost komórek oceniano również pod mikroskopem w dniu zero i po trzech dniach leczenia sferoidami pochodzącymi z komórek raka jelita grubego i raka piersi.

Na rysunku przedstawiono wpływ trastuzumabu z winorelbiną i 5 fluorouracylu z cisplatyną na sferoidy pochodzące z raka piersi w czasie. Zmiana średnicy sferoid w stosunku do dnia zerowego w czasie trwania leczenia jest pokazana tutaj. Każda grupa badawcza składała się z czterech do sześciu studzienek z jednym sferoidem w każdym dołku.

Średnia zmiana jest przedstawiona tutaj. Sferoidy są ważnymi narzędziami w wielu badaniach wykraczających poza odpowiedź na leczenie przeciwnowotworowe. Badania te dotyczą na przykład dostarczania leków, a nawet podstawowych zagadnień biologicznych, takich jak interakcje komórka-komórka.

Bardzo ważne jest, aby rozpocząć proces generowania sferoid z zawiesiną jednokomórkową. Bardzo ważne jest również stosowanie płyt o bardzo niskim mocowaniu z medium zawierającym 5% podstawowych wskaźników membrany.