Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Kiedy badamy starzenie się i eleganów morskich, zazwyczaj śledzimy populację zwierząt w czasie. Daje nam to wgląd w to, co badany przez was proces zachodzi w populacji w każdym punkcie czasowym, ale nie mówi nam, jak proces ten zmienia się u poszczególnych zwierząt w czasie. Te środowiska hodowli pojedynczych zwierząt pozwalają nam śledzić dynamiczne zmiany w procesach molekularnych i procesach fizjologicznych u poszczególnych zwierząt w czasie dla setek zwierząt równolegle.

Odkryliśmy, że istnieją dwie główne rzeczy, które mogą naprawdę wpłynąć na jakość tych wielodołkowych systemów hodowli. Jednym z nich jest nadmierne lub niedostateczne suszenie studni, a drugim zanieczyszczenie. Staramy się również odnotowywać w całym protokole konkretne kroki, w których można spróbować złagodzić te problemy.

Protokół zademonstruje dziś Emily Gardea. Jest technikiem w moim laboratorium i wykonała wiele pracy, aby zoptymalizować ten protokół. Po przygotowaniu wszystkich odczynników wymieszaj 60 gramów bazy PDMS i sześć gramów utwardzacza na formę w dużej jednorazowej łodzi za pomocą jednorazowej szpatułki.

Umieść mieszaninę PDMS w komorze próżniowej na 30 minut w temperaturze minus 0,08 mega pascala, aby usunąć pęcherzyki. Wlej i napełnij mieszaninę PDMS do każdej formy wydrukowanej w 3D. Umieść napełnioną formę i dodatkową mieszaninę PDMS w komorze próżniowej na 25 minut w temperaturze minus 0,08 mega paskala.

Wyjmij wypełnioną formę z komory próżniowej i przebij pozostałe bąbelki jednorazową szpatułką. Zaczynając od jednej krawędzi, powoli opuść płaski arkusz akrylowy na wierzch formy wypełnionej PDMS. Jeśli dojdzie do powstania pęcherzyków, postępuj zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Umieść ciężarek o wadze 2.5 funta na akrylu i umieść obciążone foremki w piekarniku. Pozwól im utwardzić się w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez noc. Pod koniec inkubacji wyjmij ciężarki i foremki z piekarnika.

Następnie umieść żyletkę między akrylem a utwardzonym PDMS Aby złamać pieczęć Za pomocą brzytwy lub metalowej szpatułki ostrożnie poluzuj boki utwardzonego PDMS i wyjmij je z formy. Owiń urządzenie PDMS folią aluminiową. Uszczelnij go taśmą autoklawu i sterylizuj w autoklawie w suchym cyklu przez co najmniej 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza i ciśnieniu manometrycznym 15 funtów na cal kwadratowy.

Aby przygotować urządzenie wielodołkowe, podgrzej inkubator do suchej kąpieli perełkowej do 90 stopni Celsjusza. Rozwiń autoklawowane urządzenie wielodołkowe i wytnij małe wcięcie w prawym górnym rogu urządzenia. Umieść do trzech nieopakowanych urządzeń w myjce plazmowej studzienkami skierowanymi do góry i uruchom myjkę plazmową.

Wysterylizuj jedną tackę z polistyrenu na urządzenie, spryskując wnętrze tacki 70% etanolem i wycierając ją do sucha chusteczką zadaniową. Wyjmij każde urządzenie z myjki plazmowej ręką w rękawiczce i umieść je na wyczyszczonej tacy. Następnie umieść 25-mililitrową jednorazową miskę na pipety w inkubatorze do kąpieli perełkowej podgrzanym do 90 stopni Celsjusza.

Weź jedną tubkę zestalonej mieszaniny wstępnej LMNGM na urządzenie, które ma być napełnione i umieść ją w szklanej zlewce o pojemności 200 mililitrów. Zdejmij nakrętkę i Parafilm i kuchenkę mikrofalową, aż nośnik stopi się na tyle, aby się rozlać. Wlej stopioną mieszaninę wstępną LMNGM do innej sterylnej zlewki o pojemności 200 mililitrów.

W tej zlewce można połączyć wiele probówek, jeśli jednocześnie napełnionych jest więcej niż jedno urządzenie. Podgrzewaj wstępną mieszaninę LMNGM w kuchence mikrofalowej przez dodatkowe 20 sekund. Jeśli mieszanina wstępna zacznie wrzeć, zatrzymaj kuchenkę mikrofalową i pozwól jej się uspokoić.

Wyjmij stopioną mieszaninę wstępną LMNGM z kuchenki mikrofalowej i ostudź ją do 60 stopni Celsjusza. Dodaj pozostałe składniki LMNGM do mieszanki wstępnej i wlej stopiony LMNGM do 25-mililitrowej miski w kąpieli perełkowej. Napełnij studzienki urządzenia za pomocą wielokanałowej pipety repeater o pojemności 200 mikrolitrów.

Ustaw repeater tak, aby dozował porcje 14 mikrolitrów i zamontuj pięć końcówek do pipet. Załaduj końcówki stopionym LMNGM i wlej pierwsze 14 mikrolitrów z powrotem do miski zawierającej LMNGM. Poruszając się szybko, ale ostrożnie, dozuj 14 mikrolitrów do wewnętrznych studzienek urządzenia i dozuj pozostały LMNGM z powrotem do miski, ponieważ końcowa porcja jest zwykle mniejsza niż 14 mikrolitrów.

Następnie ustaw repeater tak, aby dozował porcje 15 mikrolitrów i napełnij najbardziej zewnętrzny pierścień studzienek. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów dozuj 200 mikrolitrów roztworu siarczanu miedzi do fosy urządzenia w każdym rogu. Unikaj przepełniania fosy i upewnij się, że siarczan miedzi nie dotyka górnej powierzchni studni.

Jeśli siarczan miedzi nie przepływa łatwo przez całą fosę, użyj krótkiego szpikulca z drutu platynowego, aby przerwać napięcie i przeciągnąć siarczan miedzi przez fosę. Po przepłynięciu siarczanu miedzi przez całą fosę należy usunąć jak najwięcej siarczanu miedzi za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów lub aspiracji z próżnią. Za pomocą wyciskanej butelki dodaj kryształki wody w przestrzeniach między urządzeniem a ściankami tacy.

Zamknij pokrywę tacki i owiń wszystkie cztery boki kawałkiem Parafilmu. Dodaj dwa dodatkowe kawałki Parafilmu, aby całkowicie uszczelnić płytkę. Za pomocą pipety powtarzalnej umieść w każdym dołku pięć mikrolitrów skoncentrowanych bakterii.

Unikać bezpośredniego kontaktu z powierzchnią LMNGM. Wysusz urządzenia za pomocą specjalnie zbudowanego pojemnika do suszenia, które można zbudować przy minimalnych kosztach przy użyciu wentylatorów obudowy komputera i filtrów HEPA. W ramach zakresu preparacji sprawdź studnie, aby upewnić się, że wszystkie studzienki pomyślnie wyschły.

Za pomocą platynowego kilofa przenieś zwierzęta z przygotowanych płytek robaków i dodaj jednego robaka do dołka. Dodaj kroplę przygotowanego roztworu detergentu do wewnętrznej strony pokrywy tacki i przecieraj chusteczką zadaniową, aż roztwór detergentu wyschnie. Owiń tacę trzema kawałkami Parafilmu zgodnie z opisem w rękopisie.

Wydłużenie żywotności z daf-2 (RNAi) jest blokowane przez mutację zerową daf-16. Długość zdrowia zmniejszyła się również w obecności daf-2(RNAi)Trzydniowa średnia krocząca aktywności w całym okresie życia jest zmniejszona przez mutanta daf-16 i daf-2(RNAi)Pokazano różnicę w długości życia i długości zdrowia u poszczególnych zwierząt porównaną w wartościach bezwzględnych lub jako ułamek całkowitej długości życia. Skumulowana aktywność poszczególnych zwierząt w ciągu całego życia koreluje lepiej z długością życia niż aktywność poszczególnych zwierząt w dowolnym konkretnym dniu w ciągu całego życia.

Ważne jest, aby napełnić studzienki i dodać robaki tak szybko, jak to możliwe. W przeciwnym razie studnie mogą wyschnąć, a robaki nie przetrwają. System ten jest kompatybilny z automatycznym obrazowaniem, które może być wykorzystywane do gromadzenia danych o wysokiej przepustowości, takich jak długość życia, aktywność oraz rozmiar lub kształt ciała.