Wytwarzanie organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten przedstawia naszą generację organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technologia ta może być wykorzystywana do badania aspektów waskulogenezy, angiogenezy, chorób naczyniowych, a także patologii naczyniowych. Powtarzalność i wysoka przepustowość, a także jej spójność w wielu różnych liniach komórek macierzystych, to mocne zalety tej techniki.

Jeśli chodzi o ich zastosowanie, niektóre z naszych poprzednich badań przedstawiają zastosowanie organoidów naczyń krwionośnych do badania zmian morfologicznych w unaczynieniu pacjentów z cukrzycą i badają możliwości leczenia farmakologicznego unaczynienia cukrzycy. Właściwe utrzymanie początkowej populacji komórek macierzystych, zapobieganie zlepianiu się agregatów i zapewnienie prawie jednorodnej średnicy agregatu, są to niezbędne czynniki do generowania dobrych organoidów naczyń krwionośnych. Rozpocznij wytwarzanie agregatów przy użyciu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych lub hPSC, o konfluencji 70%.

Za pomocą pipety lub systemu próżniowego odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją jednym mililitrem odczynnika do dysocjacji komórek przed inkubacją komórek przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W międzyczasie przygotuj niezbędną objętość pożywki agregacyjnej w 15-mililitrowej stożkowej probówce, postępując zgodnie ze sformułowaniem wymienionym w rękopisie tekstowym. Po inkubacji komórek odessać odczynnik dysocjacji komórek przed zawieszeniem komórek w jednym mililitrze pożywki agregującej.

Delikatnie odpipetować zawartość w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Policz komórki za pomocą automatycznego urządzenia do liczenia komórek lub pod mikroskopem i oblicz całkowitą liczbę komórek wymaganą do utworzenia agregatu. Odczyt żywotności komórek pokazuje zawiesinę pojedynczej komórki z niskimi lub żadnymi klastrami.

Odessać supernatant z probówki i dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórek do pożywki agregującej w 15-mililitrowej stożkowej probówce polipropylenowej o wysokiej czystości i delikatnie pipetować rozcieńczoną zawiesinę komórkową w górę iw dół, aby zapewnić jednorodny rozkład komórek. Odpipetować trzy mililitry rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdego żądanego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej o bardzo niskim nasadce. Umieść płytkę w inkubatorze i zminimalizuj wszelkie zakłócenia, aby zachować rozmiar i kształt agregatów.

Przygotować pożywkę mezodermy zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. 24 godziny po wysiewie komórek wyjąć płytkę hodowlaną z inkubatora. Obracaj płytką ruchem okrężnym, aby zgromadzić agregaty w środku każdej studzienki.

Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie przenieś agregaty z medium z każdej studzienki do odpowiedniej stożkowej probówki. Pozwól kruszywu osiąść w stożkowych rurkach w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po osadzeniu należy ostrożnie zassać supernatant za pomocą pipety lub pompy aspiracyjnej o wysokiej czułości, nie naruszając osiadłych agregatów.

Ponownie zawiesić agregaty w każdej probówce, dodając dwa mililitry pożywki indukcyjnej mezodermy. Następnie przenieś zawiesinę z każdej probówki z powrotem do odpowiedniego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej o bardzo niskim mocowaniu. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw do czwartego dnia.

Czwartego dnia wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora, a następnie potrząśnij płytką okrężnymi ruchami, aby zebrać agregaty w środku każdej studzienki. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie przenieś agregaty wraz z otaczającym medium z każdej studzienki do odpowiedniej stożkowej probówki. Ustaw minutnik na 30 minut, aby agregaty mogły osiadać w rurkach.

Gdy agregaty opadną, przygotuj płytki hodowlane, jak pokazano wcześniej, i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza do szóstego dnia. W celu zatopienia kruszywa i indukcji kiełków w naczyniu, należy przygotować pożądaną końcową objętość roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej podczas pracy na lodzie. Odpipetować 500 mikrolitrów ECM do jednego dołka na 12-dołkowej płytce, aby utworzyć pierwszą warstwę kanapki ECM.

Aby zapewnić skuteczną polimeryzację pierwszej warstwy ECM, umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Pod koniec dwugodzinnej inkubacji rozpocznij pracę z agregatami na płytce hodowlanej. Zbierz agregaty w środku każdej studzienki przed użyciem pipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie przenieść kruszywa i pożywkę z każdej studzienki do odpowiedniej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Pozostawić agregaty do opadnięcia na 10 do 15 minut przed zasysaniem supernatantu. Następnie trzymaj stożkowe rurki zawierające kruszywa na lodzie przez pięć minut. Pracując szybko i ostrożnie, ponownie zawiesić agregaty w 500 mikrolitrach ECM bez tworzenia się pęcherzyków.

Za pomocą pipety ułóż zawiesinę agregatu ECM na już spolimeryzowaną pierwszą warstwę ECM wewnątrz studzienki w płytce 12-dołkowej. W międzyczasie przygotuj pożywkę do kiełkowania zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj jeden mililitr pożywki do kiełkowania podgrzanej do 37 stopni Celsjusza do studzienki, aby wywołać różnicowanie naczyń krwionośnych.

Pracując w sterylnych warunkach, użyj zaokrąglonego końca sterylnej szpatułki, aby poluzować macierz kiełkującą ECM zawierającą sieci naczyniowe. Następnie za pomocą sterylnych kleszczyków i zaokrąglonego końca sterylnej szpatułki ostrożnie przenieś poluzowany krążek żelu na pokrywkę 10-centymetrowej naczynia hodowlanego. Umieść żel na wieczku pod mikroskopem stereoskopowym dostosowanym do pożądanego powiększenia i ostrości, a następnie użyj sterylnych igieł do wycięcia pojedynczych sieci naczyń krwionośnych, starając się ograniczyć ilość uzyskanego w tym procesie nieunaczynionego ECM.

Delikatnie przenieś wyizolowane organoidy z powrotem do jednego dołka sześciodołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu, zawierającej trzy mililitry pożywki do kiełkowania. Następnie, za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, przenieś pojedyncze organoidy do odpowiedniej liczby dołków w 96-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu. Po przeniesieniu dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do kiełkowania do każdego dołka 96-dołkowej płytki.

Cztery do sześciu dni po izolacji na 96-dołkowej płytce upewnij się, że organoidy mają okrągłą i zdrową morfologię, zanim przystąpisz do ich utrwalania i barwienia. Obrazy stopniowej progresji ludzkiego organoidu naczyń krwionośnych (hBVO) generacji z hPSC zostały uchwycone w jasnym polu. W dniu zerowym z hodowli hPSC wyprowadzono agregaty o średnicy od 30 do 100 mikronów.

Subtelne zmiany w wielkości i kształcie agregatów zaobserwowano po indukcji mezodermy pierwszego dnia, która dalej zmieniła się w czwartym dniu, gdy agregaty przeszły torowanie naczyniowe. Niemal promieniście symetryczne wczesne kiełkowanie naczyń można zaobserwować w siódmym dniu, dzień po osadzeniu agregatów w macierzy kiełkowania. Zdrową morfologię organoidów i ciągłe kiełkowanie naczyń zaobserwowano w dziewiątym dniu, który przeszedł do późnego stadium kiełkowania naczyń w 10 dniu, kiedy gęste struktury komórkowe w centrum organoidu prawie zniknęły.

Morfologia typowa dla dojrzałych organoidów naczyń krwionośnych człowieka była wyraźnie obserwowana w 15 dniu. Barwienie całego wierzchowca dojrzałych hBVO w dniu 15 wykazało rozległą i połączoną sieć śródbłonka, która była CD31-dodatnia i otoczona przez pasożyty PDGFR-beta-dodatnie i SMA-dodatnią alfa-aktynę mięśni gładkich. Dobrze obserwowane są PDGFR-beta-dodatnie i SMA-dodatnie komórki ścienne otaczające sieci naczyń śródbłonka.

Zaobserwowano również ciągłą kolagenowo-dodatnią błonę podstawną otaczającą sieci naczyń krwionośnych. Zapewnienie prawidłowej polimeryzacji macierzy zewnątrzkomórkowej na etapie osadzania ma kluczowe znaczenie dla efektywnego kiełkowania naczyń krwionośnych. Naukowcy wykorzystali naszą technologię organoidów naczyń krwionośnych do wygenerowania wczesnych przedziałów naczyniowych w już istniejących modelach organoidów, takich jak mózg i nerki, które wcześniej były anaczyniowe.