Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Organoidy pochodzące od pacjentów to trójwymiarowe systemy modelowe in vitro, które reprezentują zarówno różnorodność pacjentów, jak i niejednorodność komórkową guzów. Ten protokół i demonstracja wideo stanowią szczegółowy, praktyczny przewodnik po ustaleniu guza piersi pochodzącego od pacjenta i prawidłowych organoidów. Organoidy guza piersi pochodzące od pacjentów to nowe, ekscytujące modele, ale trudne do ustalenia.

Kompleksowy protokół, który tutaj przedstawiamy, powinien pomóc w przygotowaniu badaczy próbujących opracować organoidy piersi i zapoznaniu ich z oczekiwanymi wyzwaniami. Każda linia PDO pochodząca od innego pacjenta jest wyjątkowa pod względem morfologii i tempa wzrostu. W przeciwieństwie do dwóch systemów linii komórkowych 2D, organoidy rosną lepiej, gdy są posiane w dużej gęstości, co pozwala na lepsze interakcje międzykomórkowe.

Procedurę zademonstruje Disha Aggarwal, doktorantka w moim laboratorium. Na początek rozmrozić butelkę macierzystej membrany podstawnej na lodzie lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś wyciętą tkankę na 10-centymetrową sterylną szalkę Petriego.

Zbadaj tkankę makroskopowo i zanotuj, czy wydaje się morfologicznie tłusta, unaczyniona lub martwicza. Dodatkowo zapisz rozmiar i kształt tkanki i zrób zdjęcie tkanki na tle linijki. Zmiel tkankę na małe kawałki sterylnym skalpelem numer 10 i przenieś ją do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Dodać 10 mililitrów dwóch miligramów na mililitr roztworu kolagenazy dożylnej i zamknąć probówkę. Umieść rurkę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 140 obr./min na 30 do 90 minut pod kątem 30 stopni. Podczas inkubacji umieścić podwielokrotność kompletnego podłoża do wstępnego ogrzania w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kulce lub łaźni wodnej.

Co 15 minut ponownie zawiesić tkankę, energicznie mieszając w górę i w dół za pomocą pięciomililitrowej, sterylnej, wstępnie powlekanej pipety serologicznej. Monitorowana dysocjacja w czasie poprzez obserwację tubusu pod mikroskopem przy powiększeniu 5X lub większym. Po dysocjacji tkanki odwirować przy 400 G przez pięć minut, odessać supernatant i dodać 10 mililitrów AdDF+Ponownie, odwirować i ostrożnie odessać supernatant, ponieważ granulki tkanek mogą czasami być luźne.

Jeśli osad tkankowy jest częściowo czerwony, dodaj dwa mililitry buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać 10 mililitrów AdDF+ do probówki, odwirować przy 400 G przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 50 do 300 mikrolitrach nierozcieńczonej zimnej matrycy membrany podstawowej i wymieszać ostrożnie pipetując, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.

Używając sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej, która jest wstępnie podgrzewana w inkubatorze przez noc, umieść 300 mikrolitrów kopuły macierzy błony podstawnej zawierającej organoidy w każdym dołku. Pozostaw płytkę w spokoju w okapie na pięć minut przed umieszczeniem jej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aby kopuła matrycy membrany podstawnej całkowicie zastygła. Pod koniec inkubacji dodać kroplami trzy mililitry wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po inkubacji uchwyć obrazy organoidów za pomocą obiektywu 5X na mikroskopie odwróconego jasnego pola. Podnieś kopułę matrycy membrany podstawnej do pożywki w studzience za pomocą skrobaka do komórek lub jednomililitrowej końcówki do pipety. Za pomocą wstępnie powlekanej końcówki do pipet przenieś pływającą kopułę organoidów z podłożem do stożkowej probówki o pojemności 15 lub 50 mililitrów, w zależności od liczby zbieranych studzienek.

Następnie dodaj DPBS, aby zwiększyć objętość do co najmniej pięciu mililitrów. Wirować probówki o masie 400 G przez pięć minut. Macierz błony podstawnej z organoidami tworzy warstwę na dnie.

Po zaessaniu supernatantu dodać od 5 do 20 mililitrów DPBS, w zależności od liczby studzienek zgromadzonych w probówce. Wymieszaj osad macierzy błony podstawnej organoidu z DBPS za pomocą wstępnie powlekanej, sterylnej jednorazowej pipety. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant.

Za pomocą powlekanej końcówki do pipety dodać odczynnik do dysocjacji komórek o objętości trzykrotnie większej niż objętość matrycy błony podstawnej i ponownie zawiesić organoidy. Umieść rurkę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 140 obr./min na 8 do 15 minut w pozycji kątowej. Monitoruj probówkę, obserwując ją pod mikroskopem co pięć minut, aby upewnić się, że organoidy są podzielone na mniejsze skupiska.

Dodaj AdDF+ w objętości równej lub większej niż odczynnik do dysocjacji komórek i pipetę, aby wymieszać organoidy. Wirować w 400 G przez pięć minut, aby uzyskać osad organoidowy. Po uzyskaniu białej osadki organoidowej bez nierozpuszczonej matrycy błony podstawnej, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze AdDF+Uzupełnić objętość do 10 mililitrów za pomocą AdDF+Zakręć probówką do etapu płukania i wyrzuć supernatant.

Dodać wymaganą ilość macierzy błony podstawnej do strawionych organoidów w oparciu o odpowiedni stosunek podziału. Mieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i natychmiast umieść na lodzie. Płytka 300-mikrolitrowe kopuły organoidów zawieszone w macierzy membrany podstawnej we wstępnie podgrzanej płytce sześciodołkowej.

Pozostaw płytkę w spokoju w okapie na pięć minut przed umieszczeniem jej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 20 do 30 minut, aby kopuły zastygły. Pod koniec inkubacji i trzy mililitry wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki do każdej studzienki i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Dodawaj świeże, kompletne podłoże co pięć do siedmiu dni.

Różne linie organoidów guza piersi pochodzące od pacjentów różnią się morfologią i szybkością wzrostu. Normalne organoidy piersi i kilka wczesnych raków przewodowych w organoidach pochodzących z C2 przypominały normalną strukturę piersi, z centralnym światłem otoczonym komórkami przewodowymi. Organoidy pochodzące z inwazyjnego raka zrazikowego mają tendencję do tworzenia luźno przylegających struktur przypominających kiście winogron.

Tymczasem organoidy pochodzące z inwazyjnych raków przewodowych mają tendencję do tworzenia gęstych, dużych i okrągłych organoidów. Wzrost organoidów mierzono za pomocą testu żywotności komórek luminescencyjnych w trzecim, szóstym, dziewiątym i dwunastym dniu, z odczytem wyjściowym w pierwszym dniu po posiewie. Obrazy w jasnym polu tych samych organoidów, które rozszerzały się w czasie, są pokazane tutaj.

Niektóre linie organoidów pochodzących od pacjentów mają czas podwojenia wynoszący dwa dni, podczas gdy niektóre potrzebują pięciu dni. Ważne jest, aby uzbroić się w cierpliwość w przypadku określonych linii organoidów, które powoli się tworzą. Z naszego doświadczenia wynika, że zwiększanie gęstości poszycia lub odfiltrowywanie zanieczyszczeń sprzyja wzrostowi ChNP.

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są doskonałymi modelami do badań przesiewowych leków. Modelują interakcje komórka-komórka, a także komórka-macierz zewnątrzkomórkowa, które są kluczowe dla badania patofizjologii raka. Ponadto ChNP mogą być poddawane manipulacjom genetycznym i mogą być wykorzystywane do opracowywania ksenoprzeszczepów w systemach kohodowli, co czyni je doskonałymi modelami do badań mechanistycznych.