Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

Staramy się zrozumieć dynamiczne interakcje między cząsteczkami w żywych komórkach. Do analizy biochemicznej może być konieczne użycie dużych ilości rekombinowanego białka. Mogą one być niezwykle trudne do wyrażenia w prawidłowo złożonej i funkcjonalnej formie.

Gdyby okazało się, że białko jest nieprawidłowo sfałdowane lub nierozpuszczalne w przypadku ekspresji w bakteriach, naukowcy musieliby albo uciec się do komórek ssaków, co jest drogie i stosunkowo powolne, albo użyć syntetycznych polipeptydów. Nasz protokół pozwala na ekspresję o wysokiej wydajności, a także eksport trudnych białek z E. coli. Dodanie krótkiej, rozszczepialnej sekwencji peptydowej do końca aminowego białka nie tylko zwiększa produkcję i wydajność każdego białka, które testowaliśmy do tej pory, ale także eksportuje białko z komórki do pożywki.

Wraz z uproszczeniem ekspresji białek, upraszcza również oczyszczanie białek w dalszej części łańcucha dostaw. Po sklonowaniu peptydu zarodkującego pęcherzyki lub VNP, znacznik sekwencji na końcu aminowym kultury białka fuzyjnego, 5-mililitrowy bulion lizogeniczny lub LB, startery ze świeżych przemian bakteryjnych w temperaturze 37 stopni Celsjusza do nasycenia. Następnie użyj tego do zaszczepienia 25 mililitrów wspaniałego bulionu lub TB, zawierającego odpowiedni dobór antybiotyków w stożkowej kolbie o pojemności 500 mililitrów, Inkubuj kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę lub większą niż równa 25 milimetrowym rzutom orbitalnym, aż kultura osiągnie wartość gęstości optycznej 600 nanometrów lub OD 600 od 0,8 do 1,0.

Następnie indukuj ekspresję rekombinowanego białka z promotora T7, dodając IPTG do końcowego stężenia do 20 mikrogramów na mililitr lub 84 mikromolowe. Po pozostawieniu wystarczającej ilości czasu na indukcję, osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3000 x g i 4 stopnie Celsjusza przez 20 minut. Przepuść supernatant przez sterylny i wolny od detergentów filtr PES o grubości 0,45 mikrona, aby wysterylizować pożywkę zawierającą pęcherzyki do długotrwałego przechowywania.

Aby skoncentrować pęcherzyki w mniejszej objętości, przepuść sterylne podłoże zawierające pęcherzyki przez sterylny i wolny od detergentów filtr MCE 0,1 mikrona. Następnie delikatnie umyj membranę 0,5 do 1 mililitra sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS i użyj skrobaka do komórek lub plastikowego rozsiewacza, aby ostrożnie usunąć pęcherzyki z membrany. Przenieść koncentrat pęcherzyków do świeżej probówki do mikrowirówki za pomocą pipety.

Oczyszczone pęcherzyki można przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Sonikować białko zawierające pęcherzyki w sterylnym podłożu przy użyciu odpowiedniego harmonogramu, aby rozbić pęcherzykowe błony lipidowe i uwolnić białko Odwirować sonikowaną zawiesinę w temperaturze 39 000 x g i 4 stopnie Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć resztki pęcherzyków. BL21 DE3 Escherichia coli zawierająca konstrukt ekspresji VNP 6 mNeonGreen wykazywał fluorescencję mNeonGreen indukowaną przez noc za pomocą IPTG.

Fluorescencja pozostała widoczna w hodowli po usunięciu komórek bakteryjnych przez odwirowanie. Obecność VNP mNeonGreen w kulturze w oczyszczonych pożywkach potwierdzono elektroforezą w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Zawieszone oczyszczone pęcherzyki w PBS również wykazywały fluorescencję.

Aby zabarwić błonę pęcherzyków, dodaj fluorescencyjny barwnik lipidowy FM4-64 do oczyszczonych pęcherzyków w końcowym stężeniu 2 mikromolów i inkubuj przez 10 minut przed obrazowaniem. Po wyizolowaniu pęcherzyków wypełnionych białkiem z kultury Escherichia coli, pipetuj oczyszczone pęcherzyki na cienką na mniej niż 1 milimetr cienką, okrągłą podkładkę agarozową 2% LB, którą pozostawiono do uformowania i umieść na czystym szkiełku podstawowym. Po wyschnięciu płynu nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 mm x 25 milimetrów na pęcherzyki na podkładce.

Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe na miejscu za pomocą przekładek i taśmy klejącej. Następnie zamontuj szkiełko na odwróconym mikroskopie za pomocą obiektywu zanurzeniowego w oleju i pozostaw próbkę na 2 do 3 minut, aby się uspokoiła, a temperatura się zrównoważyła. W przypadku obrazów z pojedynczą klatką należy użyć uśredniania trzech obrazów, aby zredukować losowy szum tła zależny od sprzętu.

W przypadku obrazowania poklatkowego należy zachować od 3 do 5 minut między poszczególnymi klatkami. Obrazowanie za pomocą szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej wykazało oczyszczoną zieleń owodniową zawierającą pęcherzyki. Lipofilowy barwnik fluorescencyjny FM4-64 potwierdził obecność błon pęcherzykowych.

Mikroskopia oświetlenia strukturalnego żywych komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję białka błony wewnętrznej CydB połączonego z mNeonGreen i VNp6-mCherry2 wykazała wytwarzanie pęcherzyków i wprowadzanie ładunku.