Name: Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę produkcji rekombinowanych białek w pęcherzykach błonowych z wykorzystaniem E. coli. Protokół umożliwia ekspresję trudnych białek z wysoką wydajnością i ułatwia ich oczyszczanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują różnym użytkownikom Twittera, którzy zadawali pytania dotyczące protokołu przedstawionego w artykule opisującym technologię VNp. Rysunek 1A został wygenerowany przy użyciu ikon z flaticon.com. Prace te były wspierane przez University of Kent i finansowane przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/T008/768/1 i BB/S005544/1).

Prace bakteryjne prowadzone zgodnie z lokalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego, dostosowanymi do konkretnego poziomu zagrożenia bezpieczeństwa biologicznego każdego szczepu.
1. Wybór różnych VNps
<ol>
	<li>Zidentyfikuj sekwencje VNp. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zidentyfikowano trzy sekwencje VNp1, które skutkują maksymalną wydajnością i eksportem pęcherzykowym badanych do tej pory białek: VNp2, VNp6 i VNp15. Obecnie nie jest jasne, dlaczego niektóre warianty VNp działają wydajniej z niektórymi białkami niż inne; dlatego zaleca się, aby generowane były fuzje między nowym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania z każdym wariantem VNp (tj. VNp2, 6 lub 15). 
	VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA 
	AGKTKEGVL 
	VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA 
	AEKTKEGVM 
	VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE 
	Plazmidy, które umożliwiają ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania z różnymi fuzjami aminokońcowymi VNp, zostały udostępnione na rynku (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zaprojektuj strategię klonowania w celu wstawienia interesującego genu na końcu 3' cDNA kodującego VNp w jednym z tych konstruktów lub zaadaptuj istniejący plazmid, integrując zsyntetyzowany cDNA VNp przed pierwszym kodonem ATG genu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania. Użyj metod opisanych w1.</li>
	<li>W przypadku białek toksycznych należy użyć wektora z represyjnym promotorem ekspresji lub promotora z minimalnym nieindukowanym szumem ekspresji.</li>
	<li>Sklonuj znacznik sekwencji VNp na końcu aminowym białka fuzyjnego. Upewnij się, że znaczniki powinowactwa, sekwencje rozszczepienia proteazy itp. oraz białko będące przedmiotem zainteresowania znajdują się po stronie karboksylowej znacznika VNp. Zaleca się oddzielenie VNp od dalszego peptydu za pomocą elastycznego regionu łącznikowego, takiego jak dwa lub trzy powtórzenia sekwencji polipeptydowej -G-G-S-G- (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Używaj plazmidów z doborem antybiotyków, które nie są ukierunkowane na peptydoglikan, który osłabia powierzchnię komórki i zmniejsza wydajność pęcherzyków. Kanamycyna i chloramfenikol (patrz tabela materiałów) były preferowanymi antybiotykami stosowanymi w tym badaniu.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek bakteryjnych i indukcja białek
UWAGA: Szczepy bakterii zazwyczaj używane w tym protokole to Escherichia coli BL21 (DE3) lub W3110. Komórki E. coli są hodowane w bulionie lizogenicznym (LB) (10 g/l tryptonu; 10 g/l NaCl; 5 g/l ekstraktu drożdżowego) lub wspaniałym bulionie (TB) (12 g/l tryptonu; 24 g/l ekstraktu drożdżowego; 4 mL/L 10% glicerolu; 17 mM KH2PO4; 72 mM K2HPO4, sole autoklawowane oddzielnie) (patrz tabela materiałów). Przykładowe obrazy przedstawiające każdy etap indukcji białka oraz następujący po nim proces izolacji i oczyszczania są pokazane na Rysunek 2.
<ol>
	<li>Wyhodować 5 ml LB starterów ze świeżych przemian bakteryjnych w temperaturze 37 °C do nasycenia i użyć ich do zaszczepienia 25 ml gruźlicy w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml, przy odpowiednim doborze antybiotyków.</li>
	<li>Stosunek powierzchni do objętości jest ważnym czynnikiem w optymalizacji tego systemu. Użyć kolby o jak największej objętości (np. kolby o pojemności 5 litrów zawierającej 1 l kultury; w przypadku przebiegów optymalizacyjnych należy użyć 25 ml pożywki w kolbie o pojemności 500 ml).</li>
	<li>Inkubować większe kultury kolb wytrząsających w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min (≥25 mm rzutu orbitalnego), aż do osiągnięcia wartości gęstości optycznej 600 nm (OD600) wynoszącej 0,8–1,0. 
	UWAGA: Pęcherzyki są optymalne, gdy komórki rosną w temperaturze 37 °C. Jednak niektóre białka rekombinowane wymagają ekspresji w niższych temperaturach. W takim przypadku w przypadku białka będącego przedmiotem zainteresowania należy użyć znacznika VNp6, ponieważ umożliwia to wysokowydajny eksport pęcherzyków w temperaturach do 25 °C.</li>
	<li>Aby indukować ekspresję białka rekombinowanego z promotora T7, dodać izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia do 20 μg/ml (84 μM) (patrz tabela materiałów). Indukcja ekspresji białka rekombinowanego musi nastąpić w późnej fazie logarytmicznej (tj. typowy OD600 0,8-1,0) w celu wytworzenia pęcherzyków. 
	UWAGA: Długość okresu indukcji może się różnić w zależności od białka, przy czym niektóre osiągają maksymalną produkcję po 4 godzinach, a inne przez noc (18 godzin). Do tej pory maksymalny eksport pęcherzyków uzyskiwano w kulturach nocnych.</li>
</ol>
3. Izolacja pęcherzyków rekombinowanych
<ol>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g (4 °C) przez 20 minut.</li>
	<li>Aby wysterylizować pożywkę zawierającą pęcherzyki do długotrwałego przechowywania, przepuść oczyszczoną pożywkę hodowlaną przez sterylny i wolny od detergentów filtr polieterosulfonowy (PES) 0,45 μm (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: W celu zbadania wykluczenia żywych komórek z filtratu zawierającego pęcherzyki, należy umieścić płytkę na agarze LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby zagęścić pęcherzyki w mniejszej objętości, przepuść sterylne podłoże zawierające pęcherzyki przez sterylny i wolny od detergentów filtr 0,1 μm mieszanych estrów celulozy (MCE) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Delikatnie umyj membranę 0,5-1 ml sterylnego PBS za pomocą skrobaka do komórek lub plastikowego rozsiewacza, aby ostrożnie usunąć pęcherzyki z membrany. Przenieść do świeżej probówki do mikrofuge. 
	UWAGA: Oczyszczone pęcherzyki można przechowywać w sterylnym podłożu lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C. Istnieją przykłady rekombinowanych białek przechowywanych w tych pęcherzykach przez 6 miesięcy, w ten sposób bez utraty aktywności enzymatycznej.</li>
</ol>
4. Uwalnianie rozpuszczalnego białka z izolowanych pęcherzyków
<ol>
	<li>Po wyizolowaniu pęcherzyków zawierających białko w sterylnym pożywce/buforze, należy poddać pęcherzykowe błony lipidowe sonikacji, stosując odpowiedni harmonogram dla aparatu (np. 6 x 20 s cykli włączania i wyłączania) i wirować przy 39 000 x g (4 °C) przez 20 minut w celu usunięcia resztek pęcherzyków. 
	UWAGA: Szok osmotyczny lub detergent mogą być stosowane jako alternatywa dla rozbijania pęcherzyków, ale należy wziąć pod uwagę wpływ na funkcjonalność białek i/lub dalsze zastosowanie.</li>
	<li>Jeśli fuzja VNp pozostaje cytozolowa i nie uwalnia się do pożywki, wyizoluj białko przy użyciu standardowych protokołów (np. ponownie zawieś osady komórkowe w 5 ml odpowiedniego buforu ekstrakcyjnego (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonikatuj i usuń resztki komórek przez odwirowanie).</li>
</ol>
5. Oznaczanie stężenia białka
<ol>
	<li>Określ stężenie białek za pomocą analizy densytometrii żelowej próbek potrójnych1. Stosować razem z wzorcami ładowania albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na żelach do elektroforezy w żelu do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) barwionym coomassie. Zeskanuj i przeanalizuj żele za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Obraz J; patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
6. Wizualizacja powstawania pęcherzyków i izolowanych pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
UWAGA: Jeśli komórki zawierają fluorescencyjnie znakowane markery fuzji VNp lub błony, obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do śledzenia tworzenia pęcherzyków. Alternatywnie, fluorescencyjne barwniki lipidowe mogą być używane do wizualizacji pęcherzyków w celu potwierdzenia produkcji i oczyszczania.
<ol>
	<li>Montaż ogniwa
	<ol>
		<li>Wywołać ekspresję fuzji VNp przez kilka godzin przed zamontowaniem na szkiełku nakrywkowym.</li>
		<li>Metoda z podkładką agarozową (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A-C): odpipetować komórki na cienką (<1 mm), okrągłą podkładkę LB-agarozową (2%), którą pozostawiono do uformowania i ustawić na czystym szkiełku podstawowym. Pozwól, aby komórki osiadły i wyrównały się, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 mm x 25 mm na podkładce i komórkach. Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe na miejscu za pomocą przekładek i taśmy klejącej.</li>
		<li>Metoda polietylenoiminy (PEI) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3D-F): rozprowadzić 20 μl 0,05% PEI (w dH2O) na szkiełku nakrywkowym za pomocą końcówki pipety i pozostawić na 3-5 minut, aby związały się ze szkłem bez pozostawienia do wyschnięcia. Dodaj 50 μl hodowli komórkowej i pozostaw na 5-10 minut, aby upewnić się, że bakterie powiązały się z powierzchnią pokrytą PEI4. Umyj szkiełko nakrywkowe 100 μl podłoża przed umieszczeniem go na szkiełku podstawowym i przytrzymaj je za pomocą przekładek i taśmy klejącej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż pęcherzyków
	<ol>
		<li>Oczyszczone pęcherzyki odpipetować na cienką (<1 mm), okrągłą wacik LB-agarozy (2%), który pozostawiono do uformowania i umieścić na czystym szkiełku podstawowym. Po wyschnięciu płynu umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 mm x 25 mm na waciku i pęcherzykach. Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe na miejscu za pomocą przekładek i taśmy klejącej.</li>
		<li>Fluorescencyjny barwnik lipidowy FM4-64 jest w stanie zabarwić błony5, a zatem może być używany do wizualizacji pęcherzyków. Dodać FM4-64 (patrz tabela materiałów) do oczyszczonych pęcherzyków w końcowym stężeniu 2 μM (z 2 mM zapasu rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku [DMSO]) i wytworzyć obraz po 10 minutach inkubacji. Jest to szczególnie przydatne do identyfikacji pęcherzyków zawierających ładunki nieznakowane fluorescencyjnie5.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka nakrywkowe tym samym podłożem, które użyto do hodowli obserwowanych komórek. 
		UWAGA: Niektóre złożone media (np. TB) mogą wykazywać autofluorescencję, co może skutkować nadmiarem sygnału tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie pęcherzyków 
	UWAGA: Przykładowe obrazy mikroskopowe pęcherzyków rekombinowanych VNp można zobaczyć na Rysunek 4.
	<ol>
		<li>Zamontuj szkiełko na odwróconym mikroskopie (patrz tabela materiałów) za pomocą obiektywu zanurzeniowego w oleju i pozostaw na 2-3 minuty, aby próbka mogła się ustabilizować, a temperatura się zrównoważyła. 
		UWAGA: Wszystkie obrazowania żywych komórek dla każdej próbki muszą zostać zakończone w ciągu 30 minut od zamontowania komórek na szkiełkach nakrywkowych, aby zminimalizować wpływ fototoksyczności i stresu beztlenowego. Z tego powodu obrazy jednopłaszczyznowe są preferowane zamiast stosów z.</li>
		<li>Używaj odpowiednich źródeł światła (np. diody elektroluminescencyjnej [LED] lub żarówki halogenowej; patrz Tabela materiałów) i kombinacji filtrów dla używanego białka (białek) fluorescencyjnego / barwnika (barwników)6.</li>
		<li>Użyj soczewki o dużym powiększeniu (tj. 100x lub 150x) i dużej aperturze numerycznej (tj. NA ≥1.4) do obrazowania komórek i pęcherzyków drobnoustrojów.</li>
		<li>Określ minimalne natężenie światła wymagane do wizualizacji sygnałów fluorescencyjnych z komórek i / lub pęcherzyków. Może to wymagać pewnej regulacji ustawień ekspozycji i wzmocnienia dla używanego aparatu. 
		UWAGA: Typowe czasy naświetlania z obecnych kamer z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (CMOS) wahają się od 50 do 200 ms w zależności od systemu obrazowania.</li>
		<li>W przypadku obrazów z pojedynczą klatką należy użyć uśredniania trzech obrazów, aby zredukować losowy szum tła zależny od sprzętu.</li>
		<li>W przypadku zdjęć poklatkowych należy odczekać 3-5 minut między poszczególnymi klatkami. 
		UWAGA: W zależności od konfiguracji mikroskopu, podczas dłuższych eksperymentów poklatkowych może być konieczna okresowa regulacja ostrości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

<ol><li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396(2023).</li>
<li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32(2011).</li>
<li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria%3A+Signal+peptide+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139(2019).</li>
<li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+nature%3A+rational+design+of+sterile-surface+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+exocytosis+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li>
<li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li>
<li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift%2C+red-shifted+fluorescence%2C+and+low+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257(2017).</li>
<li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183(2019).</li>
<li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Opisana powyżej metoda produkcji białek rekombinowanych znakowana peptydami aminokońcowymi jest prostym procesem, który konsekwentnie daje duże ilości białka, które można skutecznie wyizolować i/lub przechowywać przez miesiące.
Ważne jest, aby podkreślić kluczowe kroki w protokole, które są wymagane do optymalnego wykorzystania tego systemu. Po pierwsze, znacznikVNp 1 musi znajdować się na końcu N, a następnie białko będące przedmiotem zainteresowania i wszelkie odpowiednie znaczniki. Ważne jest również, aby unikać stosowania antybiotyków, które działają na warstwę peptydoglikanu, takich jak ampicylina.
Jeśli chodzi o warunki wzrostu, konieczne jest wzbogacenie pożywek (np. Pożywki LB lub TB) oraz wysoki stosunek powierzchni do objętości, aby zmaksymalizować produkcję pęcherzyków. Optymalna temperatura do produkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wynosi 37 °C, ale należy również wziąć pod uwagę warunki zwykle wymagane do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. W przypadku niższych temperatur indukcji należy użyć VNp6. Co najważniejsze, indukcja promotora T7 musi być osiągnięta przy użyciu nie więcej niż 20 μg/ml (84 μM) IPTG, gdy komórki osiągną OD600 0,8-1,0. Białka ulegające ekspresji za pomocą systemu osiągają maksymalną produkcję pęcherzyków po 4 godzinach lub po indukcji przez noc.
Pomimo prostoty tego protokołu, wymaga on optymalizacji. Fuzja wariantów VNp, temperatury ekspresji i okresy indukcji mogą się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto istnieje potrzeba optymalizacji oczyszczania, a następnie zagęszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywki. Obecna procedura nie jest skalowalna i może być czasochłonna. To są ograniczenia tej metodologii.
Technologia VNp ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami2. Pozwala na eksport pęcherzykowy różnych białek, przy czym maksymalny rozmiar z powodzeniem wyrażony do tej pory wynosi 175 kDa dla pęcherzyków, które pozostają wewnętrzne, i 85 kDa dla tych, które są eksportowane. Co więcej, technologia ta może znacznie zwiększyć wydajność rekombinowanych białek o różnych właściwościach fizycznych i aktywnościach. Wywożone pęcherzyki zawierające białko będące przedmiotem zainteresowania mogą być wyizolowane przez prostą filtrację ze wstępnie oczyszczonej pożywki, a następnie mogą być przechowywane w sterylnej pożywce hodowlanej lub buforze w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
Zastosowania tego systemu są różnorodne, od odkryć naukowych po biotechnologię stosowaną i medycynę (np. poprzez produkcję funkcjonalnych środków terapeutycznych)3. Łatwość produkcji, dalsze przetwarzanie i wysoka wydajność to atrakcyjne cechy w tych obszarach, a zwłaszcza w przemyśle.

Gram-ujemne bakterie E. coli to atrakcyjny system do produkcji białek rekombinowanych zarówno na skalę przemysłową, jak i akademicką. Jest to nie tylko opłacalne i proste do hodowli w partiach do dużych gęstości, ale stworzono szerokie spektrum odczynników, szczepów, narzędzi i promotorów, aby promować wytwarzanie funkcjonalnych białek w E. coli1. Ponadto techniki biologii syntetycznej pokonują obecnie przeszkody zwykle związane z zastosowaniem modyfikacji potranslacyjnych i fałdowaniem złożonych białek2. Możliwość ukierunkowania wydzielania rekombinowanych białek na pożywki hodowlane jest atrakcyjna dla poprawy wydajności i obniżenia kosztów produkcji. Kontrolowane pakowanie zdefiniowanych przez użytkownika białek do pęcherzyków błonowych pomaga w rozwoju produktów i technologii w przemyśle biotechnologicznym i medycznym. Do tej pory brakowało powszechnie stosowanych metod wydzielania rekombinowanych białek z E. coli 3.
Eastwood i in. opracowali ostatnio metodę opartą na znakowaniu peptydów do produkcji i izolowania rekombinowanych pęcherzyków zawierających białka od E. coli1. Ten peptyd zarodkujący pęcherzyki (VNp) umożliwia wytwarzanie zewnątrzkomórkowych pęcherzyków błony bakteryjnej, do których można skierować wybrane białko rekombinowane, aby uprościć oczyszczanie i przechowywanie białka docelowego, i pozwala na znacznie wyższą wydajność niż zwykle dopuszcza się w przypadku kultur kolb wstrząsających. Odnotowano plony bliskie 3 g rekombinowanego białka na litr kultury kolbowej, przy czym wydajność >100 razy wyższa niż w przypadku równoważnych białek pozbawionych znacznika VNp. Te rekombinowane pęcherzyki wzbogacone w białko mogą być szybko oczyszczone i zagęszczone z pożywki hodowlanej i zapewniają stabilne środowisko do przechowywania. Technologia ta stanowi duży przełom w produkcji rekombinowanych białek E. coli. Pęcherzyki dzielą toksyczne i zawierające wiązania dwusiarczkowe białka w rozpuszczalną i funkcjonalną formę oraz wspierają proste, wydajne i szybkie oczyszczanie funkcjonalnych białek upakowanych w pęcherzyki do długotrwałego przechowywania lub bezpośredniego przetwarzania1.
Główne zalety tej technologii w porównaniu z obecnymi technikami to: (1) możliwość zastosowania do różnych rozmiarów (od 1 kDa do >100 kDa) i typów białek; (2) ułatwianie tworzenia między- i wewnątrzbiałkowych wiązań dwusiarczkowych; (3) ma zastosowanie do kompleksów wielobiałkowych; (4) może być stosowany z różnymi promotorami i standardowymi laboratoryjnymi szczepami >E. coli; (5) wytwarzanie plonów białek z kolb do wytrząsania, zwykle obserwowane tylko w przypadku kultur fermentacyjnych; Białka są eksportowane i pakowane w pęcherzyki połączone błoną, które (6) zapewniają stabilne środowisko do przechowywania aktywnego rozpuszczalnego białka; oraz (7) upraszcza dalsze przetwarzanie i oczyszczanie białek. To proste i ekonomiczne narzędzie do rekombinacji białek prawdopodobnie będzie miało pozytywny wpływ na przemysł biotechnologiczny i medyczny, a także na odkrycia naukowe.
Tutaj szczegółowy protokół, rozwijany przez kilka lat, opisuje optymalne warunki do produkcji rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem z bakterii za pomocą technologii VNp. Pokazano przykładowe obrazy tego systemu w praktyce, z ekspresją białka fluorescencyjnego, co pozwala na wizualizację obecności pęcherzyków na różnych etapach produkcji, oczyszczania i zagęszczania. Na koniec przedstawiono wytyczne dotyczące wykorzystania obrazowania żywych komórek do walidacji wytwarzania pęcherzyków zawierających fuzję VNp z bakterii.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Melford</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>Lab Stock</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10&beta;</td><td>Lab Stock</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do mikroskopu</td><td>Sondy</td> molekularne Chroma <td></td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>(Invitrogen)</td><td>T-3166</td><td>Rozpuszczony w DMSO, stężenie zapasowe 2</td></tr><tr><td>mM ImageJ</td><td>Open Source</td><td></td><td>Pobrane z: https://imagej.net/ij/index.html</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;- D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Melford</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Gibco (Thermofisher Scientific)</td><td>11815-024</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła LED do mikopu</td><td>Cairn Research Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bulion lizogeniczny (LB) / LB agar</td><td>Lab Stock</td><td>N/A</td><td>10 g/L Trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L Ekstrakt drożdżowy (1,5 g/L agar)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>do obrazowania metamorficznegoUrządzenia</td><td></td><td></td>molekularne</tr><tr><td>MF-Millipore Filtr membranowy (0,1 i mikro; m, MCE)</td><td>Filtr</td><td></td> membranowy Merck VCWP04700 <td></td></tr><tr><td>Millipore Express PLUS (0,45 &mikro; m, PES)</td><td>Merck</td><td>HPWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Lab Stock</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy umożliwiające ekspresję interesującego białka z różnymi fuzjami aminokońcowymi VNp&nbsp;</td><td>Addgene</td><td></td><td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td></tr> <tr><td>Terrific Bulth (TB)</td><td>Lab Stock</td><td>N/A</td><td>12 g/L Trypton; 24 g/L Ekstrakt drożdżowy; 4 ml/L 10% glicerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem e. coli

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

Ten innowacyjny system, wykorzystujący krótki znacznik peptydowy, który eksportuje wiele rekombinowanych białek w pęcherzykach błonowych z E. coli, zapewnia skuteczne rozwiązanie szeregu problemów związanych z ekspresją bakteryjnych białek rekombinowanych. Te rekombinowane pęcherzyki dzielą białka na przedziały w mikrośrodowisku, które ułatwia produkcję białek bakterii, które w przeciwnym razie stanowiłyby wyzwanie, toksyny, nierozpuszczalne lub zawierające wiązania dwusiarczkowe. Wydajność białka jest znacznie zwiększona w porównaniu z typową ekspresją bakteryjną przy braku znacznika peptydowego zarodkującego pęcherzyki. Uwalnianie białek upakowanych w pęcherzyki wspomaga izolację od pożywki hodowlanej i umożliwia długotrwałe przechowywanie aktywnych białek. Technologia ta pozwala na zwiększenie wydajności funkcjonalnych białek upakowanych w pęcherzyki, co upraszcza dalsze przetwarzanie w szerokim zakresie zastosowań, od biotechnologii stosowanej po odkrycia naukowe i medycynę. W niniejszym artykule i powiązanym z nim filmie przedstawiono szczegółowy protokół metody, który podkreśla kluczowe kroki w metodologii mającej na celu maksymalizację produkcji pęcherzyków wypełnionych rekombinowanym białkiem.

Szczepy E. coli BL21 DE3 zawierające konstrukt ekspresyjny VNp6-mNeongreen hodowano do późnej fazy logarytmicznej (Rycyna 2A). Ekspresję VNp6-mNeongreen indukowano poprzez dodanie IPTG do hodowli (stężenie końcowe 20 µg/mL lub 84 µM), a następnie pozostawiono do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu (200 rpm, wyrzut orbitalny ≥25 mm). Następnego ranka hodowla wykazywała fluorescencję mNeongreen7 (Rycyna 2B), która pozostała widoczna w pożywce po usunięciu komórek bakteryjnych poprzez wirowanie (Rycyna 2C). Obecność VNp-mNeongreen w hodowli oraz w oczyszczonej pożywce potwierdzono za pomocą SDS-PAGE (Rycyna 2D). Pęcherzyki zawierające mNeongreen wyizolowano na filtr MCE 0,1 µm (Rycyna 2E) i resuspendowano w PBS (Rycyna 2F). Oczyszczone pęcherzyki naniesiono następnie na podkładkę agarozową (Rycyna 3A-C) i obrazowano za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej (Rycyna 4A). Obecność błon pęcherzykowych potwierdzono przy użyciu lipofilowego barwnika fluorescencyjnego FM4-64 (Rycyna 4B). Komórki E. coli eksponujące białko błony wewnętrznej CydB połączone z mNeongreen (zielony) oraz VNp6-mCherry2 (magenta)8 wykazują produkcję pęcherzyków i insercję ładunku w żywych komórkach bakteryjnych (Rycyna 4C). Zdjęcia Rycyna 4A,B wykonano za pomocą szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego, natomiast Rycyna 4C została uzyskana przy użyciu mikroskopii iluminacji strukturalnej (SIM), stosując metody opisane wcześniej9,10.
<img alt="Schemat oczyszczania białek z VNp, znacznikami, miejscem TEV, hodowlą bakteryjną, wirówką, filtracją." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Podsumowanie technologii VNp, od opracowania strategii klonowania po oczyszczanie i przechowywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. (A) Schemat typowego białka fuzyjnego VNp. VNp na terminusie NH2, po którym następuje elastyczny łącznik i odpowiednia kombinacja znaczników powinowactwa i fluorescencji (Tag1, Tag 2, miejsce cięcia proteazy [np. TEV]) oraz białko docelowe. (B) Schemat podsumowujący protokół ekspresji i oczyszczania rekombinowanych pęcherzyków błonowych wypełnionych białkiem z E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Indukcja i oczyszczanie białka; wynik SDS-PAGE; układ filtracyjny; oczyszczanie pęcherzyków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Etapy produkcji i oczyszczania pęcherzyków VNp6-mNg. Kultury komórek E. coli zawierające konstrukt ekspresyjny VNp-mNeongreen w świetle niebieskim przed (A) lub po (B) indukowanej przez IPTG ekspresji białka fuzyjnego. Komórki z (B) usunięto przez wirowanie, pozostawiając w pośrodku pęcherzyki wypełnione VNp-mNeongreen (C). (D) Równoważne próbki z A, B i C przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Pęcherzyki wyizolowano na filtrze 0,1 µm (E), a następnie wypłukano do odpowiedniej objętości buforu (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przygotowania podkładki agarozowej i szkiełka podstawowego powleczonego PEI do przygotowania preparatu mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Procedura montażu komórek do obrazowania pęcherzyków i produkcji pęcherzyków. (A-C) Metoda podkładki agarozowej oraz (D-F) metoda PEI do montażu komórek E. coli na szkiełku podstawowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna pęcherzyków VNp; schematy przedstawiają VNp-mNG, barwienie FM4-64 oraz interakcję mCherry2 CydB." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazy mikroskopowe rekombinowanych pęcherzyków VNp. Obrazy emisji zielonej (A) i czerwonej (B) z różnych pól pęcherzyków zawierających VNp6-mNeongreen, znakowanych FM4-64 i osadzonych na podkładce agarozowej. (C) Obrazowanie komórek E. coli wykazujących ekspresję białka błony wewnętrznej CydB połączonego z mNeongreen (zielony) i VNp6-mCherry2 (magenta) pokazuje produkcję pęcherzyków i insercję ładunku w żywych komórkach bakteryjnych. (A,B) zostały wykonane przy użyciu szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego, natomiast (C) uzyskano za pomocą mikroskopii z oświetleniem strukturalnym (SIM). Paski skali: (A,B) = 10 µm; (C) = 1 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Staramy się zrozumieć dynamiczne interakcje między cząsteczkami w żywych komórkach. Do analizy biochemicznej może być konieczne użycie dużych ilości rekombinowanego białka. Mogą one być niezwykle trudne do wyrażenia w prawidłowo złożonej i funkcjonalnej formie.Gdyby okazało się, że białko jest nieprawidłowo sfałdowane lub nierozpuszczalne w przypadku ekspresji w bakteriach, naukowcy musieliby albo uciec się do komórek ssaków, co jest drogie i stosunkowo powolne, albo użyć syntetycznych polipeptydów. Nasz protokół pozwala na ekspresję o wysokiej wydajności, a także eksport trudnych białek z E. coli. Dodanie krótkiej, rozszczepialnej sekwencji peptydowej do końca aminowego białka nie tylko zwiększa produkcję i wydajność każdego białka, które testowaliśmy do tej pory, ale także eksportuje białko z komórki do pożywki.Wraz z uproszczeniem ekspresji białek, upraszcza również oczyszczanie białek w dalszej części łańcucha dostaw. Po sklonowaniu peptydu zarodkującego pęcherzyki lub VNP, znacznik sekwencji na końcu aminowym kultury białka fuzyjnego, 5-mililitrowy bulion lizogeniczny lub LB, startery ze świeżych przemian bakteryjnych w temperaturze 37 stopni Celsjusza do nasycenia. Następnie użyj tego do zaszczepienia 25 mililitrów wspaniałego bulionu lub TB, zawierającego odpowiedni dobór antybiotyków w stożkowej kolbie o pojemności 500 mililitrów, Inkubuj kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę lub większą niż równa 25 milimetrowym rzutom orbitalnym, aż kultura osiągnie wartość gęstości optycznej 600 nanometrów lub OD 600 od 0,8 do 1,0.Następnie indukuj ekspresję rekombinowanego białka z promotora T7, dodając IPTG do końcowego stężenia do 20 mikrogramów na mililitr lub 84 mikromolowe. Po pozostawieniu wystarczającej ilości czasu na indukcję, osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3000 x g i 4 stopnie Celsjusza przez 20 minut. Przepuść supernatant przez sterylny i wolny od detergentów filtr PES o grubości 0,45 mikrona, aby wysterylizować pożywkę zawierającą pęcherzyki do długotrwałego przechowywania.Aby skoncentrować pęcherzyki w mniejszej objętości, przepuść sterylne podłoże zawierające pęcherzyki przez sterylny i wolny od detergentów filtr MCE 0,1 mikrona. Następnie delikatnie umyj membranę 0,5 do 1 mililitra sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS i użyj skrobaka do komórek lub plastikowego rozsiewacza, aby ostrożnie usunąć pęcherzyki z membrany. Przenieść koncentrat pęcherzyków do świeżej probówki do mikrowirówki za pomocą pipety.Oczyszczone pęcherzyki można przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Sonikować białko zawierające pęcherzyki w sterylnym podłożu przy użyciu odpowiedniego harmonogramu, aby rozbić pęcherzykowe błony lipidowe i uwolnić białko Odwirować sonikowaną zawiesinę w temperaturze 39 000 x g i 4 stopnie Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć resztki pęcherzyków. BL21 DE3 Escherichia coli zawierająca konstrukt ekspresji VNP 6 mNeonGreen wykazywał fluorescencję mNeonGreen indukowaną przez noc za pomocą IPTG.Fluorescencja pozostała widoczna w hodowli po usunięciu komórek bakteryjnych przez odwirowanie. Obecność VNP mNeonGreen w kulturze w oczyszczonych pożywkach potwierdzono elektroforezą w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Zawieszone oczyszczone pęcherzyki w PBS również wykazywały fluorescencję.Aby zabarwić błonę pęcherzyków, dodaj fluorescencyjny barwnik lipidowy FM4-64 do oczyszczonych pęcherzyków w końcowym stężeniu 2 mikromolów i inkubuj przez 10 minut przed obrazowaniem. Po wyizolowaniu pęcherzyków wypełnionych białkiem z kultury Escherichia coli, pipetuj oczyszczone pęcherzyki na cienką na mniej niż 1 milimetr cienką, okrągłą podkładkę agarozową 2% LB, którą pozostawiono do uformowania i umieść na czystym szkiełku podstawowym. Po wyschnięciu płynu nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 mm x 25 milimetrów na pęcherzyki na podkładce.Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe na miejscu za pomocą przekładek i taśmy klejącej. Następnie zamontuj szkiełko na odwróconym mikroskopie za pomocą obiektywu zanurzeniowego w oleju i pozostaw próbkę na 2 do 3 minut, aby się uspokoiła, a temperatura się zrównoważyła. W przypadku obrazów z pojedynczą klatką należy użyć uśredniania trzech obrazów, aby zredukować losowy szum tła zależny od sprzętu.W przypadku obrazowania poklatkowego należy zachować od 3 do 5 minut między poszczególnymi klatkami. Obrazowanie za pomocą szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej wykazało oczyszczoną zieleń owodniową zawierającą pęcherzyki. Lipofilowy barwnik fluorescencyjny FM4-64 potwierdził obecność błon pęcherzykowych.Mikroskopia oświetlenia strukturalnego żywych komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję białka błony wewnętrznej CydB połączonego z mNeonGreen i VNp6-mCherry2 wykazała wytwarzanie pęcherzyków i wprowadzanie ładunku.

optimized-production-analysis-recombinant-protein-filled-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Źródło: Streather, B. R., et al. Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem z E. coli. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje produkcję i izolację rekombinowanych białek oznaczonych peptydem zarodkującym pęcherzyki (VNp) z pęcherzyków bakteryjnych. Induktor wyzwala ekspresję białka znakowanego VNp, napędzając tworzenie pęcherzyków i enkapsulację, a następnie wirowanie i sonikację w celu wydajnego odzyskiwania białka bez lizy...

Produkcja i odzyskiwanie białek rekombinowanych z pęcherzyków pochodzących od bakterii

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli poprzez współekspresję chimerycznego RNA, który zawiera interesujące RNA w rusztowaniu wiroidowym i roślinnej ligazie tRNA. Głównym produktem jest okrągła cząsteczka, która ułatwia oczyszczanie do jednorodności.

Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Poznaj zoptymalizowaną metodę produkcji rekombinowanych białek w pęcherzykach błonowych z wykorzystaniem E. coli. Protokół umożliwia ekspresję trudnych białek z wysoką wydajnością i ułatwia ich oczyszczanie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

Przeglądaj więcej filmów