Name: Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj zautomatyzowany system hodowli komórek iPS, który zmniejsza zmienność i obciążenie pracą. Urządzenie jest kompaktowe, opłacalne i umożliwia utrzymanie oraz różnicowanie komórek macierzystych z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte grantem z Centrum Promocji Nowego Biznesu, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japonia.

Komisja Etyki Uniwersytetu Medycznego Kansai zatwierdziła wytwarzanie i używanie zdrowych iPSC pochodzących od ochotników o nazwie KMUR001 (zatwierdzenie nr 2020197). Dawca, który został otwarcie zrekrutowany, wyraził formalną świadomą zgodę i zgodził się na naukowe wykorzystanie komórek.
UWAGA: Obecny interfejs (specjalne oprogramowanie o nazwie "ccssHMI" działające pod systemem operacyjnym Windows XP) jest podstawowym ekranem operacyjnym. Pod wspomnianym interfejsem rozmieszczony jest szereg zakładek, które pozwalają użytkownikom inicjować różne operacje.
1. Operacje wczytywania
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Ładowanie na górnym ekranie oprogramowania. Kliknij przycisk Rozpoczęcie przygotowania do wczytywania.</li>
	<li>Umieść naczynia lub talerze, które mają zostać wprowadzone do urządzenia, w odpowiednim miejscu w urządzeniu. 
	UWAGA: Informacje niezbędne do identyfikacji naczynia powinny być umieszczone na każdej pokrywie.</li>
	<li>Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.</li>
	<li>Wybierz rodzaj i ilość naczyń lub talerzy w oprogramowaniu.</li>
	<li>Kliknij przycisk Przygotowanie do załadunku zakończone. Kliknij przycisk Wczytywanie Start.</li>
	<li>Po załadowaniu anteny do systemu wybierz w oprogramowaniu informacje na czaszy, takie jak z komórkami iPS lub bez komórek iPS. Rejestruj notatki dotyczące każdej potrawy w oprogramowaniu.</li>
	<li>Kliknij przycisk Rejestracja na końcu, aby zakończyć operację ładowania.</li>
</ol>
2. Operacja rozładunku
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Rozładuj na górnym ekranie oprogramowania. Wybierz naczynia do usunięcia w oprogramowaniu.</li>
	<li>Po wybraniu potraw kliknij przycisk Rozpoczęcie przygotowania do rozładunku. Kliknij przycisk Rozpoczęcie rozładowywania.</li>
	<li>Po przeniesieniu szalki (naczyń) z inkubatora na stół warsztatowy w systemie, naciśnij przycisk Wyjmowanie naczynia.</li>
	<li>Ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i wyjmij naczynia. Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.</li>
</ol>
3. Uzupełnienie materiałów eksploatacyjnych: pipety, probówki i medium
<ol>
	<li>Aby uzupełnić materiały eksploatacyjne, takie jak pipety, probówki i nośniki, kliknij przycisk Materiały eksploatacyjne na górnym ekranie oprogramowania, a następnie wybierz artykuł, który chcesz uzupełnić.
	<ol>
		<li>Pipety
		<ol>
			<li>Kliknij przycisk Pipeta. Wybierz przycisk Uzupełnij.</li>
			<li>Wybierz stojak, który użytkownik chce uzupełnić w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.</li>
			<li>Po upewnieniu się, że pokrywa schowka na pipety na stole warsztatowym jest otwarta, ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i w razie potrzeby uzupełnij pipety.</li>
			<li>Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa. Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.</li>
			<li>Kliknij przycisk Ustawienia uzupełniania zapasów i wprowadź informacje dotyczące uzupełnienia, a następnie kliknij przycisk Rejestracja.</li>
			<li>Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rury
		<ol>
			<li>Kliknij przycisk Rura. Wybierz przycisk Uzupełnij.</li>
			<li>Wybierz stojak, który użytkownik chce uzupełnić w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.</li>
			<li>Po potwierdzeniu, że stojak przesunął się na górę, kliknij przycisk Uzupełnij rurkę.</li>
			<li>Ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i w razie potrzeby uzupełnij rurki.</li>
			<li>Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.</li>
			<li>Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.</li>
			<li>Kliknij przycisk Ustawienia uzupełniania zapasów i wprowadź informacje dotyczące uzupełnienia, a następnie kliknij przycisk Rejestracja. Kliknij przycisk Zamknij.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Średni
		<ol>
			<li>Kliknij przycisk Średni. Wybierz przycisk Uzupełnij w oprogramowaniu.</li>
			<li>Wybierz jeden stojak z trzech, który użytkownicy chcą uzupełnić. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.</li>
			<li>Po upewnieniu się, że pokrywa schowka na nośnik została otwarta, ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i uzupełnij nośnik.</li>
			<li>Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.</li>
			<li>Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.</li>
			<li>Kliknij przycisk Uzupełnij i wprowadź informacje o nośniku, w tym nazwę i ilość nośnika. W razie potrzeby wprowadź dodatkowe komentarze.</li>
			<li>Kliknij przycisk Rejestracja.</li>
			<li>Kliknij przycisk Zamknij.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wybór zadania
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Zadanie na górnym ekranie oprogramowania.</li>
	<li>Wybierz przycisk Ustawienia zadania. Wybierz żądane zadanie z listy zadań i kliknij przycisk Następny krok.</li>
	<li>Określ datę i godzinę wykonania zadania, a następnie kliknij przycisk Rejestracja. Wybierz danie lub talerz do wykonania zadania, a następnie kliknij przycisk Rejestracja.</li>
	<li>Po ponownym potwierdzeniu wybranego zadania kliknij przycisk Rejestracja. Upewnij się, że zadanie zostało zarejestrowane na następnym ekranie.</li>
	<li>W razie potrzeby ustaw następne zadanie w ten sam sposób.</li>
	<li>Kliknij przycisk Start na końcu. Następnie zadanie rozpocznie się automatycznie w określonym dniu i godzinie. 
	UWAGA: Natychmiast po zakończeniu każdego zadania automatycznie włączają się lampy UV (umieszczone po dwóch stronach okapu), a po 5-30 minutach, zgodnie z ustawieniem pomocniczym, są wyłączane, aby utrzymać okap w stanie aseptycznym. Aby zatrzymać, użytkownicy mogą kliknąć przycisk Start.</li>
	<li>Jeśli użytkownicy chcą anulować zaplanowane zadanie z wyprzedzeniem, kliknij przycisk Zatrzymaj.</li>
	<li>Po wybraniu zadania, które ma zostać przerwane, kliknij przycisk Edytuj zadanie.</li>
	<li>Kliknij przycisk Anuluj zadanie. Upewnij się, że zadanie zostało usunięte na następnym ekranie.</li>
</ol>
5. Sprawdź zdjęcia komórek
<ol>
	<li>Każde zadanie obejmuje obserwacje mikroskopowe (robienie zdjęć) przed i po pracy nad zadaniem. Obserwuj postęp hodowli komórkowej na zdjęciach, włączając zadanie fotografii mikroskopowej przed lub po każdym zadaniu.</li>
	<li>Wybierz wstępnie ustawione programy zadań, w tym wybór wielu określonych lokalizacji naczynia lub płytki studzienki z wyprzedzeniem w celu obserwacji w stałym punkcie w celu monitorowania tej samej lokalizacji w czasie.</li>
</ol>
6. Przejście i różnicowanie
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcjach 1-5 i ustaw automatyczny system hodowli komórkowej tak, aby przeprowadzał pasażowanie i różnicowanie. Ustawienia przyrządów do pasażowania, różnicowania kardiomiocytów, różnicowania hepatocytów, różnicowania neuronalnych komórek prekursorowych i różnicowania keratynocytów przedstawiono odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5.</li>
</ol>

Induced Pluripotent Stem Cell Differentiation Using an Automated Culture System

<ol><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacologic+testing+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).</li>
<li>Egashira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+characterization+using+LQTS-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).</li>
<li>Sasamata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+robust+platform+for+induced+pluripotent+stem+cell+research+using+Maholo+LabDroid%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+technology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid.</a> SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).</li>
<li>Tristan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+high-throughput+biomanufacturing+and+functional+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).</li>
<li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific Reports. 5, 16647(2015).</li>
<li>McClymont, D. W., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((With+all+due+respect+to+Maholo%2C+lab+automation+isn%27t+anthropomorphic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).</li>
<li>Gonzalez, F., Zalewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+joint-level+robot+programming+with+a+new+robotics+software+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Robotics%22%5BJournal%5D)">Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool.</a> Robotics. 6 (4), 41(2017).</li>
<li>Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+automated+culture+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cell+maintenance+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+oxidation+is+indispensable+for+survival+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Shimojo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+and+simple+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).</li>
<li>Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+keratinocyte-like+cells+for+research+on+Protease-Activated+Receptor+2+in+nonhistaminergic+cascades+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+ethnically+diverse+human+embryonic+stem+cells+identifies+a+chromosome+20+minimal+amplicon+conferring+growth+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).</li>
<li>Keller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+factors+which+modulate+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Krytycznym krokiem w protokole jest to, że jeśli użytkownik znajdzie jakiekolwiek usterki, kliknij przycisk Anuluj, Zatrzymaj lub Zresetuj w dowolnym momencie i zacznij od pierwszego kroku. Oprogramowanie pozwala uniknąć błędów ludzkich, w tym podwójnej rezerwacji, otwierania drzwi, gdy zadania systemu są aktywne, oraz braku uzupełniania zapasów. Innym krytycznym punktem dla udanego i skutecznego różnicowania do pożądanej komórki somatycznej jest właściwy dobór pluripotencjalnych linii komórek macierzystych, ponieważ każda pluripotencjalna komórka macierzysta ma niekontrolowane odchylenie we właściwościach różnicowania14,15.
Ten zautomatyzowany system hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych może je utrzymywać i różnicować w różne typy komórek somatycznych. Wymiary tego systemu to 200 cm (szerokość), 110 cm (głębokość) i 233 cm (wysokość), przy masie całkowitej 1,2 tony. Inkubator wbudowany w urządzenie może jednocześnie pomieścić trzydzieści sześć 10-centymetrowych szalek i dziewięć płytek wielodołkowych.
Ulepszenia w stosunku do poprzednich modeli polegają na tym, że po pierwsze, jako ramię manipulacyjne, system szyn osi X-Y-Z został nowo przekształcony z 6-osiowego ramienia przegubowego, które działa poprzez zmianę końcówki ramienia na trzy różne części do naczyń, probówek i pipet. Ramię jest podwieszone pod sufitem systemu i porusza się wzdłuż osi X-Y-Z. Po drugie, wprowadzono system zliczania komórek dla kultur konserwacyjnych bez karmienia i protokołów indukcji różnicowania, które są wykonywane w sposób ciągły od momentu przejścia. Po zmieszaniu roztworu zawiesiny jednokomórkowej z roztworem błękitu trypanowego, przeniesiono go do jednorazowego hemocytometru w celu obserwacji mikroskopowej i obrazowania. Oprogramowanie automatycznie analizuje uzyskany obraz, aby policzyć liczbę żywych komórek i obliczyć objętość wymaganą do zasiewu wymaganej liczby komórek. Dokładność zliczania komórek uzyskana w wyniku tej analizy obrazu była zgodna z dokładnością uzyskaną ręcznie.
System szyn osi X-Y-Z został zastosowany w celu szybszej obsługi każdego zadania niż poprzednia wersja (wieloosiowe ramię przegubowe). Dzięki temu zautomatyzowanemu systemowi hodowli wykonano pięć ciągłych pasaży przez 16 dni, a iPSC rozszerzono 625 ± 93-krotnie. Chociaż dowód wytrzymałości na czas utrzymywania ogniw bez ogniw zasilających był krótszy niż nasza poprzednia demonstracja z ogniwami zasilającymi, ekspansja komórek była bardziej efektywna w porównaniu z poprzednią demonstracją6. Skrócony czas zadania wydawał się przyczyniać do zapobiegania wysychaniu komórek podczas wykonywania zadań. 
Ponadto zadania różnicowania od hodowli podtrzymującej do różnicowania w kardiomiocyty, hepatocyty, neuronalne komórki prekursorowe i keratynocyty wykonano bez interwencji człowieka. Po serii tych kursów potwierdzono za pomocą barwienia fluorescencyjnego, że komórki uzyskane w samym zautomatyzowanym systemie hodowli zróżnicowały się w pożądane komórki. Dlatego, udostępniając program zadaniowy i korzystając z tego systemu, naukowcy, którzy nie są zaznajomieni z zarządzaniem komórkami iPS, mogą pozyskać komórki somatyczne pochodzące z iPSC do własnych badań. Co więcej, różnice w odtwarzalności między badaczami lub placówkami mogłyby zostać wyeliminowane w jak największym stopniu, co mogłoby zagwarantować, że za każdym razem uzyskuje się komórki o jednorodnej jakości.
Dzięki zastosowaniu nowego systemu szynowego, sprzęt mógł zostać zmniejszony i lżejszy do 1,2 tony, czyli ~200 kg lżejszy niż wcześniej. Co więcej, koszty ustawień części i programów mogą zostać zmniejszone o około 10 000 USD. Szacuje się, że koszty utrzymania i programowania spadną o 13%. Aby zmotywować większą liczbę badaczy do łatwego udziału w badaniach związanych z komórkami iPS, ważne jest również utrzymanie niskich kosztów sprzętu6. Mamy nadzieję, że obecne i następne generacje systemów hodowli automatycznych będą jednym z wkładów w dostarczanie iPSC i zróżnicowanych komórek pochodzących z iPSC o bardziej jednolitej jakości. 
Głównymi ograniczeniami tego systemu są ograniczona pojemność lodówki do wstępnego przechowywania kultur oraz jej słabość w radzeniu sobie z niewielkimi ilościami (<100 μl) płynu. Co więcej, brak wyrafinowanej sztucznej inteligencji uniemożliwia automatyczną optymalizację w zależności od stanu ogniwa na czas. Niewielkim ograniczeniem jest wymóg stosowania specjalnych końcówek do pipet dostarczanych przez producentów systemu 4,5. Opracowujemy nową generację systemów hodowlanych, które będą w stanie poradzić sobie z niewielkimi ilościami płynów do pożywek i będą wyposażone w system optymalizacji sprzężenia zwrotnego oparty na wysokowydajnej sztucznej inteligencji (uczenie się systemu). Nasz współpracujący producent9 posiada wystarczające know-how, aby budować systemy na zamówienie zgodnie ze specjalnymi potrzebami użytkowników. Oprócz tego wkrótce na rynku pojawią się systemy nowej generacji wyposażone w bardziej ogólne i szersze funkcje. Rozważamy również wprowadzenie systemu wynajmu opartego na subskrypcji, aby zapewnić wszystkim użytkownikom aktualne systemy.

Ten artykuł ma na celu przedstawienie rzeczywistych i szczegółowych procedur postępowania z automatycznym systemem hodowli ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które wyprodukowaliśmy współpracując z firmą, oraz pokazanie reprezentatywnych wyników.
Od czasu publikacji artykułu w 2007 roku, iPSC przyciąga uwagę na całym świecie1. Ze względu na jego największą cechę, jaką jest zdolność do różnicowania się w dowolny typ komórki somatycznej, oczekuje się, że znajdzie zastosowanie w różnych dziedzinach, takich jak medycyna regeneracyjna, wyjaśnianie przyczyn trudnych do opanowania chorób i opracowywanie nowych leków terapeutycznych2,3. Ponadto wykorzystanie ludzkich komórek somatycznych pochodzących z iPSC może ograniczyć liczbę eksperymentów na zwierzętach, które podlegają znacznym ograniczeniom etycznym. Chociaż do badań nad nowymi metodami z wykorzystaniem iPSC stale potrzebne są liczne jednorodne komórki iPS, zarządzanie nimi jest zbyt pracochłonne. Co więcej, obsługa iPSC jest trudna ze względu na jego wysoką wrażliwość, nawet na subtelne zmiany kulturowe i środowiskowe.
Aby rozwiązać ten problem, oczekuje się, że zautomatyzowane systemy hodowli będą wykonywać zadania zamiast ludzi. Niektóre grupy opracowały kilka zautomatyzowanych systemów hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do utrzymania i różnicowania komórek i opublikowały swoje osiągnięcia4,5,6. Systemy te wyposażone są w wieloprzegubowe ramiona robotyczne. Ramiona robotyczne mają nie tylko zaletę polegającą na tym, że w dużym stopniu naśladują ruchy ludzkiego ramienia, ale także na tym, że wymagają wyższych kosztów za ramię (ramiona), większego i cięższego opakowania systemu oraz czasochłonnych wysiłków edukacyjnych inżynierów w celu uzyskania ukierunkowanych ruchów7,8. Aby ułatwić wprowadzenie aparatury do większej liczby placówek badawczych w punktach ekonomicznych, kosmicznych i zużycia zasobów ludzkich, opracowaliśmy nowatorski zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania iPSC na różne typy komórek9.
Naszym uzasadnieniem dla nowego systemu było przyjęcie systemu szyn osi X-Y-Z zamiast wieloprzegubowych ramion robotycznych9. Aby zastąpić złożone funkcje przypominające dłoń w ramionach robotycznych, zastosowaliśmy nowy pomysł w tym systemie, który może automatycznie zmieniać trzy typy określonych funkcjonalnych końcówek ramion. W tym miejscu wskazujemy również, w jaki sposób użytkownicy mogą łatwo tworzyć harmonogramy zadań za pomocą prostych zamówień w oprogramowaniu ze względu na brak wymagań dotyczących wkładu inżynierów w całym procesie.
Jeden z systemów hodowli robotycznej zademonstrował tworzenie ciał embrionalnych przy użyciu 96-dołkowych płytek jako agregatów komórek 3D do różnicowania4. Opisany tutaj system nie obsługuje płytek 96-dołkowych. Jeden z nich osiągnął obecną ocenę dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP) przy użyciu linii komórkowej, chociaż nie była to ludzka pluripotencjalna komórka macierzysta 5. Opisany tutaj zautomatyzowany system hodowli został opracowany w konkretnym celu, jakim jest pomoc w eksperymentach laboratoryjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ma jednak wystarczająco dużo systemów, aby utrzymać poziom czystości równoważny szafie bezpieczeństwa poziomu IV.

<table><tbody><tr><td>0,15% frakcja albuminy surowicy bydlęcej V</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>1% GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>10 cm talerze plastikowe </td><td>Corning Inc., NY, Stany Zjednoczone</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>253G1</td><td>RKEN Bioresource Research Center</td><td>HPS0002</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Aktynina  mysz</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Activin A </td><td>Nacali Tesque</td><td>18585-81</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14906.30</td><td></td></tr><tr><td>Albumina  królik</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas all-trans retinowy</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc. </td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system hodowli</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc. </td><td>062-06661</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC9531</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Merck</td><td>810037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 </td><td>MCE, NJ, Stany Zjednoczone #HY-10182</td><td>252917-06-9</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowany keratynocyt-SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10744019</td><td>Ludzkie podłoże keratynocytowe</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Merck</td><td>266785</td><td></td></tr><tr><td>Dihexa </td><td>TRC, Ontario, Kanada</td><td>13071-60-8</td><td>rac-1,2-diheksadyloglicerol</td></tr><tr><td>Jednorazowy hemocytometr</td><td>CountessTM Szkiełka z komorą do liczenia komórek, Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1219168-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle średni/F12 </td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td><td></td><td></td>12634010</tr><tr><td>EGF</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc. </td><td>053-07751</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędny 8 </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca </td><td>Biowest, FL, Stany Zjednoczone</td><td>S140T</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic </td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>19155-07</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J63292. </td><td></td>MF</tr><tr><td>Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific 25030081</td><td></td><td>Suplement glutaminy</td></tr><tr><td>Kozi IgG(H+L) AlexaFluo546</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4A  koza</td><td>Santacruz</td><td>6556</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16292.06</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon 21-hemibursztynian</td><td>Merck</td><td>H2882</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix511 Jedwab </td><td>Nippi Inc., Tokio, Japonia</td><td>892 021</td><td>Macierz hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Insulina-transferyna-selen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Keratyna 1  mysz</td><td>Santacruz</td><td>376224</td><td></td></tr><tr><td>Keratyna 10  królik</td><td>BioLegend</td><td>19054</td><td></td></tr><tr><td>KMUR001</td><td>Uniwersytet Medyczny Kansai </td><td></td><td>Komórki iPS pochodzące od pacjenta </td></tr><tr><td>Zamiennik serum nokautującego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>2-fosforan L-askorbinowy </td><td>A8960, Merck</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 średni </td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc.</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>Mysia IgG(H+L) AlexaFluo488</td><td>Suplement Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin mysz</td><td>Santacruz</td><td>23927</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament  królik</td><td>Chemicon</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Neutristem</td><td>Sartrius AG, Gö ttingen, Niemcy</td><td>05-100-1A</td><td>pożywka do hodowli komórkowych </td></tr><tr><td>3/4 października  mysz</td><td>BD</td><td>611202</td><td></td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Nacalai Tesque Inc., Kioto, Japonia</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>IgG królika (H+L) AlexaFluo488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG królika (H+L) AlexaFluo546</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana albumina ludzka </td><td>A0237, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho, Y-27632 </td><td>Sellec Inc., Tokio, Japonia</td><td>129830-38-2</td><td></td></tr><tr><td>RIKEN 2F</td><td>RKEN Bioresource Research Center</td><td>HPS0014</td><td>niezróżnicowane hiPSC </td></tr><tr><td>Specyfikacja RPMI 1640 </td><td>Thermo Fisher Scientific #11875</td><td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>301836-41-9</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbinian sodu</td><td>Merck</td><td>A4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4  mysz</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N </td><td>Ajinomoto, Tokio, Japonia</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td> <td>AK02</td> </tr><tr><td>TnT królik</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td></td></tr><tr><td>TRA 1-81 mysz</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Trijodotyronina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H34068.06</td><td></td></tr><tr><td>TripLETM ekspresowy enzym </td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego </td><td>Nacalai Tesque, Kioto, Japonia</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>Rosół z fosforanu tryptozy</td><td>Merck</td><td>T8782-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-C59 </td><td>Bio-techne, NB, Wielka Brytania</td><td>5148</td><td></td></tr><tr><td>β   <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/65672/65672eq01v2.jpg" style="margin: auto; "> Tublin  mysz</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) o nieskończonej zdolności do samoproliferacji mają zastosowanie w wielu dziedzinach, w tym w wyjaśnianiu rzadkich chorób patologicznych, opracowywaniu nowych leków i medycynie regeneracyjnej mającej na celu odbudowę uszkodzonych narządów. Mimo to społeczne wdrażanie hiPSC jest nadal ograniczone. Wynika to częściowo z trudności w odtworzeniu zróżnicowania w kulturze, nawet przy użyciu zaawansowanej wiedzy i wyrafinowanych umiejętności technicznych, ze względu na wysoką wrażliwość iPSC na drobne zmiany środowiskowe. Zastosowanie zautomatyzowanego systemu hodowli może rozwiązać ten problem. Eksperymentów o wysokiej odtwarzalności, niezależnych od umiejętności badacza, można oczekiwać zgodnie z procedurą wspólną dla różnych instytutów. Chociaż wcześniej opracowano kilka zautomatyzowanych systemów hodowli, które mogą utrzymywać kultury iPSC i indukować różnicowanie, systemy te są ciężkie, duże i kosztowne, ponieważ wykorzystują humanizowane, wieloprzegubowe ramiona robotów. Aby rozwiązać powyższe problemy, opracowaliśmy nowy system wykorzystujący prosty system szyn ślizgowych osi x-y-z, dzięki czemu jest on bardziej kompaktowy, lżejszy i tańszy. Ponadto użytkownik może łatwo modyfikować parametry w nowym systemie, aby opracowywać nowe zadania manipulacyjne. Po ustaleniu zadania wszystko, co użytkownik musi zrobić, to przygotować iPSC, wcześniej dostarczyć odczynniki i materiały eksploatacyjne potrzebne do wykonania żądanego zadania, wybrać numer zadania i określić czas. Potwierdziliśmy, że system może utrzymywać iPSC w stanie niezróżnicowanym przez kilka przejść bez komórek zasilających i różnicować się w różne typy komórek, w tym kardiomiocyty, hepatocyty, progenitory nerwowe i keratynocyty. System umożliwi przeprowadzanie wysoce powtarzalnych eksperymentów w różnych instytucjach bez konieczności zatrudniania wykwalifikowanych badaczy i ułatwi społeczne wdrażanie hiPSC w szerszym zakresie dziedzin badawczych poprzez zmniejszenie przeszkód dla nowych uczestników.

Utrzymanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych 
Wykorzystaliśmy trzy linie hPSC (RIKEN-2F, 253G1 oraz KMUR001). Zoptymalizowaliśmy protokół utrzymania poprzez codzienne eksperymenty wykonywane ręcznie, a następnie dodatkowo zoptymalizowaliśmy szczegółowe programy poprzez siedem wstępnych eksperymentów przeprowadzonych przez system. Na przykład naprężenia ścinające wywołane prędkością przepływu cieczy z różnych pipet obsługiwanych przez ludzi i system są bardzo różne; dlatego zoptymalizowaliśmy czas trwania trawienia enzymatycznego oraz liczbę cykli pipetowania w celu dyspersji komórek przez system.
Ludzkie indukowane pluripotencyjne komórki macierzyste utrzymywano na szalkach 10 cm pokrytych macierzą hodowlaną dla komórek w stężeniu 0,5 µg/cm2 w pożywce do hodowli hiPSC (np. Neutristem lub StemFit AK02N). W celu pasażowania system zaprogramowano tak, aby trzykrotnie przemyć hiPSC 5 mL soli fizjologicznej bez wapnia (PBS[-]), a następnie poddać działaniu 3 mL enzymu TrypLE express uzupełnionego o 10 µM inhibitora kinazy Rho (Y-27632) przez 15 min w temperaturze 37 °C. Następnie system dodał do płytki 9 mL PBS(-) z 0,15% albuminy surowiczego bydlęcego frakcji V (BSA) i wykonał dwa cykle ruchów polegające na odessaniu 10 mL cieczy zawierającej komórki i rozprowadzeniu jej z końcówki pipety ruchem zygzakowatym po górnej części płytki, która była nachylona pod kątem 20° w stronę powierzchni płytki; powyższą sekwencję operacji powtórzono z płytką nachyloną pod kątem 20° w przeciwną stronę. Następnie system zebrał pożywkę zawierającą komórki do probówki 15-mL i ją zamknął, po czym odwirowano ją przy 115 x g przez 5 min w celu osadzenia komórek. Po tym system odessał supernatant i rozbił osad komórkowy do pojedynczych komórek, używając 10 mL pożywki hodowlanej z 10 µM Y-27632 poprzez dziesięciokrotne pipetowanie. System przeniósł 1 mL roztworu błękitu trypanu do nowej probówki 15-mL, a następnie dodał 1 mL zawiesiny komórkowej i wymieszał je poprzez pięciokrotne pipetowanie. Po tym odessano 100 µL roztworu komórek barwionych błękitem trypanu i wprowadzono do okienka wlotowego jednorazowego hemocytometru w uchwycie. System przeniósł uchwyt hemocytometru do obszaru obserwacji mikroskopowej i wykonał zdjęcie, które zostało natychmiast przeanalizowane przez oprogramowanie, a uzyskana koncentracja komórek została zastosowana w kolejnym kroku. W celu utrzymania iPSC system wysiał komórki w gęstości 15 000 komórek/cm2 w nowych plastikowych płytkach o średnicy 10 cm pokrytych macierzą hodowlaną dla komórek w stężeniu 0,5 µg/cm2. W eksperymentach różnicowania system wysiał komórki w wymaganej gęstości w pożywce przygotowanej dla każdego typu komórek somatycznych w płytkach 6-dołkowych pokrytych macierzą hodowlaną rozcieńczoną 1/100. Na koniec system wykonał pięciokrotne blokowanie krzyżowe przed przeniesieniem płytek do inkubatora. Do systemu wprowadzono trzy nowe płytki 10-cm zawierające iPSC oraz trzy płytki uprzednio pokryte macierzą hodowlaną, a także przygotowano inne niezbędne elementy zgodnie z opisanymi powyżej procedurami. Jeden cykl hodowli utrzymującej składa się z zadania pasażowania w dniu 1., a następnie codziennej wymiany pożywki hodowlanej przez 3 dni. Przez cały czas trwania eksperymentu ustawiono pięć takich cykli. Dodatkowo na bieżąco uzupełniano materiały eksploatacyjne.
Zgodnie z zaplanowanym harmonogramem, system pomyślnie przeprowadził pięć cykli hodowli podtrzymującej. Na podstawie zdjęć komórek wykonanych automatycznie podczas każdego zadania potwierdzono, że komórki proliferowały stabilnie w czasie. Przyrost komórek (n = 3) obliczono i przedstawiono na Rysunku 2. Aby potwierdzić, czy niezróżnicowany stan iPSC pozostaje niezmienny nawet po hodowli podtrzymującej w automatycznym systemie hodowlanym, przeprowadzono analizę immunocytometryczną (Oct3/4 i SSEA4) z wykorzystaniem pozostałych próbek przy każdym pasażowaniu (Rysunek 3A). Ponadto, po pięciu cyklach, trzy naczynia zostały wyjęte z systemu, a następnie przeprowadzono analizę immunohistochemiczną (Oct3/4, SSEA4 oraz Tra1-81) (Rysunek 3B). Obie analizy z wykorzystaniem fluorescencyjnego barwienia immunologicznego wykazały, że zachowano niezróżnicowany stan komórek iPS. Przed i po hodowli podtrzymującej w automatycznym systemie hodowlanym wykonano również kariotypowanie iPSC. Chociaż przed rozpoczęciem hodowli podtrzymującej zaobserwowano nieprawidłowość w jednym allelu chromosomu 17, po 5 cyklach hodowli w systemie nie stwierdzono żadnych istotnych zmian, w tym w obrębie wspomnianej nieprawidłowości (Rysunek 3C). Ustawienia zastosowane do podtrzymania iPSC zestawiono w Tabeli 1.
Różnicowanie 
Kardiomiocyty 
W niniejszej pracy zastosowano protokół różnicowania z poprzedniej publikacji10. System wysiał nieróżnicowane hiPSC (KMUR001) z gęstością 30 000 komórek/cm2 na 6-dołkowych płytkach powlekanych matrycą do hodowli komórkowej w pożywce do hodowli hiPSC uzupełnionej o 10 µM Y-27632. Po 3 dniach (1. dzień różnicowania) system zmienił pożywkę na pożywkę dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z dodatkiem 6 µM inhibitora GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/mL Aktywiny A oraz 10 ng/mL BMP4. W 3. dniu różnicowania system przeszedł na pożywkę CDM3: RPMI 1640, 500 µg/mL rekombinowanej ludzkiej albuminy oraz 213 µg/mL L-fosforanu askorbiniowego 2 z dodatkiem 2 µM Wnt-C59. W 5. dniu różnicowania system zmienił pożywkę na świeżą CDM3; następnie powtarzano wymianę na świeżą pożywkę CDM3 co drugi dzień. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w kardiomiocyty podsumowano w Tabeli 2.
Hepatocyty 
W niniejszej pracy zastosowano protokół różnicowania z poprzedniej publikacji11. Niedzifferencjowane hiPSC (RIKEN2F) wysiano z gęstością 25 000 komórek/cm2 na płytkach 6-dołkowych powlekonych macierzą do hodowli komórkowej w medium do hodowli hiPSC uzupełnionym o 10 µM Y-27632. Po 2 dniach (dzień różnicowania 1) zmieniono medium na RPMI-1640 z dodatkiem 2% B27 Minus Insulin (RPMI-B27), zawierające 100 ng/mL Activin A, 6 µM CHIR-99021 oraz 1% suplementu glutaminy (np. GlutaMAX) na 24 h. W dniu różnicowania 2 zmieniono medium na RPMI-B27 z 50 ng/mL Activin A. W dniu różnicowania 5 zmieniono medium na RPMI-B27 zawierające 1% suplementu glutaminy i 10 ng/mL BMP-4. W dniu różnicowania 9 zmieniono medium na medium do dojrzewania hepatocytów: medium Leibovitz's L-15 zawierające 8,3% tryptose phosphate broth, 10 µM 21-hemisukcynianu hydrokortyzonu, 50 µg/mL L-askorbinianu sodu, 100 nM deksametazonu, 0,58% insulin-transferrin-selenium, 2 mM suplementu glutaminy, 8,3% płodowej surowicy bydlęcej oraz 100 nM rac-1,2-dihexadecylglycerol. Następnie medium wymieniano na świeże co drugi dzień. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w hepatocyty podsumowano w Tabeli 3.
Komórki prekursorowe neuronów 
Zastosowano protokół różnicowania opisany w poprzedniej publikacji12. Niezróżnicowane hiPSC (RIKEN2F) wysiano z gęstością 25 000 komórek/cm2 na płytkach 6-dołkowych powleczonych macierzą błony podstawnej w pożywce DMEM/F12 i pożywce Neurobasal (1:1) uzupełnionej o 10% Knockout serum replacement, 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy z dodatkiem 10 µM inhibitora receptora TGF-beta (SB431542), 10 µM inhibitora sygnału BMP (dorsomorfina) oraz 10 µM Y-27632 (1. dzień różnicowania). W 5. dniu różnicowania zmieniono pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal 1:1 uzupełnioną o 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 µg/mL 2-fosforanu kwasu askorbinowego, 10 µM SB431542 oraz 10 µM dorsomorfiny. W 9. dniu różnicowania zmieniono pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal 1:1 uzupełnioną o 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 µg/mL 2-fosforanu kwasu askorbinowego oraz 1 µM all-trans kwasu retinowego. Od 13. do 16. dnia różnicowania pożywkę zmieniano codziennie na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal 1:1 uzupełnioną o 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 µg/mL 2-fosforanu kwasu askorbinowego, 10 ng/mL bFGF i 10 ng/mL EGF. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w komórki prekursorowe neuronów podsumowano w Tabeli 4.
Keratynocyty 
Zastosowano protokół różnicowania z poprzedniej publikacji13. System wysiał nieróżnicujące się hiPSC (253G1) w gęstości 15 000 komórek/cm2 w 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą do hodowli komórkowej, w pożywce do hodowli hiPSC z dodatkiem 10 µM Y-27632. Po 2 dniach (1. dzień różnicowania) system zmienił pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal (1:1) z 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM glutaminy, 55 µM 2-merkaptoetanolu, 1% suplementu N-2, 2% suplementu B-27, 50 µg/mL askorbianu 2-fosforanu, 0,05% albuminy surowicy bydlęcej oraz 100 ng/mL FGF-basic. W 3. dniu różnicowania i w kolejnych dniach system co 2 dni zmieniał pożywkę na pożywkę do ludzkich keratynocytów (bez suplementu w 3. dniu i z suplementem od 5. dnia włącznie) z dodatkiem 0,5 µg/mL hydrokortyzonu, 1 µM całkowitego kwasu retinowego, 25 ng/mL hBMP-4, 2,4 µg/mL adeniny, 1,37 ng/mL trijodotyroniny, 0,3 mM askorbianu 2-fosforanu oraz 2 µM forskoliny. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w keratynocyty podsumowano w Tabeli 5.
Jak wspomniano powyżej, cały proces, od wysiewu komórek iPS po kolejne serie protokołów różnicowania, był przeprowadzany wyłącznie przy użyciu zautomatyzowanego sprzętu do hodowli. Oceńiono ekspresję charakterystycznych markerów w każdej komórce (Rysunek 4). Wykazano, że różnicowanie można indukować, stosując jedynie zautomatyzowany system hodowli.
<img alt="Schemat i konfiguracja systemu automatyzacji laboratoryjnej; hodowle komórkowe, narzędzia do pipetowania, komponenty mikroskopu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Podsumowanie zautomatyzowanego systemu hodowli. (A) Zdjęcie systemu przedstawiające rozmiar i schemat układu 1. (B) Zdjęcie stanowiska pracy i schemat układu 2. (C) Narzędzia ręczne: szalka, probówka i pipeta. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando i wsp.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Protokół hodowli komórkowej, wykres ekspansji, mikroskopia dni 1-3 i dzień 0; przegląd procesu, etapy metody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zadanie pasażowania i wzrost komórek. (A) Kwadrat ilustruje każdy proces. (B) Ekspansja iPSC obliczona na podstawie każdego zautomatyzowanego liczenia komórek w trzech niezależnych eksperymentach. (C) Reprezentatywne obrazy zarejestrowane automatycznie z pasażu na pasaż. Paski skali = 400 µm i 100 µm (wstawka). Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando i wsp.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat histogramów cytometrii przepływowej, obrazowania komórek i analizy kariotypu w badaniach nad komórkami macierzystymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zautomatyzowana długoterminowa hodowla iPSC. (A) Wszystkie analizy immunocytometryczne z trzech niezależnych eksperymentów dla Oct-3/4 i SSEA-4. Każdy niebieski histogram oznacza kontrolę bez przeciwciał pierwszorzędowych. Każdy czerwony histogram reprezentuje wskazany sygnał specyficzny dla antygenu. (B) Reprezentatywne obrazy komórek barwionych immunohistochemicznie na Oct-3/4, SSEA-4 i Tra 1-81. Paski skali = 50 µm. (C) Kariotyp RIKEN2F-iPSC po piątym pasażu. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Bando i wsp.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna hepatocytów, kardiomiocytów, komórek prekursorowych neuronów, keratynocytów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65672/65672fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Barwienie immunohistochemiczne. Zdjęcia immunohistochemiczne hepatocytów (Paski skali = 100 µm), kardiomiocytów (Paski skali = 100 µm), komórek progenitorowych neuronów (Paski skali = 100 µm) oraz keratynocytów (Paski skali = 200 µm). Rycina została zmodyfikowana za zgodą Bando et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/65672fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Przygotowanie pasaży i ustawienia systemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%201%20(Passage)%20.xlsx" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Preparaty do różnicowania kardiomiocytów i ustawienia systemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%202%20(cardiomyocytes).xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Preparaty do różnicowania hepatocytów i ustawienia systemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%203%20(hepatocytes).xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Przygotowania do różnicowania prekursorowych komórek neuronalnych i ustawienia systemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%204%20(Neural%20cells).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Preparaty do różnicowania keratynocytów oraz ustawienia systemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65672/Table%205%20(keratinocytes)%20.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Badanie to koncentruje się na automatyzacji hodowli komórek iPS. Naszym celem jest zmniejszenie zmienności spowodowanej ręcznymi eksperymentami i pracą ludzką poprzez wykorzystanie mniejszego i bardziej przystępnego cenowo sprzętu, co prowadzi do zwiększonej odtwarzalności i daje możliwości większej liczbie badaczy, którzy nawet nie są zaznajomieni z komórkami iPS. Pojawiło się kilka rodzajów zautomatyzowanych maszyn do hodowli, ale większość z nich jest nadal duża, kosztowna i może wykonywać tylko częściowe zadania.Prosta konstrukcja ramienia roboczego zmniejszyła rozmiar i koszt sprzętu. Ponadto zadania od konserwacji ogniw po indukcję różnicowania mogą być wykonywane automatycznie, po uprzednim przygotowaniu materiału i ustawieniu zadań w oprogramowaniu. Powtarzanie maszynowe jest niezwykle dokładne w porównaniu z powtarzaniem przez człowieka.Zastosowanie takich maszyn nie tylko poprawia powtarzalność, ale także zmniejsza nakład pracy ludzkiej. Co więcej, jeśli parametry w każdym protokole są wspólne, naukowcy niezaznajomieni z komórkami iPS będą w stanie osiągnąć podobne wyniki jak doświadczeni badacze, co umożliwi im łatwe przystąpienie do badań z wykorzystaniem komórek iPS. Badamy możliwość włączenia systemu oceny obrazu opartego na sztucznej inteligencji, aby zautomatyzować wybór następnego harmonogramu pracy, ustalanie daty i treści pracy na podstawie poznania wyników eksperymentu.Przewidujemy również, że umożliwienie naukowcom dostosowania ich protokołów pracy do ich preferencji i udostępniania ich w Internecie nie tylko zwiększy odtwarzalność wśród badaczy na całym świecie, ale także zachęci do globalnej współpracy badawczej. Aby rozpocząć ładowanie, włącz automatyczny przyrząd do hodowli komórkowej i uruchom oprogramowanie operacyjne. Kliknij przycisk ładowania w oprogramowaniu, a następnie rozpocznij przygotowanie do ładowania.Teraz umieść naczynia w aparacie w określonych pozycjach. Zamknij przednią szybę przesuwną i naciśnij przycisk mechanicznego potwierdzenia bezpieczeństwa. Wybierz rodzaj i ilość potraw w oprogramowaniu.Następnie kliknij zakończenie przygotowania do załadunku, a następnie przycisk rozpoczęcia ładowania. Po załadowaniu potrawy do systemu, zarejestruj notatki dotyczące każdej pojedynczej potrawy w oprogramowaniu. Następnie kliknij rejestrację, aby zakończyć operację ładowania.Aby rozładować naczynia, najpierw kliknij rozładunek. Następnie wybierz naczynia do usunięcia. Następnie naciśnij przycisk rozpoczęcia przygotowania do rozładunku i kliknij początek rozładunku.Gdy urządzenie przeniesie naczynia z inkubatora na stół warsztatowy, kliknij przycisk wyjmowania naczynia. Ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i wyjmij naczynia. Natychmiast zamknij przednią szybę przesuwną i naciśnij przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa, aby zakończyć rozładunek.Aby uzupełnić materiały eksploatacyjne, kliknij przycisk materiałów eksploatacyjnych w oprogramowaniu. W przypadku pipet kliknij przycisk pipety, a następnie przycisk uzupełnienia. Wybierz stojak, który chcesz uzupełnić.Następnie naciśnij start uzupełniania. Ręcznie otwórz okienko wysuwanego stojaka i w razie potrzeby uzupełnij pipety. Następnie zamknij okno i naciśnij mechaniczny przycisk bezpieczeństwa.Kliknij przycisk uzupełnienia zakończonego, a następnie konfigurację uzupełnienia, aby wprowadzić informacje. Następnie kliknij przycisk rejestracji i przycisk uzupełnienia-zakończone, aby zakończyć. Podobnie uzupełnij probówki i media zgodnie z potrzebami.Następnie kliknij przycisk zamykania, aby wyjść z ustawień uzupełniania zapasów. Aby wybrać zadania, kliknij przycisk zadania w oprogramowaniu. Teraz naciśnij przycisk ustawień zadania i wybierz żądane zadanie z listy zadań.Następnie kliknij przycisk następnego kroku. Wprowadź datę i godzinę zadania do wykonania. Następnie kliknij przycisk rejestracji.Teraz wybierz naczynie lub talerz, aby wykonać zadanie. Następnie ponownie kliknij przycisk rejestracji. Potwierdź ponownie wybrane zadanie i naciśnij rejestrację.Następnie kliknij start, aby automatycznie rozpocząć zadanie o określonej godzinie i dniu. Aby anulować zaplanowane zadanie z wyprzedzeniem, kliknij Zatrzymaj. Następnie wybierz zadanie, które ma zostać przerwane.Kliknij edytuj zadanie, a następnie przycisk Anuluj zadanie i potwierdź usunięcie zadania. Aby przeprowadzić pasażowanie i różnicowanie komórek, wybierz żądane ustawienia hodowli zgodnie z żądaną komórką, która ma zostać uzyskana. Zautomatyzowana hodowla komórkowa pozwoliła na płynną proliferację komórek w czasie.Analiza immunocytometryczna wykazała, że indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pozostały niezróżnicowane. Potwierdziły to analizy immunohistochemiczne. Nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości alleli po pięciu hodowlach podtrzymujących.Zaobserwowano, że pluripotencjalne komórki macierzyste ulegają różnicowaniu w kardiomiocyty, hepatocyty, neuronalne komórki prekursorowe i keratynocyty w zautomatyzowanym systemie.

an-automated-culture-system-for-maintaining-differentiating-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół demonstruje sposób hodowli zdrowych, niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Hodowla i utrzymanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Film demonstruje technikę różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w neuronalne komórki progenitorowe (NPC). Początkowo hiPSC są hodowane na warstwie zasilającej mysich fibroblastów embrionalnych (MEF). Następnie komórki są odłączane i przenoszone na płytkę pokrytą biopolimerem, aby umożliwić MEF-y przyleganie do hiPSC i oddzielenie się od nich. Zawieszone hiPSC są następnie przenoszone na płytkę z dnem w kształcie litery V i odwirowywane w celu...

Różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisane protokoły pozwalają laboratoriom na przeprowadzanie skalowalnych, przylegających hodowli komórek macierzystych z dużą wydajnością przy minimalnym nakładzie pracy, doświadczenia i inwestycji w sprzęt przy użyciu programowalnego robota do obsługi cieczy i 96-dołkowych płytek.  iPSC pasażowane ponad 20 razy w tym systemie utrzymywały pluripotencję, prawidłowe kariotypy i różnicowały się w kardiomiocyty.

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Oto protokół do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) i nerwowych komórek macierzystych (NSC) w zamkniętym systemie hodowli komórek, który pozwala na maksymalną sterylność i odtwarzalność, zastępując tradycyjną komorę bezpieczeństwa biologicznego i inkubator. To urządzenie spełnia wytyczne dobrej klinicznej praktyki produkcyjnej (cGMP) i dobrej praktyki klinicznej (cGLP).

Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Ten protokół opisuje półautomatyczne podejście do produkcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki 96-dołkowej. Proces ten jest szybki i opłacalny, co pozwala na produkcję partii komórek podobnych do hepatocytów o gwarantowanej jakości do podstawowych i stosowanych badań na ludziach.

Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Poznaj zautomatyzowany system hodowli komórek iPS, który zmniejsza zmienność i obciążenie pracą. Urządzenie jest kompaktowe, opłacalne i umożliwia utrzymanie oraz różnicowanie komórek macierzystych z wysoką powtarzalnością.

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Przeglądaj więcej filmów