Name: Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę enzymatycznej dysocjacji włókien mięśniowych różnych typów i długości z sześciu mięśni kończyn tylnych myszy. Technika ta umożliwia badania fizjologii mięśni i mechanizmów sprzężenia pobudzenia-skurczu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność profesorowi Robinsonowi Ramírezowi z UdeA za pomoc przy zwierzętach i kilku zdjęciach oraz Carolinie Palacios za wsparcie techniczne. Johan Pineda z firmy Kaika pomógł nam skonfigurować kamery kolorowe i fluorescencyjne. Shyuan Ngo z University of Queensland uprzejmie poprosiła o korektę manuskryptu. Badanie to zostało sfinansowane przez CODI-UdeA (2020-34909 od 22 lutego 2021r. i 2021-40170 od 31 marca 2022r., SIU) oraz Biuro Planowania-UdeA (E01708-K i ES03180101), Medellín, Kolumbia, na rzecz JCC. Grantodawcy nie brali udziału w gromadzeniu i analizie danych, pisaniu lub składaniu manuskryptów.

Enzymatic Isolation and Characterization of Variable Length Mouse Muscle Fibers

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Aby uzupełnić modele dostępne do badania biologii dojrzałych mięśni szkieletowych, tutaj demonstrujemy udaną dysocjację enzymatyczną szeregu mięśni myszy z krótkimi, pośrednimi i długimi włóknami. Włókna te pozwalają na wykazanie uogólnienia kinetyki MT-II stanów nieustalonych Ca2+ w mięśniach szkieletowych. Ponadto sklasyfikowano rodzaje włókien w nienaruszonych, całych mięśniach. Biorąc pod uwagę, że FDB jest najczęściej używanym mięśniem do eksperymentów fizjologicznych, oceniono rodzaje włókien obecnych w ...

Dojrzały mięsień szkieletowy ssaków jest tkanką wielofunkcyjną. Silnie reguluje przemianę materii, jest głównym źródłem produkcji ciepła, a jego właściwości dynamiczne nadają mu kluczową rolę w oddychaniu, ruchu segmentów ciała czy przemieszczaniu się z jednego punktu do drugiego1,2,3. Mięśnie szkieletowe są również istotne dla patofizjologii wielu chorób, w tym chorób dziedzicznych i przewlekłych, takich jak miopaty, dystrofie czy sarkopenia, a także wielu przewlekłych schorzeń niezwiązanych z mięśniami, takich jak choroby kardiometaboliczne3,4,5,6,7,8.
Badanie ex vivo strukturalnych i funkcjonalnych właściwości dojrzałych mięśni szkieletowych w kontekście zdrowia i choroby było możliwe głównie dzięki dwóm eksperymentalnym modelom: całym mięśniom i izolowanym włóknom. W XX wieku naukowcy wykorzystali właściwości całego, nienaruszonego mięśnia prostownika długiego palca długiego (EDL), mięśnia płaszczkowatego, piszczelowego przedniego i mięśnia brzuchatego łydki różnych małych gatunków jako kluczowe modele, aby dowiedzieć się o jednostkach motorycznych, typach włókien i właściwościach dynamicznych, takich jak siła i kinetyka skurczu i relaksacji9,10,11,12,13,14,15,16. Jednak pojawienie się bardziej wyrafinowanych badań biologii komórki przesunęło tę dziedzinę w kierunku badania pojedynczych włókien mięśniowych. Pionierskie prace umożliwiły następnie wyizolowanie nienaruszonych włókien zginacza digitorum brevis (FDB) szczurów poprzez dysocjację enzymatyczną w celu późniejszej charakterystyki17,18,19. Chociaż włókna FDB można również uzyskać przez ręczną sekcję20, łatwość i wysoka przepustowość enzymatycznej dysocjacji mięśni mysich, oprócz ich przydatności do różnych podejść eksperymentalnych, sprawiły, że ten ostatni model był szeroko stosowany w ciągu ostatnich dwóch dekad.
Krótkie włókna FDB nadają się do badań elektrofizjologicznych i innych badań biofizycznych, analiz biochemicznych, metabolicznych i farmakologicznych, eksperymentów z mikroskopią elektronową i fluorescencyjną, transfekcji dla podejść biologii komórki lub jako źródło komórek macierzystych w badaniach miogenezy5,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Jednak używanie wyłącznie włókien FDB w eksperymentach mięśniowych zawęża zakres badań zajmujących się rodzajami włókien i ogranicza ilość materiału biologicznego dostępnego dla niektórych technik metodologicznych lub dla uzyskania większej ilości informacji od jednego zwierzęcia. Ograniczenia te utrudniają wyraźną korelację zjawisk fizjologicznych w komórkach z wcześniejszymi badaniami biochemicznymi i dynamicznymi wykonywanymi w różnych całych mięśniach (np. EDL, płaszczkowaty, peronei).
Pokonując te ograniczenia, niektórym grupom udało się oddzielić dłuższe mięśnie EDL i płaszczkowate24,33,34,35,36,37,38,39,40, otwierając drzwi do dalszego rozszerzenia metody na inne istotne mięśnie. Jednak stosowanie włókien EDL i płaszczkowatych jest nadal rzadkie, prawdopodobnie z powodu braku szczegółów metodologicznych dotyczących otrzymywania ich jako włókien nienaruszonych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy, jak wyizolować włókna o różnej długości i typie z sześciu mięśni: trzy z nich zostały już opisane (FDB, EDL i płaszczkowaty) oraz trzy z nich po raz pierwszy z powodzeniem zdysocjowane (prostownik palucha długiego [EHL], mięsień strzałkowy długi [PL] i mięsień strzałkowy palca czworokątnego [PDQA]). Wyniki niniejszej pracy potwierdzają, że model włókien dysocjowanych enzymatycznie nadaje się do szerokiego zakresu badań i przyszłych korelacji z wcześniej publikowanymi danymi, zwiększając tym samym dostępność modeli do badań dojrzałych mięśni szkieletowych.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty miozyny I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty miozyny II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8421</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty miozyny IIA</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>SC-71</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe. Pochodzi z HB-277 hybridoma Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty miozyny IIB</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Bis-akryloamid</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Merck</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Carlo Erba</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Merck</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ 2</td><td>Worthington</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Consul-Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Błękit brylantowy R 250&nbsp;</td><td>Merck</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>Kwas edetynowy (EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1423291211</tr><tr><td>Glycine</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Thermo Scientific</td><td>6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>Izopentan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4, AM</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>Przygotowany tylko w DMSO. Kwas pluronowy nie jest wymagany i nie powinien być stosowany, aby uniknąć degradacji włókien.</td></tr><tr><td>Aplikacja merkaptoetanolu</td><td></td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Protokimica</td><td>MP10043</td><td></td></tr><tr><td>myszy</td><td>Kilka</td><td></td><td>Kilka W tym manuskrypcie użyliśmy tylko myszy C57BL / 6. Jednak niektóre wstępne wyniki wykazały, że protokół działa dobrze w przypadku szwajcarskich myszy Webster w tym samym wieku i o tej samej wadze.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetano-1,2-diamina (TEMED)</td><td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS)</td><td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna masa tnąca (OCT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1323631209</tr><tr><td>TRIS 0,5 M, pH 6,8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora prosektoryjna</td><td>Wykonane</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>Prowadnice ładowane</td><td>Erie Scientific</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Eksperymentalna komora do kąpieli</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27NE2</td><td>Wąska komora do kąpieli ze stymulacją polową, umieszczona na podgrzewanej platformie PH-6</td></tr><tr><td>Szczypce do drobnych robótek</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>World Precision Instruments</td><td>Vannas Nożyczki 501778</td><td></td></tr><tr><td>szklane pipety Pasteura</td><td>Kilka</td><td></td><td>końcówek</td></tr> <tr><td>polerowanych ogniowoSzklane fiolki z nakrętką</td><td>Kilka</td><td></td> nożyczek o <td>objętości 2-3 ml</td></tr> World <tr><td></td><td>Precision Instruments</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s i Axio 305</td><td>Axio 305, sprzężony ze stereoskopem Stemi 508, służył do wykonywania zdjęć podczas sekcji, natomiast Erc 5s lub Axio 208, sprzężony z mikroskopem Axio Observer A1, służył do wykonywania zdjęć izolowanych włókien i testów immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>1550A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Komora do elektroforezy</td><td>Bio Rad</td><td>Mini-Protean IV</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony sprzężony z fluorescencją</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer A1</td><td>Sprzężony z odpowiednim źródłem światła, filtrami i obiektywami do fluorescencji</td></tr><tr><td>Fotopowielacz</td><td>Rurka Horiba</td><td>R928, Hamamatsu, w fotometrze D104, Horiba</td><td>Sprzężony z bocznym portem mikroskopu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator&nbsp;</td><td>Instrumenty trawiaste&nbsp;</td><td>S6</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNE-22</td><td></td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>808691</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Free oprogramowanie do analiz elektroforetycznych</td><td>University of Kentucky</td><td>GelBandFitter v1.7</td><td>http://www.gelbandfitter.org</td></tr><tr><td>Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu i morfometrii</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ v1.54</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Licencjonowane oprogramowanie do akwizycji i analizy sygnałów Ca2+</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>pCLAMP v10.05</td><td>https://www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>Licencjonowane oprogramowanie do analiz statystycznych i wykresów</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2019</td><td>https://www.originlab.com/</td></tr></tbody></table>

nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji mięśni myszy są użytecznym modelem do eksperymentów fizjologicznych. Jednak większość prac dotyczy krótkich włókien zginacza palca brevis (FDB), co ogranicza zakres wyników dotyczących typów włókien, ogranicza ilość dostępnego materiału biologicznego i utrudnia wyraźny związek między zjawiskami fizjologicznymi komórek a wcześniejszą wiedzą biochemiczną i dynamiczną uzyskaną w innych mięśniach.
Ten artykuł opisuje, jak uzyskać nienaruszone włókna z sześciu mięśni o różnych profilach i długościach włókien. Używając dorosłych myszy C57BL / 6, pokazujemy protokół rozwarstwienia mięśni i izolacji włókien oraz wykazujemy przydatność włókien do badań przejściowych Ca2 + i ich charakterystykę morfometryczną. Przedstawiono również skład rodzaju włókien w mięśniach. Po dysocjacji wszystkie mięśnie stały się nienaruszone, żywe włókna, które kurczą się energicznie przez ponad 24 godziny. FDB dało krótkie (<1 mm), mięsień strzałkowy długi (PDQA) i mięsień strzałkowy długi (PL) dały pośrednie (1-3 mm), podczas gdy mięśnie prostownika długiego palca (EDL), prostownika palucha długiego (EHL), a mięśnie płaszczkowate uwolniły długie (3-6 mm) włókna.
Podczas rejestrowania za pomocą szybkiego barwnika Mag-Fluo-4, stany przejściowe Ca2+ włókien PDQA, PL i EHL wykazywały szybką, wąską kinetykę przypominającą morfologię typu II (MT-II), o której wiadomo, że odpowiada włóknom typu IIX i IIB. Jest to zgodne z faktem, że mięśnie te mają ponad 90% włókien typu II w porównaniu z FDB (~80%) i płaszczkowatym (~65%). Wychodząc poza FDB, po raz pierwszy pokazujemy dysocjację kilku mięśni, które tworzą włókna o długości od 1 do 6 mm. Włókna te są żywotne i dają szybkie stany przejściowe Ca2+, co wskazuje, że MT-II można uogólnić na szybkie włókna IIX i IIB, niezależnie od ich źródła mięśniowego. Wyniki te zwiększają dostępność modeli do badań dojrzałych mięśni szkieletowych.

Sarkoplazmatyczny Ca2+ stężenie podczas pojedynczego skurczu 
Aby wykazać możliwość przeprowadzania eksperymentów fizjologicznych na zestawie dysocjowanych włókien oraz rozszerzyć nasze wcześniejsze odkrycia dotyczące sprzężenia wzbudzenie-skurcz (ECC) i typów włókien, Ca2+ rejestrowano przejściowe zmiany w włóknach ze wszystkich mięśni. W pierwszej kolejności w FDB (n = 5) i EDL (n = 7) wykazano Ca2+ kinetyka znana jako morfologia typu II (MT-II). Są to szybkie, szpik...

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

W tym badaniu opisujemy metodę izolowania włókien o różnej długości i typie z sześciu mięśni kończyn tylnych myszy. Przetestowaliśmy również przydatność włókien do eksperymentów fizjologicznych zajmujących się badaniem mechanizmu sprzężenia skurczu wzbudzenia i skurczu. Przez lata uzyskanie długich włókien mięśniowych było wyzwaniem, ograniczającym zakres wielu badań w tej dziedzinie.Teraz pokazujemy, że możliwe jest uzyskanie chudych włókien za pomocą mysich zginaczy, prostowników i o długości do sześciu milimetrów. Na przykład uzyskanie włókien z sześciu różnych mięśni pozwoliło nam wykazać, że przejściowa kinetyka wapnia, znana jako morfologia typu drugiego, może być uogólniona na typ 2B i 2X, niezależnie od lokalizacji lub funkcji źródła mięśniowego. Uważamy, że model włókien izolowanych enzymatycznie nadaje się do różnych podejść eksperymentalnych z różnymi typami technologii, które pozwalają nam odpowiedzieć na pytania mechanistyczne w zakresie biochemii, fizjologii, biofizyki, biologii komórki i biologii molekularnej.Po poświęceniu myszy należy położyć ją na piankowej powierzchni i zabezpieczyć przednie kończyny taśmą lub szpilkami. Użyj nożyczek operacyjnych, aby przeciąć obie tylne kończyny nad kolanami. Przenieś każdą tylną kończynę do oddzielnej komory rozwarstwiania i dodaj zimny roztwór Tyrode'a, aby pokryć tkankę.Przypnij pierwszą tylną kończynę do komory sekcyjnej, upewniając się, że tylna powierzchnia nóg jest widoczna w powiększeniu. Usuń skórę. Następnie odsłoń i wytnij mięsień zginacza palca krótkiego lub FDB.Przechowuj mięsień FDB w oznakowanym szklanym pojemniku zawierającym jeden mililitr roztworu Tyrode'a za pomocą cienkich nożyczek. Oddziel mięsień brzuchaty łydki, a następnie wytnij mięsień płaszczkowaty. Usuń skórę z przedniej części nogi.Następnie zidentyfikuj dystalne ścięgna kości piszczelowej przedniej i prostownika długiego palca lub mięśni EDL w okolicy kostki. Usuń i wyrzuć piszczel. Następnie przetnij dystalne ścięgna EDL i kontynuuj rozwarstwienie, aby całkowicie usunąć mięsień EDL.Po zidentyfikowaniu mięśnia prostownika palucha długiego lub mięśnia EHL rozpocznij sekcję wzdłuż ścięgna do pierwszego palca. Następnie zidentyfikuj i podążaj za najbardziej zewnętrznym ścięgnem krocza, aby je przeciąć i usunąć mięsień strzałkowy długi lub PL. Zidentyfikuj i prześledź ścięgno do czwartej cyfry.Następnie wytnij i usuń mięsień strzałkowy palcowy lub mięsień PDQA Po wypreparowaniu drugiej tylnej kończyny zbierz mięśnie tego samego typu w oznaczonym szklanym podłości zawierającym roztwór Tyrode'a. Wmień roztwór Tyrode'a w komorze rozbiorowej, aby usunąć zanieczyszczenia i sierść myszy. Wlej mięśnie PL do komory rozwarstwienia i sprawdź ich integralność i skurcz.Wykonuj podłużne lub ukośne nacięcia na mięśniu sous wzdłuż środkowego ścięgna, przecinając około 80% jego długości. W przypadku mięśnia EDL podążaj za jednym lub dwoma ścięgnami i przetnij mniej więcej tę samą długość co mięsień płaszczkowaty. Przenieś każdą parę mięśni do nowego szklanego welonu zawierającego trzy miligramy kolagenazy typu drugiego w roztworze dysocjacyjnym i inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 65 do 90 minut, delikatnie potrząsając.Po 65 minutach inkubacji sprawdzaj ohe pod stereoskopem co pięć minut. Gdy mięsień wydaje się pofałdowany i luźny, a włókna zaczynają się odłączać, przepłucz mięśnie Tyrode'em w temperaturze pokojowej, aby dezaktywować i usunąć kolagenazę. Używając zestawu wypolerowanych na ogniowo pipet Pasteura, wymieszaj roztwór wokół mięśnia za pomocą pięciomilimetrowej pipety z końcówką.Następnie delikatnie wciągnij i wysuń mięśnie z końcówki trzy do czterech razy, gdy mięsień zacznie uwalniać włókna i stanie się cieńszy. Za pomocą czteromilimetrowej końcówki powtórz procedurę, aby oddzielić więcej włókien. Na początek zamontuj szkiełko z czystego szkła w eksperymentalnej komorze kąpielowej.Pokryj szkiełko dwoma do trzech mikrolitrów lamininy i pozostaw do wyschnięcia na 30 sekund. Następnie wlej około 400 mikrolitrów zawiesiny włókien mięśniowych na szkiełko i pozwól włóknom przylegać do lamininy przez 10 do 15 minut. Umieść komorę doświadczalną na stoliku odwróconego mikroskopu wyposażonego w epifluorescencję, aby sprawdzić żywotność włókien.Umieść dwie platynowe elektrody po obu stronach komory eksperymentalnej, po zastosowaniu prostokątnych impulsów prądu przez 0,8 do 1,2 milisekundy, obserwuj skurcze włókien mięśniowych w skrajnościach. Załaduj włókna 3,5 do 4,5 mikro molowców szybkiego przepływu wapnia di-mag 4 rano przez cztery do pięciu minut w roztworze Tyrode'a. Po umyciu szkiełka roztworem Tyrode'a, pozwól barwnikowi wewnątrzkomórkowemu na deestryfikację przez 15 do 20 minut w ciemności.Podczas pozyskiwania przejściowego wapnia. Przy przyciemnionym oświetleniu zbieraj i zapisuj sygnały świetlne za pomocą obiektywu z zanurzeniem w oleju 40 x i rurki powielacza fotograficznego podłączonej do digitizera. W oprogramowaniu akwizycyjnym zapewnij skalę od zera do 200 dowolnych jednostek.Następnie dostosuj rozmiar punktu wzbudzenia i wzmocnienie rurki powielacza fotograficznego, aby ustawić spoczynkową fluorescencję lub spoczynek F na 10 dowolnych jednostek. Aby przeanalizować nagrania, ustaw filtr dolnoprzepustowy na cały ślad przy jednym kilohercu. Następnie dostosuj pik, aby obliczyć spoczynek F w jednej sekundzie śladu.Ustaw próg do zera i zmierz szczytową amplitudę sarkoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia. Zmierz czas narastania od 10% do 90% amplitudy, czas trwania przy połowie maksimum i czas zaniku od 90% do 10% amplitudy. Następnie oszacuj kinetykę rozpadu zgodnie z pasowaniem.Z funkcją dwuwykładniczą, Oblicz szczytowe stężenie wapnia w mikromolach. Na koniec zapisz wartości stałych czasowych rozpadu tau jeden i tau dwa oraz amplitud A jeden i A dwa. Mięśnie FDB i EDL wykazywały kinetykę wapnia znaną jako morfologia typu drugiego.Mięśnie płaszczkowate wykazywały morfologię typu pierwszego stanów nieustalonych wapnia Włókna z mięśni PDQA, PL i EHL dzieliły morfologię typu drugiego. Przejściowe sygnały kinetyczne PDQA, PL i EHL były podobne do sygnałów mięśni FDBEDL, ale różniły się od sygnałów mięśni płaszczkowatych.

intact-short-intermediate-long-skeletal-muscle-fibers-obtained

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Ten film pokazuje izolację pojedynczych włókien mięśniowych z pobranego mięśnia myszy Extensor Digitorum Longus (EDL). Wyizolowane włókna mięśniowe można hodować w celu zbadania aktywności komórek macierzystych mięśni związanych z włóknami mięśniowymi.

Izolacja włókien mięśniowych: technika uzyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych z zebranego mięśnia prostownika myszy Digitorum Longus (EDL)

Przedstawiamy szczegółowe protokoły przeprowadzania eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej pod małym kątem przy użyciu nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy. Dzięki szerokiej dostępności transgenicznych modeli myszy w chorobach ludzkich, ta eksperymentalna platforma może stanowić użyteczne stanowisko testowe do wyjaśnienia strukturalnych podstaw genetycznych chorób...

Dyfrakcja rentgenowska nienaruszonych mięśni szkieletowych myszy jako narzędzie do badania strukturalnych podstaw choroby mięśni

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Funkcja mięśni szkieletowych może być oceniana poprzez ilościowe określenie kurczliwości izolowanych włókien mięśniowych, tradycyjnie przy użyciu pracochłonnych, niskoprzepustowych metod. W tym miejscu opisujemy opartą na optyce, wysokoprzepustową metodę ilościowego określania kurczliwości włókien mięśniowych osadzonych w hydrożelu. Podejście to ma zastosowanie w badaniach przesiewowych leków i opracowywaniu terapii.

Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

Ten protokół ma na celu izolację i oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) z tkanek mięśni gryzoni poprzez mechaniczne oderwanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Świadczy o spójności i niezawodności. Wyizolowane SkM-EV dostarczają informacji na temat homeostazy i chorób mięśni, z potencjalnymi zastosowaniami jako biomarkery diagnostyczne lub nośniki terapeutyczne.

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Poznaj metodę enzymatycznej dysocjacji włókien mięśniowych różnych typów i długości z sześciu mięśni kończyn tylnych myszy. Technika ta umożliwia badania fizjologii mięśni i mechanizmów sprzężenia pobudzenia-skurczu.

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis (Wideo) | JoVE Journal

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Przeglądaj więcej filmów