Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

W tym badaniu opisujemy metodę izolowania włókien o różnej długości i typie z sześciu mięśni kończyn tylnych myszy. Przetestowaliśmy również przydatność włókien do eksperymentów fizjologicznych zajmujących się badaniem mechanizmu sprzężenia skurczu wzbudzenia i skurczu. Przez lata uzyskanie długich włókien mięśniowych było wyzwaniem, ograniczającym zakres wielu badań w tej dziedzinie.

Teraz pokazujemy, że możliwe jest uzyskanie chudych włókien za pomocą mysich zginaczy, prostowników i o długości do sześciu milimetrów. Na przykład uzyskanie włókien z sześciu różnych mięśni pozwoliło nam wykazać, że przejściowa kinetyka wapnia, znana jako morfologia typu drugiego, może być uogólniona na typ 2B i 2X, niezależnie od lokalizacji lub funkcji źródła mięśniowego. Uważamy, że model włókien izolowanych enzymatycznie nadaje się do różnych podejść eksperymentalnych z różnymi typami technologii, które pozwalają nam odpowiedzieć na pytania mechanistyczne w zakresie biochemii, fizjologii, biofizyki, biologii komórki i biologii molekularnej.

Po poświęceniu myszy należy położyć ją na piankowej powierzchni i zabezpieczyć przednie kończyny taśmą lub szpilkami. Użyj nożyczek operacyjnych, aby przeciąć obie tylne kończyny nad kolanami. Przenieś każdą tylną kończynę do oddzielnej komory rozwarstwiania i dodaj zimny roztwór Tyrode'a, aby pokryć tkankę.

Przypnij pierwszą tylną kończynę do komory sekcyjnej, upewniając się, że tylna powierzchnia nóg jest widoczna w powiększeniu. Usuń skórę. Następnie odsłoń i wytnij mięsień zginacza palca krótkiego lub FDB.

Przechowuj mięsień FDB w oznakowanym szklanym pojemniku zawierającym jeden mililitr roztworu Tyrode'a za pomocą cienkich nożyczek. Oddziel mięsień brzuchaty łydki, a następnie wytnij mięsień płaszczkowaty. Usuń skórę z przedniej części nogi.

Następnie zidentyfikuj dystalne ścięgna kości piszczelowej przedniej i prostownika długiego palca lub mięśni EDL w okolicy kostki. Usuń i wyrzuć piszczel. Następnie przetnij dystalne ścięgna EDL i kontynuuj rozwarstwienie, aby całkowicie usunąć mięsień EDL.

Po zidentyfikowaniu mięśnia prostownika palucha długiego lub mięśnia EHL rozpocznij sekcję wzdłuż ścięgna do pierwszego palca. Następnie zidentyfikuj i podążaj za najbardziej zewnętrznym ścięgnem krocza, aby je przeciąć i usunąć mięsień strzałkowy długi lub PL. Zidentyfikuj i prześledź ścięgno do czwartej cyfry.

Następnie wytnij i usuń mięsień strzałkowy palcowy lub mięsień PDQA Po wypreparowaniu drugiej tylnej kończyny zbierz mięśnie tego samego typu w oznaczonym szklanym podłości zawierającym roztwór Tyrode'a. Wmień roztwór Tyrode'a w komorze rozbiorowej, aby usunąć zanieczyszczenia i sierść myszy. Wlej mięśnie PL do komory rozwarstwienia i sprawdź ich integralność i skurcz.

Wykonuj podłużne lub ukośne nacięcia na mięśniu sous wzdłuż środkowego ścięgna, przecinając około 80% jego długości. W przypadku mięśnia EDL podążaj za jednym lub dwoma ścięgnami i przetnij mniej więcej tę samą długość co mięsień płaszczkowaty. Przenieś każdą parę mięśni do nowego szklanego welonu zawierającego trzy miligramy kolagenazy typu drugiego w roztworze dysocjacyjnym i inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 65 do 90 minut, delikatnie potrząsając.

Po 65 minutach inkubacji sprawdzaj ohe pod stereoskopem co pięć minut. Gdy mięsień wydaje się pofałdowany i luźny, a włókna zaczynają się odłączać, przepłucz mięśnie Tyrode'em w temperaturze pokojowej, aby dezaktywować i usunąć kolagenazę. Używając zestawu wypolerowanych na ogniowo pipet Pasteura, wymieszaj roztwór wokół mięśnia za pomocą pięciomilimetrowej pipety z końcówką.

Następnie delikatnie wciągnij i wysuń mięśnie z końcówki trzy do czterech razy, gdy mięsień zacznie uwalniać włókna i stanie się cieńszy. Za pomocą czteromilimetrowej końcówki powtórz procedurę, aby oddzielić więcej włókien. Na początek zamontuj szkiełko z czystego szkła w eksperymentalnej komorze kąpielowej.

Pokryj szkiełko dwoma do trzech mikrolitrów lamininy i pozostaw do wyschnięcia na 30 sekund. Następnie wlej około 400 mikrolitrów zawiesiny włókien mięśniowych na szkiełko i pozwól włóknom przylegać do lamininy przez 10 do 15 minut. Umieść komorę doświadczalną na stoliku odwróconego mikroskopu wyposażonego w epifluorescencję, aby sprawdzić żywotność włókien.

Umieść dwie platynowe elektrody po obu stronach komory eksperymentalnej, po zastosowaniu prostokątnych impulsów prądu przez 0,8 do 1,2 milisekundy, obserwuj skurcze włókien mięśniowych w skrajnościach. Załaduj włókna 3,5 do 4,5 mikro molowców szybkiego przepływu wapnia di-mag 4 rano przez cztery do pięciu minut w roztworze Tyrode'a. Po umyciu szkiełka roztworem Tyrode'a, pozwól barwnikowi wewnątrzkomórkowemu na deestryfikację przez 15 do 20 minut w ciemności.

Podczas pozyskiwania przejściowego wapnia. Przy przyciemnionym oświetleniu zbieraj i zapisuj sygnały świetlne za pomocą obiektywu z zanurzeniem w oleju 40 x i rurki powielacza fotograficznego podłączonej do digitizera. W oprogramowaniu akwizycyjnym zapewnij skalę od zera do 200 dowolnych jednostek.

Następnie dostosuj rozmiar punktu wzbudzenia i wzmocnienie rurki powielacza fotograficznego, aby ustawić spoczynkową fluorescencję lub spoczynek F na 10 dowolnych jednostek. Aby przeanalizować nagrania, ustaw filtr dolnoprzepustowy na cały ślad przy jednym kilohercu. Następnie dostosuj pik, aby obliczyć spoczynek F w jednej sekundzie śladu.

Ustaw próg do zera i zmierz szczytową amplitudę sarkoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia. Zmierz czas narastania od 10% do 90% amplitudy, czas trwania przy połowie maksimum i czas zaniku od 90% do 10% amplitudy. Następnie oszacuj kinetykę rozpadu zgodnie z pasowaniem.

Z funkcją dwuwykładniczą, Oblicz szczytowe stężenie wapnia w mikromolach. Na koniec zapisz wartości stałych czasowych rozpadu tau jeden i tau dwa oraz amplitud A jeden i A dwa. Mięśnie FDB i EDL wykazywały kinetykę wapnia znaną jako morfologia typu drugiego.

Mięśnie płaszczkowate wykazywały morfologię typu pierwszego stanów nieustalonych wapnia Włókna z mięśni PDQA, PL i EHL dzieliły morfologię typu drugiego. Przejściowe sygnały kinetyczne PDQA, PL i EHL były podobne do sygnałów mięśni FDBEDL, ale różniły się od sygnałów mięśni płaszczkowatych.