In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne
1 marca 2024
Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.
Nasze badania koncentrują się na neuronach i obwodach układu somatosensorycznego zaangażowanych w opowiadanie o przeciwbólowym wpływie akupunktury na ból trzewny, próbując jednocześnie dostosować odpowiedzi neuronów neuro DRG na bodźce akupunkturowe. Tradycyjne metody, takie jak zapis elektroniczny, nie są w stanie skutecznie zbadać wystarczającej liczby komórek i wyraźnych specyficznych powiązań komórkowych, aby zidentyfikować neurony instynktowne lub somatyczne reagujące in vivo. Badanie funkcjonalnej roli neuronu DRG w przeciwbólowym działaniu akupunktury było trudne ze względu na ograniczenia technologiczne.
Wprowadziliśmy ogólne podejście do obserwacji odpowiedzialności neuronu DRG numer sześć za symulację wewnątrzokrężnicy i akupunktury in vivo. Protokół określa procedury obserwacji aktywności neuronów DRG in vivo w odpowiedzi na dane somatyczne i trzewne. Jest to poprawa w stosunku do poprzedniego badania, które koncentrowało się tylko na badaniu odpowiedzi neuronów w L5 DRG pod wpływem bodźców somatycznych.
W przyszłości, przy odpowiedniej konfiguracji, obrazowanie CAS in vivo DRG będzie można wykonywać w odcinkach klatki piersiowej lub szyjki macicy, zapewniając potężniejsze narzędzie do badania efektów nocycepcji trzewnej i akupunktury. Ta metoda jest niezbędna do nauczenia się przez badaczy akupunktury. Aby rozpocząć, umieść mysz po tracheostomii w pozycji leżącej na poduszce grzewczej.
Wykonaj siedmiocentymetrowe nacięcie linii środkowej w dolnej części pleców i przedłuż je od piątego odcinka lędźwiowego do pierwszych kręgów krzyżowych. Następnie ostrożnie odsuń na bok mięśnie najdłuższe lędźwi, aby odsłonić wyrostki kolczyste trzech kręgów. Poruszaj wewnętrznymi częściami obustronnego mięśnia najdłuższego odcinka lędźwiowego, grzbietowych mięśni lędźwiowych kręgosłupa i grzbietowych mięśni półkręgosłupa lędźwiowego, aby odsłonić kolejne trzy wyrostki stawowe i sutkowe z segmentem rejestrującym pośrodku kręgów.
Teraz bezpiecznie unieruchom zwierzę za pomocą kleszczy zębowych na obustronnych wyrostkach stawowych sąsiednich kręgów. Użyj kleszczy rongeur, aby usunąć lewy lub prawy wyrostek stawowy i sutkowy czterech lub sześciu kręgów lędźwiowych. Ostrożnie odsłoń lewą lub prawą część lędźwiową sześć DRG po oczyszczeniu tkanek łącznych nad nią.
Upewnij się, że epineurium pozostaje nienaruszone po wybranej stronie sześciu kręgów lędźwiowych. Przykryj odsłonięte obszary DRG małymi wacikami nasączonymi solą fizjologiczną, aby utrzymać aktywny stan. Teraz podłącz system dostarczania znieczulenia o niskim przepływie do kaniuli tchawicy, aby zaintubować myszy.
Umieść zwierzę z odsłoniętym DRG na poduszce grzewczej umieszczonej na stoliku z dostosowanym zaciskiem kręgosłupa. Za pomocą dwóch zacisków na kręgosłupach sąsiednich kręgów zabezpiecz zwierzę, aby zminimalizować ruch podczas badania. Następnie wymień waciki nasączone solą fizjologiczną, aż obszar operacyjny będzie odpowiednio czysty.
Włóż niestandardowy zacisk kręgosłupa do specjalnie zaprojektowanego stolika mikroskopu. W celu obrazowania umieść soczewkę obiektywu powietrznego o dużej odległości roboczej z mikroskopu konfokalnego na naświetlonym DRG. Uchwyć poklatkowane stosy Z nienaruszonego odcinka lędźwiowego czterech lub sześciu DRG z rozdzielczością 25 mikrometrów na krok i rozdzielczością 512 na 512 lub 1 024 na 1 024 pikseli.
Wykonaj skanowanie XYZT DRG z czterema do ośmiu stosów, obejmującymi od jednego do trzech stanów wyjściowych, dwa do trzech bodźców akupunkturowych lub trzewnego rozdęcia jelita grubego oraz jeden do dwóch stanów po bodźcach. Następnie zastosuj bodźce szczotkowania lub szczypania do dolnej części pleców, tylnej kończyny lub tylnej łapy zwierzęcia, aby ocenić najbardziej wrażliwe pole recepcyjne obrazowanych neuronów DRG. Podawaj bodźce akupunkturowe ręcznie lub za pomocą dostępnego na rynku stymulatora akupunkturowego i nerwowego.
Zastosuj wzdęcie jelita grubego za pomocą samodzielnie wykonanego manometru powietrza, aby wywołać bodźce trzewne. Za pomocą mikroskopu konfokalnego zmierz wzrost zielonej fluorescencji neuronalnego GCaMP po związaniu się z wewnątrzkomórkowym wapniem po bodźcach somatycznych lub trzewnych. Za pomocą oprogramowania do obrazowania rozjaśnij wideo, korzystając z opcji koloru.
Ręcznie nakreśl widoczne komórki i ustal ich rozmiar oraz względną intensywność fluorescencji. Wyraż intensywność fluorescencji jako stosunek wzrostu maksymalnej fluorescencji wywołanej do poziomu podstawowego. Sześć neuronów DRG w odcinku lędźwiowym na ogół nie ma wyjściowej fluorescencji GFP, na co prawdopodobnie wpływa poziom ekspresji GCaMP i uszkodzenia chirurgiczne.
Bodźce rozdęcia jelita grubego indukowały szybki, przejściowy wzrost fluorescencji GCaMP. Podobne reakcje zaobserwowano przy zastosowaniu elektroakupunktury BL25. Mapy cieplne i wykresy liniowe pokazały reakcje wszystkich zakreślonych neuronów na rozdęcie jelita grubego i elektroakupunkturę BL25.
Histogram pokazuje średnice neuronów reagujących na rozdęcie jelita grubego i elektroakupunkturę BL25.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół obrazowania wapnia in vivo w celu oceny odpowiedzi neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) odcinka lędźwiowego L6 na bodźce somatyczne i trzewne. Metoda ta umożliwia analizę porównawczą odpowiedzi neuronalnych na różne bodźce, co pogłębia zrozumienie mechanizmów bólu trzewnego oraz efektów interwencji somatycznych, takich jak akupunktura.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad bólem
- Neuroobrazowanie
Wstęp
- Tradycyjne metody rejestracji elektrofizjologicznej są niewystarczające do badania odpowiedniej liczby komórek in vivo.
- Badanie odnosi się do problemów związanych z obserwacją funkcjonalnych ról neuronów DRG w kontekście bólu trzewnego.
- Zastosowane podejście stanowi udoskonalenie wcześniejszych technik, które koncentrowały się głównie na neuronach L5 DRG.
- Postęp technologiczny umożliwia szczegółową obserwację odpowiedzi na acetylocholinę w związku z akupunkturą i bodźcami trzewnymi.
Cel badania
- Zbadanie reaktywności neuronów zzęsła korzeniowego tylnego (DRG) odcinka lędźwiowego L6 na bodźce somatyczne i trzewne.
- Wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw efektów przeciwbólowych akupunktury.
- Opracowanie wiarygodnego protokołu obrazowania aktywności neuronów DRG in vivo.
Zastosowane metody
- Obrazowanie wapnia w preparatach in vivo, a konkretnie w neuronach zwojów korzeni grzbietowych (DRG) odcinka lędźwiowego L6.
- Model obejmuje myszy po tracheostomii, u których przeprowadzono chirurgiczne odsłonięcie lędźwiowych zwojów DRG.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym rejestruje odpowiedzi neuronalne na bodźce somatyczne i trzewne.
- Procedury obejmują rozmieszczenie elektrod, metody stymulacji oraz techniki obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.
- Obrazowanie timelapse rejestruje odpowiedzi sygnalizacji wapniowej na różne bodźce.
Główne wyniki
- Rozciągnięcie jelita grubego oraz elektroakupunktura doprowadziły do gwałtownego wzrostu fluorescencji GCaMP, co wskazuje na aktywację neuronów.
- Reakcje oceniono ilościowo za pomocą natężenia fluorescencji, co dostarczyło istotnych informacji na temat zmian pobudliwości neuronów.
- Mapy ciepła wykazały zróżnicowane odpowiedzi neuronów na bodźce somatyczne w porównaniu do trzewnych.
- Otrzymane wyniki dostarczają wiedzy na temat dynamiki komórkowej zaangażowanej w nocycepcję trzewną.
Wnioski
- Niniejsze badanie potwierdza użyteczność protokołu w badaniu odpowiedzi neuronalnych na akupunkturę oraz bodźce bólowe z narządów wewnętrznych.
- Zastosowana metoda obrazowania stanowi potężne narzędzie dla przyszłych badań nad mechanizmami bólu i akupunktury.
- Wyniki te pogłębiają zrozumienie sygnalizacji nocyceptywnej, co może wpłynąć na strategie terapeutyczne w leczeniu bólu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie wapnia in vivo w neuronach zwojów korzeni grzbietowych (DRG) umożliwia bezpośrednią, ilościową ocenę odpowiedzi zespołów neuronalnych na bodźce somatyczne i trzewne w nienaruszonych modelach zwierzęcych. Podejście to usprawnia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad szlakami bólowymi i zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów dla sygnalizacji sensorycznej i nocyceptywnej. Metoda ta jest strategicznie ukierunkowana na wsparcie wczesnego etapu odkryć oraz badań translacyjnych nad mechanizmami modulacji i interwencji w ból.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie aktywacji neuronów sensorycznych w odpowiedzi na określone bodźce somatyczne i trzewne.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie populacji neuronalnych specyficznych dla danej modalności.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w badaniach nad bólem i szlakami sensorycznymi.
- Dostarcza danych ilościowych pozwalających na określenie stopnia pewności predykcyjnej w wyborze celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy neuronalne do późniejszych badań przesiewowych farmakologicznych lub genetycznych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty fluorescencji w celu standaryzacji analizy.
- Umożliwia porównawczą ocenę wpływu związków lub interwencji na aktywność neuronalną.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w testach neuronów sensorycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia profile odpowiedzi neuronalnych z modelami bólu i interwencjami istotnymi dla danej jednostki chorobowej.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną walidację strategii przeciwbólowych.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju programów modulacji bólu i czucia w oparciu o analizę ryzyka.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy segmentowych i specyficznych dla modalności szlaków bólowych.
Integracja potoków i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania integruje się z kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z translacyjnymi badaniami nad bólem.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określenie aktywacji neuronalnej w celu wyjaśnienia mechanizmów szlaków sensorycznych i ograniczenia ryzyka hipotez dotyczących punktów uchwytu.
- Przesiew: Potwierdzenie gotowości testu dzięki powtarzalnym, ilościowym wynikom obrazowania wapnia.
- Analityka: Zapewnienie pomiarów intensywności fluorescencji i map ciepła w celu rzetelnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Powiązanie danych z zespołów neuronalnych z modelami bólu i interwencji istotnymi dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Udostępnienie wielokrotnego wykorzystania platformy obrazowania, którą można dostosować do różnych segmentów rdzenia kręgowego i rodzajów bodźców.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad szlakami bólowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar aktywności neuronalnej i wspiera powtarzalność badań.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową we wczesnych etapach badań nad bólem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów sensorycznych i przeciwbólowych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgicznego odsłaniania oraz obrazowania in vivo neuronów DRG.
- Wymaga dostępu do mikroskopii konfokalnej oraz specjalistycznego oprogramowania do obrazowania.
- Niezbędna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów stymulacji i analizy danych.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych segmentów rdzenia kręgowego i rodzajów stymulacji poprzez modyfikacje protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują złożoność techniczną oraz konieczność posiadania infrastruktury dla modeli zwierzęcych.
