Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Aparaty szparkowe roślin odgrywają kluczową rolę w adaptacji do warunków stresowych, dlatego musimy zmierzyć otwór stomii, aby zrozumieć, jak rośliny reagują na stres biotyczny i antybiotykowy. Jednak pomiar apertury szparkowej jest czasochłonny i kłopotliwy. Aby zmierzyć otwór szparkowy, wyczuwamy naskórek i obserwujemy aparaty szparkowe pod mikroskopem.

Następnie ręcznie mierzymy otwór szparkowy, co zajmuje dużo czasu, mimo że jesteśmy doświadczonymi badaczami. Zmierzyliśmy się z tymi barierami i opracowaliśmy narzędzie oraz technikę, które mogą automatycznie mierzyć otwór szparkowy w nienaruszonych liściach rzodkiewnika. Dlatego jesteśmy głęboko przekonani, że opracowane przez nas urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych i algorytm głębokiego uczenia ułatwią funkcjonalną analizę reakcji aparatów szparkowych na różne stresy biotyczne i abiotyczne, ponieważ te postępy techniczne znacznie skracają czas i pracę ludzką wymaganą do pomiaru apertury aparatów szparkowych.

Na początek posadź nasiona Arabidopsis thaliana w glebie. Hoduj je w komorze z białym światłem fluorescencyjnym. Następnie zaszczepij pojedynczą kolonię Pseudomonas syringae pv.

pomidor DC3000 w pięciu mililitrach płynnego podłoża King's B. Inkubuj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 200 obrotów na minutę, aż kultura osiągnie późną logarytmiczną fazę wzrostu. Odwirować kulturę przy 6 000 g przez dwie minuty.

Następnie ponownie zawieś pastylkę bakteryjną w jednym mililitrze sterylnej wody. Następnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu otwierającego aparaty szparkowe. Zmierz gęstość optyczną zawiesiny przy 600 nanometrach.

Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do gęstości optycznej 0,2 buforem otwierającym aparaty szparkowe zawierającym 0,4% silikonowego środka powierzchniowo czynnego. Aby zaszczepić zawiesinę bakteryjną, najpierw umieść rośliny Arabidopsis thaliana na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką pod światłem na co najmniej trzy godziny. Zdejmij pokrywę.

Następnie za pomocą aerografu spryskaj spód liści zawiesiną bakteryjną. Po zaszczepieniu inkubuj rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką, aby utrzymać wilgotność względną około 85%Aby rozpocząć, podłącz przenośne urządzenie do obrazowania szparkowego do komputera wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazu. Użyj kawałka papieru, aby ostrożnie usunąć kropelki wody z zaszczepionych Pseudomonas syringae liści rośliny Arabidopsis thaliana.

Teraz otwórz górną pokrywę urządzenia. Umieść liść na scenie i zamknij pokrywę. Wyreguluj ostrość za pomocą regulacyjnej i kliknij Zapisz obraz na komputerze, aby przechwycić obraz.

Aby wykonać automatyczny pomiar otworu szparkowego, otwórz notatnik Google Colaboratory. Kliknij Plik, a następnie Zapisz kopię na Dysku, aby utworzyć kopię lokalną na Dysku Google. Po otwarciu nowej karty zamknij kartę oryginalnego notesu.

Naciśnij przycisk wykonywania w sekcji ustawień środowiskowych w notatniku, aby zaimportować wymagane biblioteki bez rozwijania bloków komórek. W sekcji ustawień katalogu utwórz trzy foldery na Dysku Google do analizy. Przenieś uzyskane obrazy do przykładowego folderu wyników, kategoryzując je według obróbki lub próbki w celu wygenerowania końcowego wykresu.

Kliknij pozycję Pobierz wytrenowane modele, aby pobrać pliki ONNX wytrenowanych modeli z usługi Zenodo. Umieść pobrane pliki w katalogu modelu. Uruchom wnioskowanie i pomiar części apertury szparkowej notebooka, aby określić ilościowo aperturę szparkową na podstawie poszczególnych obrazów.

Wynikowe obrazy z nałożonym wnioskowaniem i przykładowym plikiem CSV z wynikami zostaną wyeksportowane do katalogu wyników wnioskowania. Wykonaj sekcję generowania wykresu, aby utworzyć wykres dotyczący współczynnika apertury aparatów szparkowych. Wyeksportuj ten wykres do katalogu wyników wnioskowania.

Zmniejszenie apertury aparatów szparkowych u roślin zaszczepionych PTO w porównaniu z roślinami zaszczepionymi próbnie zaobserwowano po jednej godzinie po inokulacji. Po trzech godzinach od infekcji otwór szparkowy zarówno u roślin zaszczepionych PTO, jak i u roślin zaszczepionych pozorem był praktycznie taki sam. Zautomatyzowany pomiar apertury aparatów szparkowych trwał około pięciu sekund w celu przetworzenia jednego obrazu, co spowodowało skrócenie czasu pomiaru o 95%.