Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)
February 9th, 2024
Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.
Aparaty szparkowe roślin odgrywają kluczową rolę w adaptacji do warunków stresowych, dlatego musimy zmierzyć otwór stomii, aby zrozumieć, jak rośliny reagują na stres biotyczny i antybiotykowy. Jednak pomiar apertury szparkowej jest czasochłonny i kłopotliwy. Aby zmierzyć otwór szparkowy, wyczuwamy naskórek i obserwujemy aparaty szparkowe pod mikroskopem.
Następnie ręcznie mierzymy otwór szparkowy, co zajmuje dużo czasu, mimo że jesteśmy doświadczonymi badaczami. Zmierzyliśmy się z tymi barierami i opracowaliśmy narzędzie oraz technikę, które mogą automatycznie mierzyć otwór szparkowy w nienaruszonych liściach rzodkiewnika. Dlatego jesteśmy głęboko przekonani, że opracowane przez nas urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych i algorytm głębokiego uczenia ułatwią funkcjonalną analizę reakcji aparatów szparkowych na różne stresy biotyczne i abiotyczne, ponieważ te postępy techniczne znacznie skracają czas i pracę ludzką wymaganą do pomiaru apertury aparatów szparkowych.
Na początek posadź nasiona Arabidopsis thaliana w glebie. Hoduj je w komorze z białym światłem fluorescencyjnym. Następnie zaszczepij pojedynczą kolonię Pseudomonas syringae pv.
pomidor DC3000 w pięciu mililitrach płynnego podłoża King's B. Inkubuj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 200 obrotów na minutę, aż kultura osiągnie późną logarytmiczną fazę wzrostu. Odwirować kulturę przy 6 000 g przez dwie minuty.
Następnie ponownie zawieś pastylkę bakteryjną w jednym mililitrze sterylnej wody. Następnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu otwierającego aparaty szparkowe. Zmierz gęstość optyczną zawiesiny przy 600 nanometrach.
Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do gęstości optycznej 0,2 buforem otwierającym aparaty szparkowe zawierającym 0,4% silikonowego środka powierzchniowo czynnego. Aby zaszczepić zawiesinę bakteryjną, najpierw umieść rośliny Arabidopsis thaliana na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką pod światłem na co najmniej trzy godziny. Zdejmij pokrywę.
Następnie za pomocą aerografu spryskaj spód liści zawiesiną bakteryjną. Po zaszczepieniu inkubuj rośliny na tacy przykrytej przezroczystą pokrywką, aby utrzymać wilgotność względną około 85%Aby rozpocząć, podłącz przenośne urządzenie do obrazowania szparkowego do komputera wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazu. Użyj kawałka papieru, aby ostrożnie usunąć kropelki wody z zaszczepionych Pseudomonas syringae liści rośliny Arabidopsis thaliana.
Teraz otwórz górną pokrywę urządzenia. Umieść liść na scenie i zamknij pokrywę. Wyreguluj ostrość za pomocą regulacyjnej i kliknij Zapisz obraz na komputerze, aby przechwycić obraz.
Aby wykonać automatyczny pomiar otworu szparkowego, otwórz notatnik Google Colaboratory. Kliknij Plik, a następnie Zapisz kopię na Dysku, aby utworzyć kopię lokalną na Dysku Google. Po otwarciu nowej karty zamknij kartę oryginalnego notesu.
Naciśnij przycisk wykonywania w sekcji ustawień środowiskowych w notatniku, aby zaimportować wymagane biblioteki bez rozwijania bloków komórek. W sekcji ustawień katalogu utwórz trzy foldery na Dysku Google do analizy. Przenieś uzyskane obrazy do przykładowego folderu wyników, kategoryzując je według obróbki lub próbki w celu wygenerowania końcowego wykresu.
Kliknij pozycję Pobierz wytrenowane modele, aby pobrać pliki ONNX wytrenowanych modeli z usługi Zenodo. Umieść pobrane pliki w katalogu modelu. Uruchom wnioskowanie i pomiar części apertury szparkowej notebooka, aby określić ilościowo aperturę szparkową na podstawie poszczególnych obrazów.
Wynikowe obrazy z nałożonym wnioskowaniem i przykładowym plikiem CSV z wynikami zostaną wyeksportowane do katalogu wyników wnioskowania. Wykonaj sekcję generowania wykresu, aby utworzyć wykres dotyczący współczynnika apertury aparatów szparkowych. Wyeksportuj ten wykres do katalogu wyników wnioskowania.
Zmniejszenie apertury aparatów szparkowych u roślin zaszczepionych PTO w porównaniu z roślinami zaszczepionymi próbnie zaobserwowano po jednej godzinie po inokulacji. Po trzech godzinach od infekcji otwór szparkowy zarówno u roślin zaszczepionych PTO, jak i u roślin zaszczepionych pozorem był praktycznie taki sam. Zautomatyzowany pomiar apertury aparatów szparkowych trwał około pięciu sekund w celu przetworzenia jednego obrazu, co spowodowało skrócenie czasu pomiaru o 95%.
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę zautomatyzowanego pomiaru odpowiedzi układów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Wykorzystując przenośne urządzenie do obrazowania szparek i potok analizy obrazów, podejście to znacznie usprawnia proces pomiaru otwarcia szparek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia roślin
- Mechanizmy odpowiedzi na stres
- Zautomatyzowane techniki obrazowania
Tło
- Szparki są kluczowe dla adaptacji roślin do stresu.
- Pomiar otwarcia szparek jest tradycyjnie pracochłonny.
- Ręczne pomiary mogą być czasochłonne nawet dla doświadczonych badaczy.
- Zautomatyzowane metody mogą zwiększyć efektywność badań.
Cel badania
- Opracowanie narzędzia do automatycznego pomiaru otwarcia szparek.
- Ułatwienie analizy odpowiedzi szparek na stres biotyczny i abiotyczny.
- Zmniejszenie czasu i pracy związanej z pomiarami szparek.
Zastosowanie metod
- Opracowanie przenośnego urządzenia do obrazowania szparek.
- Implementacja potoku analizy obrazów dla obrazów liści.
- Zastosowanie algorytmów głębokiego uczenia się do przetwarzania danych.
- Testowanie na nienaruszonych liściach Arabidopsis.
Główne wyniki
- Nowa metoda pozwala na szybkie pomiary otwarcia szparek.
- Znaczna redukcja czasu i wysiłku manualnego wymaganego do pomiaru.
- Zwiększona zdolność do analizy odpowiedzi szparek na różne stresy.
- Możliwość szerszych zastosowań w badaniach nad stresem roślin.
Wnioski
- Opracowany urządzenie do obrazowania i algorytmy reprezentują znaczący postęp.
- Ta metoda może poprawić efektywność badań nad szparkami.
- Otwierają nowe kierunki badań nad reakcjami roślin na wyzwania środowiskowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated, quantitative measurement of stomatal responses in intact Arabidopsis leaves enables high-throughput, reproducible assessment of plant-pathogen interactions. This capability supports predictive confidence in early discovery and target validation for plant stress response pathways. Streamlined phenotyping accelerates decision-making at key inflection points in agricultural biotechnology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of plant immune responses to bacterial invasion.
- Supports functional validation of stress response targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying stomatal closure and reopening dynamics.
- Improves predictive confidence for candidate gene or pathway prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, automated measurement of stomatal aperture for assay reproducibility.
- Reduces manual labor and variability in phenotypic screening workflows.
- Generates quantitative outputs suitable for high-throughput screening and comparative analysis.
- Enables rapid evaluation of genetic or chemical modulators of stomatal function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant plant-pathogen interactions.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of stress resilience traits.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates with validated functional impact.
- Provides mechanistic insight for translational biomarker development in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant stress biology, supporting both hypothesis-driven research and scalable screening.
- Discovery Biology: Quantifies stomatal responses to bacterial challenge, clarifying immune pathway function.
- Screening: Delivers reproducible, automated readouts for assay standardization and scalability.
- Analytics: Outputs quantitative measurements and statistical graphs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical trait validation in intact plants.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse plant stress studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in plant-pathogen studies.
- Operational Value: Achieves significant time and labor savings through automation and standardization.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stress resilience targets and traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant physiology and image analysis workflows.
- Needs access to a portable imaging device and computational infrastructure for deep learning analysis.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data handling.
- Adaptation may be needed for different plant species or stress models.
- Dependent on quality of image acquisition and model training for robust outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement
2:38
Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection
