Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Pęknięcia podwójnych nici stanowią najbardziej paraliżujące zmiany. W odpowiedzi komórki wykorzystują dwa podstawowe mechanizmy naprawy pęknięć podwójnej nici, NHEJ i HR. Oddzielne określenie efektywności NHEJ i HR ma kluczowe znaczenie dla zbadania odpowiednich mechanizmów i czynników z nimi związanych. Test NHEJ i test HR są uznanymi metodami stosowanymi do pomiaru skuteczności NHEJ i HR. Metody te opierają się na skrupulatnie zaprojektowanych plazmidach, które zawierają zakłócające geny reporterowe fluorescencji z miejscami rozpoznawania nukleaz, cyklu indukcji DSBS.

Test NHEJ i test HR można przeprowadzić przy użyciu zintegrowanego chromosomalnie lub architektonicznego podejścia chromosomalnego. Podejście zintegrowane chromosomalnie umożliwia analizę naprawy DSB w kontekście chromosomalnym. Jednak podejście zintegrowane chromosomalnie wymaga przedłużonego pasażu komórkowego i nie nadaje się do badań porównawczych obejmujących wiele linii komórkowych.

W tym protokole opisujemy pozachromosomalne testy NHEJ i HR obejmujące transfekcję zakłóconych plazmidów GFP i ISEC1 do komórek HK2 i N3T, a następnie analizę cytometrii przepływowej. Te niezintegrowane testy reporterowe zostały wykorzystane do oceny wydajności NHEJ i efektywności HR przez kilka laboratoriów, w tym nasze. W przeciwieństwie do podejścia zintegrowanego chromosomalnie, to podejście pozachromosomalne umożliwia szybką analizę wydajności NHEJ lub HR poprzez wykorzystanie ustalonych stabilnych linii komórkowych.

Rozpocznij od hodowli komórek HEK 293T w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewaj komórki HEK 293T na płytce sześciodołkowej, aby następnego dnia osiągnąć około 60% konfluencji. Następnie transfekować eksperymentalne komórki próbki na sześciodołkowej płytce z plazmidami do testu NHEJ lub HR przy użyciu komercyjnego zestawu do transfekcji.

W przypadku kontroli kalibracji faksu należy pozostawić studzienkę z nietransfekowanymi komórkami jako kontrolę ujemną. Transfekować komórki na sześciodołkowej płytce z plazmidami do GFP, kontroli pojedynczego koloru lub kontroli pojedynczego koloru mCherry. Zacznij od transfekcji komórek HEK 293T.

Trzy dni po transfekcji wyjmij pożywkę z dołków i przemyj raz PBS. Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny do każdej studzienki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby oderwać wszystkie komórki od płytki.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki DMEM do każdej studzienki i ponownie zawieś komórki. Przenieś wszystkie komórki z każdej studzienki do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie odwirować przez dwie minuty w temperaturze 1000 G w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania i przemyć osad raz jednym mililitrem PBS. Ponownie ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS. Przenieś komórki do lamp faksowych.

Oznacz komórki za pomocą cytometru przepływowego. Załadować nietransfekowaną zawiesinę komórkową. W arkuszu cytometrii przepływowej naciśnij przycisk nabycia i dostosuj napięcia rozproszenia przedniego i bocznego.

Aby umieścić komórki w środkowym obszarze, należy umieścić je wokół tej populacji R1, aby wykluczyć szczątki w lewym dolnym kwadrancie. Zmień bramkę FL1, FL2. blot jako G równa się R1. Wybierz narzędzie do bramkowania poczwórnego i kliknij prawy górny koniec populacji komórek w FL1, FL2.

blot jako G równa się R1. Dostosuj FL1 FL2 voltages, aby ustawić ogniwa w lewym dolnym kwadrancie. Naciśnij pauzę i przerwij. Następnie załaduj pojedyncze komórki kontrolne koloru GFP.

Naciśnij przycisk nabycia i dostosuj kompensację, aby ustawić dodatnie komórki GFP w prawym dolnym kwadrancie. Naciśnij pauzę i przerwij. Następnie załaduj pojedyncze komórki kontrolne koloru mCherry.

Naciśnij przycisk nabierania i regulacji kompensacji, aby ustawić dodatnie komórki mCherry w lewym górnym kwadrancie. Naciśnij pauzę i przerwij. Kliknij opcję Pobieranie na pasku menu i wybierz opcję Pobieranie i przechowywanie.

W obszarze kryteriów kolekcji wybrane pozyskiwanie zostanie zatrzymane po zliczeniu 10 000 zdarzeń G1 równych R1. Anuluj znacznik wyboru konfiguracji. Załaduj komórki próbki.

Naciśnij przycisk pobierania i poczekaj, aż 10 000 komórek G1 równa się R1. Powtórzyć to samo dla innych próbek i kontroli. Aby rozpocząć importowanie wszystkich plików faksów do panelu analizy.

Otwórz jeden z plików, aby wyświetlić wykres punktowy po stronie punktowej do przodu. Zbuduj bramę wielokątną, aby odizolować nienaruszone komórki, unikając gruzu w lewym dolnym rogu działki. Oznacz subpopulację jako nienaruszone komórki i przeciągnij tę bramę na pasek wszystkich próbek.

Sprawdź bramkowanie dla każdej próbki przy użyciu przycisku następnej próbki. Kliknij dwukrotnie subpopulację nienaruszonych komórek w próbce kontroli ujemnej, aby wyświetlić nową powierzchnię. Dostosuj oś wykresu do FL1-H na osi x, aby reprezentować GFP i FL2-H na osi Y reprezentującej mCherry.

Następnie wybierz narzędzie do bramkowania poczwórnego i kliknij prawy górny róg ujemnej populacji komórek. Przeciągnij cztery prostokątne bramki na pasek nienaruszonych komórek. Sprawdź każdą próbkę jednokolorowych kontrolek GFP lub mCherry pod kątem prawidłowego bramkowania za pomocą następnego przycisku próbki.

Przejdź do edytora układu. W tym miejscu należy wybrać reprezentatywne działki i wybrać opcję kopiowania do edytora układu. Zaznacz wszystkie reprezentatywne powierzchnie.

Następnie kliknij dwukrotnie, aby otworzyć definicję wykresu. Nazwij etykietę osi x jako GFP, a etykietę osi Y jako mCherry. Określ względną skuteczność naprawy DNA, porównując liczbę komórek dodatnich GFP z liczbą komórek mCherry-dodatnich na tym samym wykresie.

Wdrożono odpowiednią strategię korekty wynagrodzeń i bramkowania, aby zapewnić dokładność analizy NHEJ i HR. Ta strategia umieściła komórki GFP dodatnie w prawym dolnym kwadrancie i komórki mCherry dodatnie w lewym górnym kwadrancie. Odsetek komórek GFP dodatnich wskazywał na skuteczność naprawy i transfekcji DNA DSB.

I odwrotnie, odsetek komórek mCherry dodatnich odzwierciedlał tylko skuteczność transfekcji. Skuteczność naprawy DNA DSB obliczono jako stosunek komórek GFP dodatnich do mCherry dodatnich. Ponadto wykazano rolę białka zespołu Wiskotta-Aldricha i homologu SCAR lub białka WASH w naprawie DNA za pomocą testu NHEJ na komórkach shControl i shWASH.

Utrata WASH zmniejszyła wydajność NHEJ, podkreślając jej rolę w promowaniu NHEJ.