Name: Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metody ekstrachromosomalnych testów NHEJ i HR do oceny naprawy DNA w komórkach HEK-293T. Protokoły wykorzystują plazmidy z reporterem GFP i cytometrię przepływową do szybkiej analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Heilongjiang w Chinach (YQ2022C036) oraz Fundację Innowacji dla Absolwentów Uniwersytetu Medycznego Qiqihar (QYYCX2022-06). Rysunek 1 utworzony przy użyciu MedPeer.

1. Izolacja plazmidu
<ol>
	<li>Przekształć kompetentną E. coli za pomocą plazmidów EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plazmid eksprymujący I-SceI) i PCI2-HA-mCherry (plazmid eksprymujący mCherry) (patrz Tabela materiałów) zgodnie ze standardowym protokołem transformacji20. 
	UWAGA: PCI2-HA-mCherry można zastąpić innymi plazmidami eksprymującymi mCherry lub DsRed.</li>
	<li>Hodować przekształcone bakterie E. coli w 500 ml płynnego podłoża LB uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidy za pomocą dostępnego w handlu zestawu do maksymalnej izolacji plazmidu wolnego od endotoksyn, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Określić ilościowo stężenia plazmidów za pomocą spektrofotometrów mikroobjętościowych nanokropli. Dostosuj stężenie plazmidu do 1 μg/μl.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i transfekcja komórek
<ol>
	<li>Hodowla komórek HEK-293T w pożywce DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą. Upewnij się, że komórki HEK-293T lub ustabilizowane komórki stabilne HEK-293T są w dobrym stanie wzrostu. 
	UWAGA: Zamrożone komórki powinny przejść co najmniej dwie rundy podziału przed transfekcją.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewaj komórki HEK-293T na 6-dołkowej płytce w 2 × 105 komórek/basenik, aby osiągnąć około 60% konfluencji następnego dnia.</li>
	<li>W dniu transfekcji potwierdź zbieżność komórek, dążąc do około 60%. W przypadku testu NHEJ należy transfekować eksperymentalne komórki próbki na 6-dołkowej płytce z 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI i 1 μg plazmidów PCI2-HA-mCherry, używając komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). W teście HR zastąp plazmid EJ5-GFP plazmidem DR-GFP.</li>
	<li>W przypadku kontroli kalibracyjnych FACS należy pozostawić studzienkę komórek nietransfekowaną jako kontrolę ujemną. Transfekować komórki na 6-dołkowej płytce za pomocą (1) 1 μg EJ5-GFP (dla testu NHEJ) lub 1 μg DR-GFP (dla testu HR), razem z 1 μg pCBASceI jako jednokolorowej kontroli GFP lub (2) 1 μg PCI2-HA-mCherry jako jednokolorowej kontroli mCherry.</li>
</ol>
3. Analiza komórek GFP-dodatnich i mCherry-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Dwa dni po transfekcji potwierdź ekspresję białek GFP i mCherry za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Trzy dni po transfekcji usuń pożywkę z dołków, przemyj raz PBS i dodaj 500 μl trypsyny do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu oderwania wszystkich komórek od płytki. W tym i kolejnych krokach chroń komórki przed bezpośrednim światłem.</li>
	<li>Dodaj 500 μl kompletnej pożywki DMEM do każdej studzienki, ponownie zawieś komórki, upewniając się, że nie są widoczne żadne grudki.</li>
	<li>Przenieść wszystkie komórki z każdej studzienki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, a następnie odwirowywać komórki przez 2 minuty w temperaturze 1000 × g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipetowania i przemyć go jednorazowo 1,0 ml PBS.</li>
	<li>Ponownie ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania, ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS i przenieść komórki do probówek FACS (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, rozpocznij analizę cytometrii przepływowej natychmiast po pobraniu komórek. Alternatywnie komórki można przechowywać na lodzie przez kilka godzin.</li>
	<li>Skalibruj FACS z komórkami nietransfekowanymi (kontrola ujemna), komórkami transfekowanymi EJ5-GFP/DR-GFP i komórkami transfekowanymi pCBASceI (kontrola jednokolorowa GFP) i komórkami transfekowanymi mCherry (kontrola jednokolorowa mCherry). Dostosuj napięcie i kompensację, aby zminimalizować rozlewanie się fluorescencji między GFP a mCherry.</li>
	<li>Zdobądź i zapisz co najmniej 10 000 nienaruszonych komórek z każdej probówki.</li>
</ol>
4. Analiza danych
UWAGA: Następujące kroki są wykonywane za pomocą oprogramowania FlowJo (patrz Tabela materiałów) do analizy danych FACS. Porównywalne procedury można wykonać w alternatywnym oprogramowaniu do analizy.
<ol>
	<li>Przeciągnij wszystkie pliki FACS do pulpitu nawigacyjnego. Kliknij dwukrotnie jeden z plików, aby wyświetlić wykres FSC/SSC.</li>
	<li>Utwórz bramę wielokątną, aby zaznaczyć nienaruszone komórki, z wyłączeniem gruzu w lewym dolnym rogu. Nazwij tę subpopulację "Nienaruszone komórki" i przeciągnij tę bramę do paska "Wszystkie próbki". Przewiń każdą próbkę za pomocą przycisku Następna próbka, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie dla każdej próbki (Rysunek 2A).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie subpopulację nienaruszonych komórek w próbce kontroli ujemnej (komórki nietransfekowane), aby wyświetlić nową powierzchnię. Zmień osie na FL1-H (oś x, GFP) i FL2-H (oś y, mCherry).</li>
	<li>Wybierz narzędzie Quad Gating i kliknij prawy górny róg ujemnej populacji komórek (Rysunek 2B). Przeciągnij cztery prostokątne bramki na pasek "Nienaruszone komórki". Przewiń próbki jednokolorowej kontroli GFP lub jednokolorowej kontroli mCherry za pomocą przycisku Następna próbka, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie do rozróżniania GFP-dodatnich lub mWiśniowo-dodatnich od ujemnych komórek kontrolnych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C,D). W razie potrzeby dostosuj bramkowanie kwadrantowe i zastosuj to bramkowanie do wszystkich populacji "nienaruszonych komórek".</li>
	<li>Kliknij Edytor układu. Kliknij prawym przyciskiem myszy reprezentatywne działki i wybierz polecenie Kopiuj do Edytora układu. Zaznacz wszystkie reprezentatywne wykresy, a następnie kliknij dwukrotnie, aby otworzyć Definicję wykresu. Dostosuj etykietę osi, adnotację i legendę zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Procent komórek mCherry-dodatnich w próbkach eksperymentalnych służy jako kontrola wydajności transfekcji. Oblicz względną skuteczność naprawy DNA, porównując liczbę komórek GFP-dodatnich z liczbą komórek mCherry-dodatnich na tym samym wykresie.</li>
</ol>

FACS Analysis of GFP and mCherry Reporter Cells to Evaluate NHEJ & HR Efficiency

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Opisana tutaj metoda została wykorzystana w kilku artykułach do oceny efektywności NHEJ i efektywności HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Metoda ta jest przydatna do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw naprawy DNA DSB i identyfikacji nowych czynników związanych z NHEJ i HR. Na przykład funkcja zależnej od DNA podjednostki katalitycznej kinazy białkowej (DNA-PKcs)9, jądrowego białka ATPazy oddziałującego z cewką (hCINAP)10, WASH11, genu I indukowanego kwasem retinowym (RIG-I)12, białka 4 (XRCC4)12 naprawy krzyżowej naprawy promieniowania rentgenowskiego, białka 1 (HORMAD1)13 zawierającego domenę HORMA, proteazy specyficznej dla ubikwityny 44 (USP44)14i lncRNA NIHCOLE (niekodujące RNA indukowane w raku wątrobowokomórkowym z onkogenną rolą w skuteczności ligacji) w NHEJ lub HR zostały ujawnione lub zwalidowane dzięki zastosowaniu metod pozachromosomalnych. W przeciwieństwie do podejścia zintegrowanego chromosomalnie, to podejście pozachromosomalne umożliwia szybką analizę wydajności NHEJ lub HR poprzez wykorzystanie ustalonych stabilnych linii komórkowych.
Pozachromosomalne testy NHEJ i HR, które były wcześniej wykorzystywane w komórkach HEK-293T przez nas i innych 10,11,12, zostały również wykorzystane przez kilka innych grup badawczych w różnych liniach komórkowych, w tym w komórkach U2OS 16,17, komórkach raka zarodkowego17,19, komórkach HCT116 9, komórkach SUM15913, komórkach HCC114313, komórkach MDA-MB-43613, komórki SUNE114, komórki Huh718 i komórki JHH618. Poniższy protokół zawiera szczegółowy opis testów NHEJ i HR przeprowadzonych w komórkach HEK-293T. Biorąc pod uwagę znaczną skuteczność transfekcji komórek HEK-293, połączenie 1 μg EJ5-GFP lub 1 μg DR-GFP, wraz z 1 μg pCBASceI, uważa się za odpowiednie dla komórek HEK-293T hodowanych na płytce 6-dołkowej. Jednak warunki transfekcji mogą się różnić w liniach komórkowych innych niż HEK-293T 9,16,17, co wymaga od badacza skrupulatnego określenia dokładnych warunków udanej transfekcji.
Osiągnięcie wymaganej konfluencji komórek przed transfekcją jest kluczową procedurą w protokole. Niewystarczająca lub nadmierna liczba komórek może znacznie osłabić skuteczność transfekcji. Niewystarczająca liczba komórek nasila toksyczność po transfekcji, utrudniając w ten sposób precyzyjną ocenę naprawy DSB. Ponadto ważne jest, aby użyć tej samej mieszanki plazmidów i odczynnika do transfekcji w jednym eksperymencie, ponieważ odchylenia w mieszaninie EJ5-GFP/DR-GFP, pCBASceI, PCI2-HA-mCherry i odczynnika do transfekcji mogą potencjalnie wpłynąć na wynik.
Oprócz NHEJ i HR, naprzemienne łączenie końcówek (a-EJ) i wyżarzanie jednoniciowe (SSA) zostały zidentyfikowane jako dodatkowe mechanizmy naprawy DSB. Jednak w komórkach typu dzikiego NHEJ i HR są głównymi ścieżkami naprawy DSB, podczas gdy a-EJ i SSA wnoszą tylko niewielki wkład w tym względzie. Warto zauważyć, że test NHEJ wykorzystujący plazmid EJ5-GFP wykrywa zarówno zdarzenia NHEJ, jak i a-EJ, a zatem może być uważany za test dla całkowitego NHEJ, w tym zarówno NHEJ, jak i a-EJ5. Indywidualną analizę a-EJ można łatwo przeprowadzić, zastępując EJ5-GFP przez EJ2-GFP18. Podobne testy można również przeprowadzić w celu analizy skuteczności naprawy SSA poprzez zastąpienie uszkodzonego reportera GFP hprtSAGFP21.

Dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB) jest najbardziej szkodliwą formą uszkodzenia DNA, potencjalnie prowadzącą do niestabilności genomu, rearanżacji chromosomów, starzenia się komórek i śmierci komórki, jeśli nie zostanie szybko naprawiona1. Dwa dobrze ugruntowane szlaki, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i rekombinacja homologiczna (HR), są znane ze swojej skuteczności w adresowaniu DSB DNA2,3. HR jest uważany za bezbłędny mechanizm naprawy DSB, wykorzystujący sekwencje homologiczne w chromatydzie siostrzanej jako matrycę do przywrócenia pierwotnej konfiguracji uszkodzonej cząsteczki DNA3. Z drugiej strony, NHEJ jest podatną na błędy ścieżką naprawy DSB, która łączy uszkodzone końce DNA bez polegania na jakimkolwiek szablonie2.
Test NHEJ i test HR są klasycznymi metodami pierwotnie opracowanymi w laboratorium Jasina w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center i wykorzystanymi do ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR, odpowiednio4,5,6,7. Testy te odgrywają kluczową rolę w badaniu odpowiednich mechanizmów i czynników związanych z NHEJ i HR8,9,10,11,12,13,14. Oba testy opierają się na implementacji dwóch zakłóconych reporterów GFP, EJ5-GFP i DR-GFP, w celu monitorowania naprawy DSB indukowanej przez endonukleazę I-SceI. Reporter EJ5-GFP jest stosowany w teście NHEJ, podczas gdy reporter DR-GFP jest używany w teście HR. Każdy reporter jest subtelnie zaprojektowany w taki sposób, że DSB indukowane przez I-SceI mogą być naprawiane tylko przez określoną ścieżkę naprawy w celu przywrócenia kasety z wyrażeniem GFP4,5.
Test NHEJ i test HR mogą być przeprowadzone przy użyciu podejścia zintegrowanego chromosomalnie lub pozachromosomalnego15,16. Podejście zintegrowane chromosomalnie wymaga integracji zakłóconych reporterów GFP z genomem, co pozwala na analizę naprawy DSB w kontekście chromosomalnym6,15. Jednak takie podejście wymaga długotrwałego pasażowania komórek i nie nadaje się do badań porównawczych obejmujących wiele linii komórkowych ze względu na arbitralną integrację chromosomalną, wprowadzając dodatkowy czynnik zakłócający oprócz nieodłącznych różnic. W tym protokole opisujemy pozachromosomalny test NHEJ i testy HR, obejmujące przejściową transfekcję zakłóconych plazmidów GFP i I-SceI do komórek HEK-293T, a następnie analizę cytometrii przepływowej (przebieg eksperymentu pokazano w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Te niezintegrowane testy reporterowe zostały pierwotnie zgłoszone przez laboratorium Jasina w celu zbadania naprawy międzyniciowych połączeń międzyniciowych DNA16 i zostały wykorzystane do oceny wydajności NHEJ i wydajności HR przez kilka laboratoriów9,10,11,12,13,14,17,18,19, w tym nasz11. Te pozachromosomalne podejścia ułatwiają analizę naprawy DSB w badaniach porównawczych obejmujących wiele ustalonych stabilnych linii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Naczynia 6 cm&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>Stężenie robocze: 100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>DH5&alfa; Competent Cells</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid&nbsp; kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>alternatywny zestaw do ekstrakcji plazmidu bez endotoksyn może być stosowany</td></tr><tr><td>Probówki</td><td>FACS FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr> Można użyć alternatywnego oprogramowania do analizy <tr><td>surowicy bydlęcej</td><td>płodu CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td> Można <td>użyć alternatywnego oprogramowania do analizy</td><td>Treestar</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HEK-293T</td><td>Krajowa Infrastruktura Linii Komórkowych Zasób</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>można zastosować alternatywne regenty transfekcji</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>Plazmid eksprymujący SceI</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mWiśnia</td><td></td><td></td><td>alternatywne plazmidy zawierające DsRed mogą być używane</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach hek-293t przy użyciu systemów reporterowych opartych na gfp

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) reprezentują najbardziej niebezpieczne uszkodzenia DNA, zdolne do wywołania znacznej utraty informacji genetycznej i zaniku komórek. W odpowiedzi komórki wykorzystują dwa podstawowe mechanizmy naprawy DSB: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i rekombinację homologiczną (HR). Kwantyfikacja efektywności NHEJ i HR oddzielnie ma kluczowe znaczenie dla zbadania odpowiednich mechanizmów i czynników związanych z każdym z nich. Test NHEJ i test HR są uznanymi metodami stosowanymi do pomiaru skuteczności ich odpowiednich ścieżek naprawy. Metody te opierają się na skrupulatnie zaprojektowanych plazmidach zawierających zaburzony gen białka zielonej fluorescencji (GFP) z miejscami rozpoznawania endonukleazy I-SceI, która indukuje DSB. Tutaj opisujemy pozachromosomalny test NHEJ i test HR, które obejmują kotransfekcję komórek HEK-293T z plazmidami EJ5-GFP / DR-GFP, plazmidem eksprymującym I-SceI i plazmidem eksprymującym mCherry. Wyniki ilościowe efektywności NHEJ i HR uzyskuje się poprzez obliczenie stosunku komórek GFP-dodatnich do komórek mCherry-dodatnich, zliczonych za pomocą cytometrii przepływowej. W przeciwieństwie do testów zintegrowanych chromosomalnie, te testy pozachromosomowe są bardziej odpowiednie do przeprowadzania badań porównawczych z udziałem wielu ustalonych stabilnych linii komórkowych.

Aby zapewnić dokładność analizy NHEJ oraz HR, konieczne jest zastosowanie odpowiedniej korekty kompensacji i strategii bramkowania. Zazwyczaj fluorescencja mCherry nie przejawia się w detektorze GFP przy użyciu filtra 530 nm. Jednak w przypadkach komórek wykazujących niezwykle wysoką ekspresję GFP, fluorescencja GFP może zanieczyszczać detektor mCherry przy użyciu filtra 575 nm. Aby rozwiązać te problemy, do kompensacji i regulacji strategii bramkowania wykorzystano kontrolę negatywną, kontrolę jednobarwną GFP oraz kontrolę jednobarwną mCherry. Typowe wyniki FACS dla komórek kontrolnych przedstawiono na Rysunku 2. Korekta kompensacji i strategia bramkowania powinny sytuować większość komórek dodatnich dla GFP w prawym dolnym kwadrancie (Rysunek 2C), a większość komórek dodatnich dla mCherry w lewym górnym kwadrancie (Rysunek 2D).
Końcowe reprezentatywne wykresy przedstawiono na Rysunku 3A,B. Po indukcji DSB przez I-SceI pomyślne zdarzenia naprawy doprowadzą do rekonstytucji genu GFP. Zatem odsetek komórek dodatnich dla GFP odpowiada wydajności naprawy DSB w DNA oraz wydajności transfekcji. Odsetek komórek dodatnich dla mCherry odpowiada jedynie wydajności transfekcji. Względną wydajność naprawy DSB w DNA można obliczyć jako stosunek liczby komórek dodatnich dla GFP do liczby komórek dodatnich dla mCherry (Rysunek 3C).
Konkretny przykład testu NHEJ służącego do charakterystyki roli białka zespołu Wiskotta-Aldricha i homologu SCAR (WASH) w naprawie DNA przedstawiono na Rysunku 4. W tym przykładzie przeprowadziliśmy test NHEJ w celu oceny wydajności NHEJ w komórkach shControl oraz komórkach shWASH (Rysunek 4). Ewidentnie utrata WASH doprowadziła do zmniejszenia wydajności NHEJ, co potwierdza rolę WASH w zwiększaniu wydajności NHEJ, określoną za pomocą testu NHEJ.
<img alt="Proces transfekcji komórek; insercja plazmidu; analiza cytometrią przepływową; ekspresja GFP, mCherry." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd schematu badania NHEJ/HR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej; analiza komórek, FSC-H vs SSC-H, GFP vs mCherry; metoda bramkowania populacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strategia bramkowania dla analizy cytometrią przepływową. (A) Bramkowanie FSC-H/SSC-H w celu wyłonienia nienaruszonych komórek. (B) Nietransfekowane komórki HEK-293T zostały użyte jako kontrola negatywna do wykluczenia komórek autofluorescencyjnych. (C) Komórki HEK-293T transfekowane plazmidami EJ5-GFP i pCBASceI zostały użyte do ustawienia bramkowania dla komórek GFP-dodatnich. (D) Komórki HEK-293T transfekowane plazmidami mCherry zostały użyte do ustawienia bramkowania dla komórek mCherry-dodatnich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej A i B przedstawiają ekspresję GFP vs. mCherry; C zawiera formułę obliczeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Typowe wyniki. (A) Reprezentatywne wykresy ilustrujące analizę NHEJ. (B) Reprezentatywne wykresy ilustrujące analizę HR. (C) Schemat modelu metody obliczeniowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna, wykresy rozproszenia GFP-mCherry, porównanie wydajności NHEJ, wyniki na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: WASH zwiększa wydajność NHEJ. (A) Reprezentatywne wykresy ilustrujące analizę wydajności NHEJ w komórkach shControl i shWASH. (B) Reprezentatywne wyniki statystyczne porównujące wydajność NHEJ pomiędzy komórkami shControl a shWASH. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most perilous DNA lesions, capable of inducing substantial genetic information loss and cellular demise. In ...

Pęknięcia podwójnych nici stanowią najbardziej paraliżujące zmiany. W odpowiedzi komórki wykorzystują dwa podstawowe mechanizmy naprawy pęknięć podwójnej nici, NHEJ i HR. Oddzielne określenie efektywności NHEJ i HR ma kluczowe znaczenie dla zbadania odpowiednich mechanizmów i czynników z nimi związanych. Test NHEJ i test HR są uznanymi metodami stosowanymi do pomiaru skuteczności NHEJ i HR. Metody te opierają się na skrupulatnie zaprojektowanych plazmidach, które zawierają zakłócające geny reporterowe fluorescencji z miejscami rozpoznawania nukleaz, cyklu indukcji DSBS.Test NHEJ i test HR można przeprowadzić przy użyciu zintegrowanego chromosomalnie lub architektonicznego podejścia chromosomalnego. Podejście zintegrowane chromosomalnie umożliwia analizę naprawy DSB w kontekście chromosomalnym. Jednak podejście zintegrowane chromosomalnie wymaga przedłużonego pasażu komórkowego i nie nadaje się do badań porównawczych obejmujących wiele linii komórkowych.W tym protokole opisujemy pozachromosomalne testy NHEJ i HR obejmujące transfekcję zakłóconych plazmidów GFP i ISEC1 do komórek HK2 i N3T, a następnie analizę cytometrii przepływowej. Te niezintegrowane testy reporterowe zostały wykorzystane do oceny wydajności NHEJ i efektywności HR przez kilka laboratoriów, w tym nasze. W przeciwieństwie do podejścia zintegrowanego chromosomalnie, to podejście pozachromosomalne umożliwia szybką analizę wydajności NHEJ lub HR poprzez wykorzystanie ustalonych stabilnych linii komórkowych.Rozpocznij od hodowli komórek HEK 293T w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą. W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewaj komórki HEK 293T na płytce sześciodołkowej, aby następnego dnia osiągnąć około 60% konfluencji. Następnie transfekować eksperymentalne komórki próbki na sześciodołkowej płytce z plazmidami do testu NHEJ lub HR przy użyciu komercyjnego zestawu do transfekcji.W przypadku kontroli kalibracji faksu należy pozostawić studzienkę z nietransfekowanymi komórkami jako kontrolę ujemną. Transfekować komórki na sześciodołkowej płytce z plazmidami do GFP, kontroli pojedynczego koloru lub kontroli pojedynczego koloru mCherry. Zacznij od transfekcji komórek HEK 293T.Trzy dni po transfekcji wyjmij pożywkę z dołków i przemyj raz PBS. Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny do każdej studzienki. Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby oderwać wszystkie komórki od płytki.Następnie dodaj 500 mikrolitrów kompletnej pożywki DMEM do każdej studzienki i ponownie zawieś komórki. Przenieś wszystkie komórki z każdej studzienki do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie odwirować przez dwie minuty w temperaturze 1000 G w temperaturze pokojowej.Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania i przemyć osad raz jednym mililitrem PBS. Ponownie ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS. Przenieś komórki do lamp faksowych.Oznacz komórki za pomocą cytometru przepływowego. Załadować nietransfekowaną zawiesinę komórkową. W arkuszu cytometrii przepływowej naciśnij przycisk nabycia i dostosuj napięcia rozproszenia przedniego i bocznego.Aby umieścić komórki w środkowym obszarze, należy umieścić je wokół tej populacji R1, aby wykluczyć szczątki w lewym dolnym kwadrancie. Zmień bramkę FL1, FL2. blot jako G równa się R1. Wybierz narzędzie do bramkowania poczwórnego i kliknij prawy górny koniec populacji komórek w FL1, FL2.blot jako G równa się R1. Dostosuj FL1 FL2 voltages, aby ustawić ogniwa w lewym dolnym kwadrancie. Naciśnij pauzę i przerwij. Następnie załaduj pojedyncze komórki kontrolne koloru GFP.Naciśnij przycisk nabycia i dostosuj kompensację, aby ustawić dodatnie komórki GFP w prawym dolnym kwadrancie. Naciśnij pauzę i przerwij. Następnie załaduj pojedyncze komórki kontrolne koloru mCherry.Naciśnij przycisk nabierania i regulacji kompensacji, aby ustawić dodatnie komórki mCherry w lewym górnym kwadrancie. Naciśnij pauzę i przerwij. Kliknij opcję Pobieranie na pasku menu i wybierz opcję Pobieranie i przechowywanie.W obszarze kryteriów kolekcji wybrane pozyskiwanie zostanie zatrzymane po zliczeniu 10 000 zdarzeń G1 równych R1. Anuluj znacznik wyboru konfiguracji. Załaduj komórki próbki.Naciśnij przycisk pobierania i poczekaj, aż 10 000 komórek G1 równa się R1. Powtórzyć to samo dla innych próbek i kontroli. Aby rozpocząć importowanie wszystkich plików faksów do panelu analizy.Otwórz jeden z plików, aby wyświetlić wykres punktowy po stronie punktowej do przodu. Zbuduj bramę wielokątną, aby odizolować nienaruszone komórki, unikając gruzu w lewym dolnym rogu działki. Oznacz subpopulację jako nienaruszone komórki i przeciągnij tę bramę na pasek wszystkich próbek.Sprawdź bramkowanie dla każdej próbki przy użyciu przycisku następnej próbki. Kliknij dwukrotnie subpopulację nienaruszonych komórek w próbce kontroli ujemnej, aby wyświetlić nową powierzchnię. Dostosuj oś wykresu do FL1-H na osi x, aby reprezentować GFP i FL2-H na osi Y reprezentującej mCherry.Następnie wybierz narzędzie do bramkowania poczwórnego i kliknij prawy górny róg ujemnej populacji komórek. Przeciągnij cztery prostokątne bramki na pasek nienaruszonych komórek. Sprawdź każdą próbkę jednokolorowych kontrolek GFP lub mCherry pod kątem prawidłowego bramkowania za pomocą następnego przycisku próbki.Przejdź do edytora układu. W tym miejscu należy wybrać reprezentatywne działki i wybrać opcję kopiowania do edytora układu. Zaznacz wszystkie reprezentatywne powierzchnie.Następnie kliknij dwukrotnie, aby otworzyć definicję wykresu. Nazwij etykietę osi x jako GFP, a etykietę osi Y jako mCherry. Określ względną skuteczność naprawy DNA, porównując liczbę komórek dodatnich GFP z liczbą komórek mCherry-dodatnich na tym samym wykresie.Wdrożono odpowiednią strategię korekty wynagrodzeń i bramkowania, aby zapewnić dokładność analizy NHEJ i HR. Ta strategia umieściła komórki GFP dodatnie w prawym dolnym kwadrancie i komórki mCherry dodatnie w lewym górnym kwadrancie. Odsetek komórek GFP dodatnich wskazywał na skuteczność naprawy i transfekcji DNA DSB.I odwrotnie, odsetek komórek mCherry dodatnich odzwierciedlał tylko skuteczność transfekcji. Skuteczność naprawy DNA DSB obliczono jako stosunek komórek GFP dodatnich do mCherry dodatnich. Ponadto wykazano rolę białka zespołu Wiskotta-Aldricha i homologu SCAR lub białka WASH w naprawie DNA za pomocą testu NHEJ na komórkach shControl i shWASH.Utrata WASH zmniejszyła wydajność NHEJ, podkreślając jej rolę w promowaniu NHEJ.

analysis-nonhomologous-end-joining-homologous-recombination

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Test translokacji stymulowanej przez HO monitoruje proces wyżarzania pojedynczej nici po powstaniu pęknięć obu nici DNA w wielu loci u diploidalnych Saccharomyces cerevisiae. Mechanizm ten może służyć jako model przemieszczeń genomowych w komórkach somatycznych wyższych eukariotów po ekspozycji na wysokie dawki promieniowania jonizującego.

Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Poznaj metody ekstrachromosomalnych testów NHEJ i HR do oceny naprawy DNA w komórkach HEK-293T. Protokoły wykorzystują plazmidy z reporterem GFP i cytometrię przepływową do szybkiej analizy.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP (Wideo) | JoVE Journal

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Przeglądaj więcej filmów