Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Nasze badania koncentrują się na leczeniu przerzutów raka piersi za pomocą terapii sterowanej obrazem na platformie nanocząstek tlenku żelaza. Celem jest opracowanie skutecznych terapii ukierunkowanych konkretnie na tkanki z przerzutami, które są główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami. Ustalenie, czy terapia ogólnoustrojowa dotarła do pożądanej tkanki bez poświęcania zwierząt, może być trudne.

Nasza nanocząstka może być obrazowana za pomocą rezonansu magnetycznego i metod obrazowania optycznego, co pozwala nam monitorować dostarczanie i akumulację leków u żywych zwierząt. Obecne terapie raka piersi z przerzutami nie są specyficzne dla przerzutów, mają zmienną skuteczność i powodują niepożądane skutki uboczne. Nasza platforma nanocząstek jest ukierunkowana na niszę przerzutów i pozwala na nieinwazyjne monitorowanie ich dostarczania bez dowodów na działania niepożądane.

Wcześniej używaliśmy naszej platformy nanocząstek, aby celować w czynnik powodujący przerzuty, miR-10b, i byliśmy w stanie zatrzymać przerzuty i wzrost przerzutów. Mając na uwadze translację kliniczną, badamy farmakodynamikę tego preparatu, aby zoptymalizować schemat leczenia i zmaksymalizować skuteczność. Na początek umieść zamrożony Matrigel w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 24 godziny, aby ekstrakt z matrycy mógł się upłynnić.

Po określeniu całkowitej liczby komórek potrzebnych do badania, trypsynizuj komórki i przemyj PBS. Odwirować komórki w temperaturze 200 G przez 5 minut. Następnie ponownie zawiesić granulat w 500 mikrolitrach schłodzonego PBS, aby utworzyć zapas komórek.

Teraz rozcieńczyć całkowitą liczbę komórek do 40 razy 10 do mocy 6 komórek na mililitr. Następnie dodać równą objętość schłodzonego ekstraktu z matrycy, aby uzyskać końcowe stężenie 1 razy 10 do mocy 6 komórek na 50 mikrolitrów. Mieszaninę należy przechowywać na lodzie, aby zapobiec zestaleniu się ekstraktu przed implantacją.

Przenieś znieczuloną mysz na stożek nosowy na poduszce grzewczej. Po potwierdzeniu operacyjnej płaszczyzny znieczulenia należy nałożyć maść okulistyczną, aby chronić oczy przed wysuszeniem rogówki. Następnie oczyść skórę w pobliżu miejsca wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem i pozostaw do wyschnięcia na kilka sekund.

Indukuj w gruczole sutkowym numer cztery, aby zminimalizować nakładanie się sygnałów między guzem pierwotnym a częstymi miejscami przerzutów. Teraz pipetuj pulę komórek w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki. Pobrać 50 mikrolitrów lodowatej zawiesiny komórkowej do strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 29.

Wbić igłę bezpośrednio pod sutek pożądanego gruczołu sutkowego, równolegle do ciała myszy i wstrzykiwać komórki w stałym, powolnym tempie. Pozostawić igłę w skórze na co najmniej 5 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia, aby umożliwić zastygnięcie Matrigelu i zapobiec wyciekaniu. Następnie przenieś mysz do czystej klatki na podkładce rozgrzewającej w celu odzyskania siły i nadzoruj, aż będzie w pełni sprawna i będzie w stanie utrzymać leżący mostek.

Aby monitorować wzrost guza i rozwój przerzutów, wstrzyknij 150 miligramów na kilogram masy ciała lucyferyny dootrzewnowo do znieczulonego mysiego modelu raka piersi z przerzutami. Wróć myszy do klatki na podkładce rozgrzewającej, aby umożliwić im obudzenie się i metabolizowanie lucyferyny. Następnie zobrazuj myszy za pomocą skanera systemu obrazowania, rozpoczynając około 10 minut po wstrzyknięciu lucyferyny.

Wyobraź sobie do 5 myszy razem w pozycji leżącej, upewniając się, że całe ich ciała znajdują się w oznaczeniach prowadzących pole widzenia i są zorientowane tak prosto, jak to możliwe. Użyj przezroczystej taśmy, aby zabezpieczyć ramiona, aby lepiej uwidocznić pachowe węzły chłonne. Teraz w oprogramowaniu systemu obrazowania ustaw Ekspozycja na Auto, Binning na Średnia, FStop na 1, Wzbudzenie na Blok, Emisja na Otwarta, FOV na D i Wysokość na 1.50 dla obrazowania bioluminescencyjnego.

Podczas obrazowania guza pierwotnego, który zwykle wytwarza silny sygnał ze względu na swoje powierzchowne położenie, ustaw Ekspozycja na Auto. Jeśli monitorujesz przerzuty, ostrożnie przykryj guz pierwotny czarną taśmą izolacyjną i ręcznie ustaw ekspozycję na 300 sekund, aby uchwycić wszelkie słabe sygnały. Na początek zważ myszy z przerzutowym rakiem piersi, ponieważ dawka nanoleku zależy od masy ciała.

Przygotuj strzykawkę insulinową z igłą o rozmiarze 29 wypełnioną 10 miligramami nanoleku żelaza na kilogram masy ciała myszy. Następnie zanurz ogon znieczulonego zwierzęcia w ciepłej wodzie o temperaturze od 30 do 35 stopni Celsjusza na 30 sekund, aby rozszerzyć żyły ogonowe. Następnie zetrzyj nadmiar wody z ogona i oczyść miejsce wstrzyknięcia chusteczką nasączoną 70% alkoholem.

Teraz włóż igłę pod kątem do góry do bocznej żyły ogonowej mniej więcej w połowie ogona. Lekko odciągnąć tłok, aby potwierdzić umieszczenie go z cofnięciem się krwi do igły. Po udanym wprowadzeniu należy wstrzykiwać nanolek równomiernie, powoli przez około 5 do 10 sekund, aby uzyskać wstrzyknięcie o objętości 40 mikrolitrów.

Skuteczne wstrzyknięcie należy potwierdzić na podstawie braku gromadzenia się roztworu pod skórą ogona w pobliżu miejsca wstrzyknięcia oraz przez ciemnienie żyły od ciemnego roztworu nanocząstek. Uciskać miejsce wstrzyknięcia gazą i wyjąć igłę. Utrzymuj ciśnienie przez około 30 sekund, aż krwawienie ustanie.

Aby pobrać próbki z przerzutami, zacznij od obrazowania myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Po pobraniu przerzutów należy umieścić pobrane tkanki na szalce Petriego. W oprogramowaniu systemu obrazowania ustaw Ekspozycja na Auto, Binning na Średnia, FStop na 1, Wzbudzenie na Blok, Emisja na Otwarta, FOV na D i Wysokość na 1.50 dla obrazowania bioluminescencyjnego.

W przypadku obrazowania fluorescencyjnego ustaw Ekspozycja na Auto, Binning na Średni, FStop na 1, Wzbudzenie na 675, Emisja na 720, Poziom lampy na Wysoki, FOV na D, Wysokość na 1.50. Następnie zobrazuj tuszę myszy za pomocą BLI, aby określić, czy pozostała tkanka rakowa warta zebrania. Następnie przepłucz pobrane tkanki rakowe w PBS.

Aby pobrać tkanki do mikroskopii lub ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją, należy je zanurzyć w związku o optymalnej temperaturze cięcia i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do przetworzenia. Aby pobrać tkanki do optycznej spektroskopii emisyjnej z plazmą sprzężoną indukcyjnie, należy wytarować wagę za pomocą pustej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Umieść chusteczkę w probówce i zapisz jej wagę.

Po zamrożeniu tkanki przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do przetworzenia. Kriosekcja: optymalna temperatura skrawania, osadzone świeżo zamrożone próbki na szkiełkach mikroskopowych o grubości 10 mikrometrów. Dostosuj temperaturę komory i uchwytu próbki w zakresie od minus 20 stopni Celsjusza do minus 15 stopni Celsjusza, w zależności od rodzaju tkanki.

Przymocuj skrawki tkanek do szkiełek, zanurzając je w 4% roztworze paraformaldehydu na 15 minut. Ostrożnie przepłukać szkiełka PBS. Następnie zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą podłoża zawierającego DAPI, aby zobrazować architekturę tkanki.

Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać skrawki tkanek pod kątem fluorescencji Cy5.5, która wskazuje na dostarczenie nanoleku. Potwierdzić, że sygnał fluorescencyjny nie jest szumem tła, porównując go z próbką kontroli ujemnej od zwierzęcia, któremu nie wstrzyknięto. Myszy leczone nanolekiem wykazywały znaczące sygnały bioluminescencyjne w przerzutach do płuc tydzień po podaniu, potwierdzając obecność przerzutów w tkankach płucnych.

Obrazowanie fluorescencyjne potwierdziło akumulację Cy5.5 z nanoleku tylko w przerzutowych tkankach płucnych leczonych myszy.