Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

W badaniu tym wprowadzono manipulację chirurgiczną w celu odsłonięcia DRG klatki piersiowej u znieczulonych myszy w celu obrazowania wapnia in vivo wraz ze zsynchronizowanym zapisem elektrokardiogramu. W ten sposób próbujemy odpowiedzieć na pytanie, czy akupunktura na PC6 na otworze może aktywować neuron DRG i jednocześnie regulować elektrokardiogram. Techniki stosowane obecnie w badaniach akupunktury obejmują elektrofizjologię in vivo lub vitro, śledzenie neuronalne oraz różne strategie w połączeniu z optogenetyką i chemogenetyką.

Obrazowanie wapnia in vivo wprowadzone w tym badaniu pomaga lepiej zrozumieć aktywność populacji neuronów DRG indukowaną przez akupunkturę, wszystkie w różnych modelach zwierzęcych, dzięki dynamicznym zapisom w czasie rzeczywistym. Ze względu na fizjologiczną krzywiznę kręgosłupa piersiowego w odcinku piersiowym od jednego do pięciu segmentów kręgów, DRG klatki piersiowej są dość trudne do odsłonięcia. Poza tym wpływ rytmów serca i płuc powoduje, że utrwalenie DRG klatki piersiowej jest trudne.

W przeciwnym razie znieczulenie oddechowe i utrzymanie stanu myszy przez wiele godzin nie jest łatwe. Obrazowanie wapnia in vivo ujawnia aktywność określonych populacji neuronów przy użyciu myszy inżynierii genetycznej. Jest to pierwszy raz, kiedy neurony DRG klatki piersiowej zostały zaobserwowane in vivo.

Podejście to realizuje obserwację aktywności neuronalnej wytwarzanej przez stymulacje somatyczne lub trzewne, a także ich przesłuchów. Nasze laboratorium opracowało metody obrazowania in vivo wapnia DRG klatki piersiowej i odcinka lędźwiowego, a w przyszłości dokonamy przeglądu receptorów związanych z czynnikami inicjującymi akupunkturę, nadwrażliwością accupoints, interakcjami między stymulacją akupunktury somatycznej a bodźcami trzewnymi. Po wykonaniu tracheotomii na znieczulonej myszy umieść mysz w pozycji leżącej na podgrzewanej podkładce.

Wykonaj dwucentymetrowe podłużne nacięcie na środku karku, rozciągające się od sześciu kręgów szyjnych do trzech kręgów piersiowych. Ostrożnie oddziel gruczoły tłuszczowe i hibernacyjne w przedniej części kręgów piersiowych myszy, unikając naczyń krwionośnych pod gruczołami. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć skórę i warstwy mięśni, w tym mięsień czworoboczny.

Włóż retraktor między mięśnie, aby pomóc w dalszej ekspozycji. Usuń mięśnie przyczepiające się do zacisku głowy i prostą część długich mięśni szyi, odsłaniając wyrostki kolczyste klatki piersiowej dwójki. Przemieszczenie mięśni półrdzeniowych i rdzeniowych, aby odsłonić łuk kręgowy od C6 do T3. Przeciąć połączenie między płytką łuku kręgowego a wyrostkiem stawowym klatki piersiowej.

Użyj cienkich kleszczy, aby skrupulatnie usunąć lewy i prawy wyrostek stawowy oraz wyrostki sutkowe klatki piersiowej. Usuń leżącą nad nim tkankę łączną. Ostrożnie odsłoń lewy lub prawy zwój korzenia grzbietowego lub DRG, zapewniając integralność epineurium po wybranej stronie.

Umieść mały wacik nasączony ciepłą solą fizjologiczną na odsłoniętym DRG, aby utrzymać wilgoć. Podłącz monitor EKG do bieguna ujemnego na prawej kończynie górnej, przewodu uziemiającego na prawej kończynie dolnej i bieguna dodatniego na lewej kończynie dolnej. Umieść mysz na stoliku niestandardowego zacisku kręgosłupa z poduszką grzewczą.

Zabezpiecz mysz za pomocą dwóch klipsów przymocowanych do wyrostków stawowych szyjki macicy szóstej i klatki piersiowej trzeciej. Umieść zacisk kręgosłupa z zabezpieczoną myszą pod mikroskopem konfokalnym. Umieść obiektyw powietrzny o dużej odległości roboczej 10x/0.32 nad odsłoniętym klatką piersiową 1 DRG.

Ustaw rozmiar kroku na 25 mikrometrów i rozdzielczość 512 na 512 lub 1 024 na 1 024 piksele. Dostosuj oś z stolika w górę iw dół i uchwyć całą klatkę piersiową 1 DRG. Zastosuj stymulację pędzlem do kończyny górnej myszy i oceń reakcję obrazowanych neuronów DRG.

Wykonaj stymulację nerwów obwodowych przy stymulacji PC6 za pomocą stymulatora. W warunkach wyjściowych większość neuronów w klatce piersiowej 1 DRG nie wykazywała fluorescencji GFP. Stymulacja somatyczna powodowała szybki i przejściowy wzrost fluorescencji GCaMP wraz ze wzrostem liczby i intensywności GFP.

Stymulacja nerwów obwodowych przy aplikacji PC6 powodowała podobne zmiany we fluorescencji GCaMP jak stymulacja somatyczna. Neurony zostały oznaczone i ponumerowane w obrębie pojedynczego 1 DRG klatki piersiowej po prześledzeniu za pomocą oprogramowania do obrazowania. Neurony wykazujące zmiany intensywności fluorescencji przekraczające 130% progu F0 uznano za pozytywne odpowiedzi.

Histogram pokazywał różne średnice neuronów reagujących na stymulację nerwów obwodowych w PC6. Stymulacje nerwów obwodowych podczas stymulacji PC6 wykazały zwiększoną częstość akcji serca.