Name: Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Odkryj model raka nerki na chipie wykorzystujący mikroprzepływ i bioprinting 3D do badania interakcji między zdrowymi a nowotworowymi komórkami nerek. Ta metoda pozwala symulować warunki in vivo i analizować zmiany ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Maryna Somova była wspierana przez Stypendium Doktoranckie Uniwersytetu w Greifswaldzie - Landesgraduiertenförderungsgesetzes (Ustawa o państwowym finansowaniu absolwentów) Meklemburgii-Pomorza Przedniego. Autorzy chcieliby podziękować dr Janoshowi Schoonowi i Dirkowi Stobe z Centrum Ortopedii, Chirurgii Urazowej i Medycyny Rehabilitacyjnej Uniwersytetu Medycznego w Greifswaldzie za ich spostrzeżenia na temat hodowli komórek 3D i przygotowania próbek.

UWAGA: Niniejsze protokoły przedstawiają kompleksowe kroki przygotowania trójwymiarowych żeli kolagenowo-agarozowych, wstrzykiwania komórek, perfuzji próbek oraz ich ekstrakcji do dalszej analizy. Należy dostosować czasy i warunki inkubacji do konkretnych wymagań eksperymentalnych.
1. Przygotowanie matrycy żelowej z kolagenu i agarozy
<ol>
	<li>Drukowanie 3D 
	UWAGA: Aby uzyskać odpowiedni kształt macierzy żelowej, opracowaliśmy unikalną konstrukcję komory, która nadaje żelowi fizjologicznie istotną formę organoidu (patrz Supplemental File 1).
	<ol>
		<li>Zaprojektować komory przy użyciu oprogramowania do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD). Komora składa się z czterech równoległych przedziałów: dwóch przedziałów komórkowych, jednego przedziału macierzy oraz łączącego je kanału (Rysunek 1 oraz Rysunek 2).</li>
		<li>Wytworzyć komory metodą druku 3D; grzejąca dysza topi filament z bioplastiku i nakłada go warstwa po warstwie. W celu wykonania niniejszego protokołu należy użyć polipropylenu (PP), nietoksycznego filamentu bioplastycznego, oraz drukarki 3D typu kartezjańskiego (nazwanej od układu współrzędnych XYZ).</li>
		<li>Dodać element w kształcie odwróconego stożka do przedziałów komórkowych, aby skierować komórki do kanału.</li>
		<li>Nadać przedziałowi macierzy kształt okrągły, co jest kluczowe dla formowania żelu kolagenowego.</li>
		<li>Połączyć przedziały komórkowe i macierzy kanałem (średnica 0.04 mm, Rysunek 3B), umożliwiając przepływ komórek z przedziału komórkowego do przedziału macierzy i ich przyleganie do powierzchni rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie macierzy kolagenowej do hodowli komórek RPTEC-TERT1 
	UWAGA: Procedura ta zapewnia prawidłowe przygotowanie macierzy kolagenowej i jej wprowadzenie do komory, tworząc odpowiednie środowisko do późniejszej iniekcji i hodowli komórek RPTEC/TERT1 oraz wzrostu trójwymiarowej struktury komórkowej. Należy upewnić się, że wszystkie etapy są wykonywane w warunkach sterylnych, aby uniknąć kontaminacji.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór sieciujący, mieszając 50 µL genipiny (30 mM) z 50 µL NaOH (1 M) za pomocą vortexa, aby zapewnić dokładne wymieszanie.</li>
		<li>Dodać 1 000 µL kolagenu typu I do przygotowanego roztworu genipiny i NaOH, utrzymując mieszaninę w lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu. Ponownie wymieszać roztwór za pomocą vortexa w celu uzyskania homogenicznej mieszaniny. 
		​UWAGA: Przygotowany roztwór należy stale przechowywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu.</li>
		<li>Za pomocą końcówki do pipety 1 000 µL pobrać cały przygotowany roztwór i dodać 150-200 µL roztworu do przedziału macierzy w wydrukowanej w 3D komorze.</li>
		<li>Pozostawić macierz do polimeryzacji, przechowując komorę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 ᵒC przez 60-90 min. Na powierzchnię macierzy dodać 150 µL pożywki hodowlanej i pozostawić w inkubatorze na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie macierzy kolagenowo-agarozowej i osadzanie komórek Caki-1 
	UWAGA: Zarówno komórki RPTEC/TERT1, jak i Caki-1 hodowano w tej samej pożywce, składającej się z pożywki DMEM F-12 z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o ITS (10 µg/mL insuliny, 5.5 µg/mL transferyny i 5 ng/mL selenianu sodu), 10 ng/mL czynnika wzrostu naskórka (EGF), 36 ng/mL hydrokortyzonu, 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny (5% v/v) oraz 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS).
	<ol>
		<li>Rozpuścić proszek agarozy w sterylnej wodzie lub DPBS, aby uzyskać stężenie końcowe 2%. Umieścić roztwór agarozy na bloku grzejnym ustawionym na 85 ᵒC, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. 
		UWAGA: Z roztworem agarozy należy obchodzić się ostrożnie ze względu na jego wrażliwość termiczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie komórek Caki-1
	<ol>
		<li>Oddzielić komórki Caki-1 z kolb hodowlanych poprzez dodanie 1x trypsyny-EDTA i inkubację w temperaturze 37 °C do momentu odklejenia się komórek. Zneutralizować 1x trypsynę, dodając równą objętość pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę komórkową, policzyć komórki i odwirować przy 2 500 × g przez 5 min. Odrzucić nadsącz i resuspender osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej do stężenia końcowego 1 × 103 komórek/mL (Caki-1). 
		UWAGA: Przed wprowadzeniem do komory należy upewnić się, że zawiesina komórkowa jest dokładnie wymieszana i nie zawiera grudek.</li>
		<li>Dodać 25 µL zawiesiny komórkowej do probówki mikroodwirowywczej o pojemności 1,5 mL. 
		UWAGA: Należy upewnić się, że strzykawka lub pipeta jest sterylna i odpowiednia do pracy z komórkami.</li>
		<li>Dodać 75 µL kolagenu typu I do probówki z zawiesiną komórkową i wymieszać na vortexie. 
		UWAGA: Mieszaninę należy stale przechowywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu.</li>
		<li>Dodać 100 µL stopionego 2% żelu agarozowego i ostrożnie mieszać na vortexie, aż żel stanie się homogeniczny. 
		UWAGA: Należy zapewnić równomierny rozkład komórek w żelu. Unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas iniekcji, ponieważ mogą one zaburzyć rozkład komórek i integralność żelu!</li>
		<li>Po 1 h dodać 150 µL pożywki komórkowej na powierzchnię macierzy i wyjąć ją z komory za pomocą szpatułki. Umieścić trójwymiarowe macierze z komórkami w płytce 24-dołkowej z 1 000 µL pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat modelowania 3D przedstawiający projekt i wymiary formy dla procesu mikrofabrykacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Projekt komory drukowanej w 3D do rekonstrukcji kanalików nerkowych. (A,B) Przedstawienie komory drukowanej w 3D, zaprojektowanej tak, aby pomieścić sieciowaną matrycę kolagenową do rekonstrukcji kanalików nerkowych. Każda komora składa się z czterech oddzielnych przedziałów, które służą do wytwarzania równych ilości żeli. 1-punkt wprowadzenia filamentu, 2-przedsionki, które należy wypełnić samym agarem w celu zapobiegania wyciekom, 3-komora kolagenowa, 4-komora komórkowa. (C) Wymiary sieciowanego żelu kolagenowego i zatopionego kanalika nerkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Etapy eksperymentu z hodowlą komórkową; sprzęt, pipetowanie do studni, inkubacja, przygotowanie próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie żeli kolagenowych i agarowo-kolagenowych. (A) Wydrukowana w 3D komora z włożonymi filamentami. (B) Rozwiązanie kolagenu sieciowanego jest dozowane do studni komory (C) Komora wypełniona roztworem kolagenu zostaje umieszczona w inkubatorze w celu przeprowadzenia polimeryzacji macierzy (D) Zbiór komórek RPTEC-TERT1 przed wstrzyknięciem do macierzy kolagenowej (E) Dodawanie zawiesiny komórek do przedziału komórkowego komory (F) Usuwanie filamentu za pomocą pęsety, co umożliwia komórkom zasiedlenie pustej struktury rurkowej wewnątrz macierzy (G) Zawiesina komórek RCC zmieszana z kolagenem w probówce 1.5mL (H) Dodanie 2% roztworu agaru do komórek w celu wytworzenia żelu RCC. (I) Żele są umieszczane w inkubatorze w celu przeprowadzenia żelowania macierzy (J,K,L) Usuwanie spolimeryzowanego żelu kolagenowego z kanalikami nerkowymi z wydrukowanej w 3D komory za pomocą szpatułki i umieszczanie ich na płytce 24-dołkowej przed dalszą obróbką (M,N,O) Usuwanie spolimeryzowanego żelu kolagenowo-agarowego z komórkami RCC za pomocą szpatułki i umieszczanie ich na płytce 24-dołkowej przed dalszą obróbką <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment z hodowlą komórkową; proces obejmuje pipetowanie, uszczelnianie, inkubację; analiza obejmuje wyświetlanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67456/67456fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Montaż mikrofluidycznego systemu hodowlanego. (A,B) Otwieranie komór hodowlanych chipa Humimic chip2 przy użyciu dedykowanego narzędzia (C) Po usunięciu pożywek hodowlanych użytych do przemycia chipa, dodaj 400 μL świeżej pożywki hodowlanej. (D,E) Po usunięciu żeli nerkowych i RCC z odpowiednich płytek 24-dołkowych, umieść każdy żel w komorze hodowlanej pojedynczego obwodu perfuzyjnego chipa Humimic, używając szpatułek do przenoszenia żeli. (F,G) Po umieszczeniu żeli w chipie, komory hodowlane są uszczelniane, a chip zostaje połączony z jednostką perfuzyjną za pomocą trzech mikropomp w każdym obwodzie mikrofluidycznym, połączonych specjalistycznymi rurkami. (H) Chipy są umieszczane w inkubatorze na czas trwania okresu hodowli (I) Parametry perfuzji ustawione w jednostce sterującej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67456/67456fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
2. Iniekcja komórek RPTEC/TERT1
<ol>
	<li>Iniekcja komórek RPTEC/TERT1
	<ol>
		<li>Odczepić komórki RPTEC/TERT1 z kolb hodowlanych poprzez dodanie 1x trypsyny-EDTA i inkubację w 37 °C aż do odczepienia się komórek.</li>
		<li>Zneutralizować 1x trypsynę, dodając taką samą objętość pożywki hodowlanej z suplementami. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 2 500 × g przez 5 min.</li>
		<li>Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 1 × 106 komórek/mL (RPTEC/TERT1). Przed wprowadzeniem do komory upewnić się, że zawiesina komórkowa jest dokładnie wymieszana i nie zawiera grudek.</li>
		<li>Nabrać 10 µL przygotowanej zawiesiny komórkowej do mikropipety z końcówką 10 µL. Upewnić się, że pipeta jest sterylna i odpowiednia do pracy z komórkami. Ostrożnie wstrzyknąć zawiesinę komórkową do zestalonego kolagenu (krok 1.2.4) przez przedział komórkowy wewnątrz komory.</li>
		<li>Delikatnie usunąć filament za pomocą pęsety, umożliwiając komórkom zasiedlenie pustej struktury rurkowej wewnątrz macierzy. 
		UWAGA: Zapewnić równomierny rozkład komórek w żelu. Unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas iniekcji, ponieważ mogą one zaburzyć rozkład komórek i integralność żelu.</li>
		<li>Umieścić komory w inkubatorze w 37 °C i 5% CO2. Po 60 min dodać 150 µL pożywki komórkowej na wierzch macierzy, aby zapobiec wysychaniu. Inkubować przez 24 h, aby umożliwić komórkom aklimatyzację i integrację z macierzą żelową.</li>
		<li>Następnego dnia wyjąć macierz z komory za pomocą szpatułki. Umieścić macierze 3D z komórkami w płytce 24-dołkowej z 1 000 µL pożywki hodowlanej i inkubować w 37 °C i 5% CO2. 
		UWAGA: Żele przygotowane z odtworzoną cewką nerkową oraz z zatopionymi sferoidami RCC zostaną dodane do systemu mikroprzepływowego w celu kokultury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Perfuzja 3D próbek komórkowych
<ol>
	<li>Perfuzja komórek 3D w systemie chipu wieloorganowego
	<ol>
		<li>Połączyć chip z komórkami 3D z systemem perfuzyjnym za pomocą rurek.</li>
		<li>Skonfigurować system: Częstotliwość: 0,25 Hz, Próżnia: -220 mbar, Ciśnienie: 800 mbar, a następnie podłączyć chip 2 do systemu (Rysunek 3).</li>
		<li>Kultywować dynamiczną hodowlę komórek 3D przez 5 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pobieranie trójwymiarowych próbek komórkowych po perfuzji
<ol>
	<li>Zbiór i analiza po perfuzji
	<ol>
		<li>Wyjąć żele z systemu perfuzyjnego i opłukać je PBS.</li>
		<li>Utrwalić żele, umieszczając próbki w 2% paraformaldehydzie przez 2-3 h w temperaturze pokojowej. Próbki utrwalone przechowywać w 4 ºC.</li>
		<li>Przebarwić żele odpowiednimi barwnikami (np. Hoechst33342, falloidyną, ZO1, tubuliną).</li>
		<li>Po 5 dniach perfuzji z wykorzystaniem wieloorganowego systemu na chipie, w celu oceny żywotności komórek, morfologii, poziomów ekspresji genów oraz dostosowań funkcjonalnych, przeprowadzono różne analizy i metody na 3D hodowlach komórkowych oraz zebranych mediach. Komórki RPTEC/TERT1 w macierzy żelu kolagenowego oraz komórki Caki-1 w macierzy kolagenowo-agarozowej utrzymują wysoką żywotność; potwierdzić to za pomocą testów żywotności, takich jak barwienie live/dead.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Renal Cancer and Healthy Tissue Co-Culture Using Microphysiological Systems

<ol><li>Ainslie, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+lung+models+to+evaluate+the+safety+of+new+pharmaceutical+modalities%3A+A+biopharmaceutical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microphysiological lung models to evaluate the safety of new pharmaceutical modalities: A biopharmaceutical perspective.</a> Lab Chip. 19 (19), 3152-3161 (2019).</li>
<li>Van Ness, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+systems+to+assess+nonclinical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity.</a> Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).</li>
<li>Majo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+extracellular+matrix+components+to+renal+cell+carcinoma+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of extracellular matrix components to renal cell carcinoma behavior.</a> Front Oncol. 10, 625(2020).</li>
<li>Caetano-Pinto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+the+basolateral+uptake+of+phosphorothioate-modified+antisense+oligonucleotides+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Organs-on-a-Chip%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates the basolateral uptake of phosphorothioate-modified antisense oligonucleotides in the kidney.</a> Organs-on-a-Chip. 4, 100022(2022).</li>
<li>Manduca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>Simon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RPTEC%2FTERT1+cell+line+models+key+renal+cell+responses+to+the+environmental+toxicants%2C+benzo%5Ba%5Dpyrene+and+cadmium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Rep%22%5BJournal%5D)">The RPTEC/TERT1 cell line models key renal cell responses to the environmental toxicants, benzo[a]pyrene and cadmium.</a> Toxicol Rep. 1, 231-242 (2014).</li>
<li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+high+integrity+RNA+extraction+from+cell%2Fagarose+construct%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Methods of high integrity RNA extraction from cell/agarose construct.</a> BMC Res Notes. 8, 644(2015).</li>
<li>Glube, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caki-1+cells+represent+an+in+vitro+model+system+for+studying+the+human+proximal+tubule+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Exp+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Caki-1 cells represent an in vitro model system for studying the human proximal tubule epithelium.</a> Nephron Exp Nephrol. 107 (2), e47-e56 (2007).</li>
<li>Kühnl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+application+scenario-dependent+pharmacokinetics+and+pharmacodynamic+properties+of+permethrin+and+hyperforin+in+a+dynamic+skin+and+liver+multi-organ-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of application scenario-dependent pharmacokinetics and pharmacodynamic properties of permethrin and hyperforin in a dynamic skin and liver multi-organ-chip model.</a> Toxicology. 448, 152637(2021).</li>
<li>Padmyastuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-based+prostate+cancer+model+for+investigating+the+secretion+of+prostate-specific+antigen+and+microRNAs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-based prostate cancer model for investigating the secretion of prostate-specific antigen and microRNAs in vitro.</a> Sci Rep. 13 (1), 11623(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-on-a-Chip%3A+Models+for+studying+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cancer-on-a-Chip: Models for studying metastasis.</a> Cancers (Basel). 14 (3), 648(2022).</li>
<li>Sobczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+animal+model+for+renal+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Choosing the right animal model for renal cancer research.</a> Transl Oncol. 13 (3), 100745(2020).</li>
<li>Ewart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+assessment+and+economic+analysis+of+a+human+Liver-Chip+for+predictive+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Med%22%5BJournal%5D)">Performance assessment and economic analysis of a human Liver-Chip for predictive toxicology.</a> Commun Med. 2 (1), 154(2022).</li>
<li>Caetano-Pinto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+cancer+and+chronic+kidney+disease%3A+Too+close+for+comfort%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Kidney cancer and chronic kidney disease: Too close for comfort.</a> Biomedicines. 9 (12), 1761(2021).</li>
<li>Del Piccolo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-on-chip+modeling+of+organ-specific+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis.</a> Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798(2021).</li>
<li>Soo, J. Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+predictive+in+vitro+models+of+drug-induced+nephrotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advances in predictive in vitro models of drug-induced nephrotoxicity.</a> Nat Rev Nephrol. 14 (6), 378-393 (2018).</li>
<li>Chapron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+vascularized%2C+dual-channel+microphysiological+system+facilitates+modeling+of+proximal+tubular+solute+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion.</a> ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Protokół opisany w niniejszym badaniu przedstawia opracowanie złożonego modelu raka nerki, wykorzystującego integrację dwóch różnych typów komórek – nabłonkowych komórek cewek bliższych nerek (RPTEC/TERT1) oraz komórek raka jasnokomórkowego nerki (Caki-1) – w specyficznych macierzach z żelu kolagenowego i kolagenowo-agarozowego w systemie mikrofluidycznym. Przygotowanie żeli kolagenowych jest kluczowe dla sukcesu tego modelu. Precyzyjne stężenie kolagenu i agarozy jest niezbędne do zachowania integralności strukturalnej ...

Postępy w systemach hodowli komórkowych 3D zrewolucjonizowały inżynierię tkankową i medycynę regeneracyjną, oferując bardziej fizjologicznie istotne modele w porównaniu z tradycyjnymi kulturami 2D1,2. W tym badaniu użyliśmy matryc kolagenowych i żelowych kolagenowo-agarozowych, biorąc pod uwagę ich zdolność do naśladowania środowiska macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), promując dokładniejsze zachowanie i funkcję komórkową, a jednocześnie będąc zgodnym z zastosowanymi dynamicznymi warunkami hodowli. 
Kolagen, najobficiej występujące białko w ECM, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności strukturalnej i aktywności biologicznej tkanek3. Kolagen typu I, powszechnie pozyskiwany z ogona szczura, był faworyzowany ze względu na swoją biokompatybilność i możliwość dostosowania do różnych warunków sztywności matrycy, a także zapewnienie sprawdzonego substratu dla komórek nabłonkowych4. W macierzy kolagenowej 3D komórki nerkowe są wyposażone w rusztowanie, które wspomaga ich adhezję, proliferację i różnicowanie. To środowisko umożliwia komórkom wykazywanie bardziej naturalnych morfologii i zachowań, w tym wzorców ekspresji genów i interakcji komórkowych, które odzwierciedlają warunki in vivo5. W związku z tym żele kolagenowe są szeroko wykorzystywane w różnych zastosowaniach, od badań nad rakiem po inżynierię tkankową, ze względu na ich zdolność do replikowania wspierających i regulacyjnych ról ECM. 
Nieunieśmiertelniona linia komórkowa nabłonka kanalików proksymalnych nerek RPTEC/TERT1 została użyta do reprezentowania zdrowego nabłonka nerki. Ta linia komórkowa wykazuje nadekspresję odwrotnej transkryptazy ludzkiej telomerazy, umożliwiając jej namnażanie się w hodowli, przy jednoczesnym zachowaniu reprezentatywnego fenotypu RPTEC. Do odtworzenia mikrośrodowiska nerkowego wykorzystano matrycę żelową kolagenu typu I z ogona szczura. Ta matryca żelu kolagenowego wspiera komórki RPTEC/TERT16 w utrzymaniu ich natywnych cech i funkcji fizjologicznych. Natomiast hybrydowa matryca żelowa kolagenowo-agarozowa jest wykorzystywana do hodowli komórek raka nerkowokomórkowego (Caki-1). Agaroza, polisacharyd pochodzący z wodorostów, nadaje kolejny wymiar systemom hodowli komórkowych 3D. Jest termicznie odwracalny, co pozwala na łatwą obsługę i manipulację podczas procesu przygotowania7. Żele agarozowe zapewniają neutralną macierz podporową, która utrzymuje żywotność komórek i sprzyja tworzeniu złożonych struktur poprzez proliferację komórek rakowych. W połączeniu z kolagenem, powstały żel hybrydowy wykorzystuje biochemiczne sygnały z kolagenu i wsparcie strukturalne z agarozy. Ta kombinacja tworzy odpowiednie mikrośrodowisko dla komórek raka nerkowokomórkowego (RCC) Caki-1 cells8 do wzrostu w sferoidy i jest stosowana jako model raka nerki. 
Użycie tych różnych matryc 3D dla komórek RPTEC/TERT1 i Caki-1 podkreśla znaczenie dostosowania środowiska ECM do specyficznych potrzeb różnych typów komórek. Żele zawierające RPTEC, reprezentujące zdrowy nabłonek nerki, lub komórki Caki-1, reprezentujące RCC, połączono w system mikroprzepływowy, który recyrkuluje pożywkę hodowlaną między komórkami, skutecznie wystawiając zdrowy model komórek nerkowych na wydzieliny RCC, bez bezpośredniego kontaktu. Platforma TissUse HUMUMIC < klasa sup = 'xref'>9,< klasa sup = 'xref'>10 (odtąd nazywana wielonarządową platformą chipową) zastosowana w tym badaniu składa się z chipa mikrofizjologicznego z dwoma niezależnymi obwodami płynowymi, z przepływem napędzanym przez zewnętrzną jednostkę perfuzyjną.

<table><tbody><tr><td>1,5-2,0 ml&nbsp; probówki&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>003012/10237-20205</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe&nbsp;</td>Drukarka 3D <td>Sarstedt</td><td>83.3922.500</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Prusa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>3810.3</td><td></td></tr><tr><td>AutoDesk Tinker Oprogramowanie</td><td></td><td></td> CAD <td>oprogramowanie do projektowania wspomaganego komputerowo</td></tr><tr><td>Komórki Caki-1&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-46</td><td></td></tr><tr><td>Aktywność kaspazy</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td>Test kaspazy 3/7</td></tr><tr><td>Żywotność komórek</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>Test miana komórek Glo</td></tr><tr><td>Kolagen typu I &ndash; ogon szczura, 3,0 mg / ml</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/12F Średnie&nbsp;</td><td>Rozwiązanie PAN Biotech</td><td>PO4-41650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu Merck</td><td>&nbsp;</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3033</td><td></td></tr><tr><td>Genipin (30 mM)&nbsp;</td><td>Firma Merck&nbsp;</td><td>Chipy G4796</td><td></td></tr><tr><td>HUMIMIC 2&nbsp;</td><td>Wielonarządowa jednostka</td>sterująca <td>HUMIMIC TissUse</td><td></td></tr><tr><td>Chips&nbsp;</td><td>Wielonarządowa jednostka sterująca chipami</td> <td>TissUse</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Hydrokortyzon&nbsp;</td><td>Firma Merck&nbsp;</td><td>Inkubator H6909</td><td></td></tr><tr><td>(37 &deg; C, 5% CO2)&nbsp;</td><td>nd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina,Selenin sodu,Transferyna (IST)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>LDH release</td><td>Promega</td><td>J2380</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa szpatułka&nbsp;</td><td>nd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH (1 M)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>P031.2</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Włókno polipropylenowe (PP)&nbsp;</td><td>Verbatin</td><td>55952</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do łatwej ekstrakcji RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Komórki RPTEC/TERT&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL - 4031</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY210-05</td><td></td></tr><tr><td>Trójjodotyronina (T3 )</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>709611</tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-021100</td><td></td></tr></tbody></table>

kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Microfluidic Co-culture of Renal Healthy and Tumor Epithelium to Model Kidney Cancer Progression

Systemy mikrofizjologiczne (MPS) umożliwiły wprowadzenie bardziej złożonych i istotnych elementów fizjologicznych do modeli in vitro, odtwarzając skomplikowane cechy morfologiczne w trójwymiarowych środowiskach z dynamicznymi interakcjami, których brakuje w konwencjonalnych modelach. Wdrożyliśmy model kohodowli raka nerkowokomórkowego (RCC), aby odtworzyć wzajemne oddziaływanie między zdrową i złośliwą tkanką nerkową. 
Ten model jest oparty na wspomnianej platformie wielonarządowej i składa się z ko-hodowli zrekonstruowanego kanalika nerkowego proksymalnego ze sferoidami RCC. Specjalnie zaprojektowane komory wydrukowane w 3D wykorzystano do hodowli komórek kanalików proksymalnych ludzkiego nabłonka nerkowego (RPTEC) i ułatwienia ich samoorganizacji do kanalika nerkowego zawartego w matrycy kolagenu typu I. Komórki RCC Caki-1 zostały osadzone w matrycy kolagenu agarowego, a następnie utworzyły sferoidy raka. Zarówno kolagen, jak i żele agarowo-kolagenowe zostały zoptymalizowane tak, aby zachować ich integralność podczas cyklicznej perfuzji i wytrzymać naprężenia ścinające podczas minimalnego okresu hodowli wynoszącego 7 dni. 
Żele umożliwiają również odpowiednie zaopatrzenie w składniki odżywcze i wydzielanie komórek. Co więcej, żele agarowo-kolagenowe ograniczają nadmierną proliferację komórek RCC, zapewniając stosunkowo jednorodny rozmiar sferoidów. Obwody mikroprzepływowe układu MPS składają się z dwóch niezależnych komór hodowlanych o wielkości standardowej studzienki na 96 mikropłytek. Kanaliki nerkowe i żele RCC wypełniają oddzielne komory i dzielą tę samą pożywkę hodowlaną, która jest recyrkulowana około dwa razy na minutę. W tych warunkach zaobserwowaliśmy zwiększenie ekspresji i wydzielania czynników immunologicznych w kanalikach nerkowych (interleukina-8 i czynnik martwicy nowotworu-alfa). Kanaliki nerkowe również przenoszą swoją aktywność metaboliczną w kierunku glikolizy pod wpływem RCC. To nowatorskie podejście pokazuje, że MPS oparty na wspólnej hodowli może zwiększyć złożoność RCC in vitro i zostać wykorzystany do badania wpływu raka na komórki nienowotworowe.

System HUMIMIC zapewnia dynamiczne środowisko umożliwiające ciągłe dostarczanie składników odżywczych i tlenu przy jednoczesnym usuwaniu produktów przemiany materii, co pozwala na utrzymanie żywotności i funkcji komórek przez dłuższy czas. Systemy te są szczególnie przydatne przy tworzeniu złożonych modeli organ-on-a-chip, które odwzorowują mikrośrodowisko specyficznych tkanek. Został on zaprojektowany specjalnie do zastosowań typu organ-on-a-chip i umożliwia precyzyjną kontrolę przepływu płynów oraz naprężenia ścinające...

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Microphysiological systems (MPS) have enabled the introduction of more complex and relevant physiological elements into in vitro models, recreating ...

W naszych badaniach wykorzystujemy model raka nerki na chipie, aby zbadać interakcje między zdrowymi i nowotworowymi komórkami nerkowymi. Ten system pomaga nam odtworzyć stan in viva, który umożliwia nam badanie zmian w ekspresji genów, stanie zapalnym i metabolizmie spowodowanych nowotworem. Zapewnia również bardzo wyraźny wgląd w progresję raka nerki, a także jego wpływ na otaczające zdrowe tkanki.Zaawansowany system raka nerki na chipie wykorzystuje wiele podejść, takich jak mikrofluidyka, biodruk 3D, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, biosensory w czasie rzeczywistym, sekwencjonowanie RNA i badania przesiewowe CRISPR. Technologie te pozwalają nam stworzyć naprawdę precyzyjną symulację chorób nerek in viva, która pozwala nam badać odpowiedzi komórkowe i zmiany ekspresji genów. Osiągnięcie powtarzalności w eksperymentach mikroprzepływowych jest bardzo trudne.Kwestie techniczne, takie jak precyzyjne obchodzenie się z cieczami, mogą prowadzić do zmienności wyników. Ponadto złożone protokoły, wahania natężenia przepływu i warunki środowiskowe dodatkowo wpływają na spójne wyniki. Nasze nadchodzące badania będą koncentrować się na identyfikacji sygnatur mikro RNA związanych z prog

microfluidic-co-culture-renal-healthy-tumor-epithelium-to-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Inżynierskie konstrukty nerkowe dostarczają rozwiązania na niedobór narządów i szkodliwe skutki dializy. W tym miejscu opisujemy protokół mikropreparacji mysich nerek w celu izolacji segmentów korowo-rdzeniowych. Segmenty te są wszczepiane do konstruktów komórkowych wolnych od rusztowań, tworząc organoidy nerkowe.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Hodowle kanalików nerkowych stanowią cenny model in vitro do badania fizjologii i chorób nerek. Kanaliki można ustalić z tkanki nerkowej (zdrowej i chorej), a także z moczu, który stanowi łatwo dostępne i mniej inwazyjne źródło materiału badawczego.

Wytwarzanie ludzkich kanalików nerkowych z tkanek i moczu

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

W tym miejscu opisujemy protokoły uzyskiwania pierwotnych kultur ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) z kory nerkowej w celu opracowania monowarstwowych i trójwymiarowych kultur na macierzy zewnątrzkomórkowej (3D-HRTEC).

Rozwój hodowli pierwotnych komórek nabłonka ludzkich kanalików nerkowych w warunkach jednowarstwowych i trójwymiarowych

Przedstawiamy zoptymalizowany protokół przetwarzania całych ludzkich nerek w celu izolacji i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych kanałów proksymalnych nerek oraz zastosowanie tych komórek w trójwymiarowej, mikrofluidycznej, mikrofizjologicznej platformie do ponownego odtworzenia kanału proksymalnego nerk.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka nabłonka proksymalnego ludzkiego i ich zastosowanie w tworzeniu mikrofizjologicznego modelu kanału bliższego nerki

Odkryj model raka nerki na chipie wykorzystujący mikroprzepływ i bioprinting 3D do badania interakcji między zdrowymi a nowotworowymi komórkami nerek. Ta metoda pozwala symulować warunki in vivo i analizować zmiany ekspresji genów.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Przeglądaj więcej filmów