Name: Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę dysocjacji i ortotopowej implantacji ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi w myszach. Umożliwia badanie systemowych odpowiedzi na nowotwory ludzkie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za hojny wkład pacjentów, którzy dostarczyli próbki guza do opracowania PDX. Emidio Pistilli docenia znaczący wcześniejszy wkład Hannah Wilson, MD/PhD. Badania te były wspierane przez następujące organizacje: National Institutes of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) pod numerem nagrody R01AR079445 (Pistilli); WVU Genomics Core Facility (U54GM104942); WVU Animal Model and Imaging Facility (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); National Institutes of General Medical Sciences pod numerem nagrody P20GM121322 (Lockman). Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zachodniej Wirginii (WVU). Samice myszy NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) w wieku 8 tygodni lub starsze i ważące około 25 g wykorzystano do wstrzykiwań komórek nowotworowych. Tkanka guza raka piersi została pozyskana w Instytucie Raka Uniwersytetu Zachodniej Wirginii (Morgantown, WV) oraz przez NCI Cooperative Human Tissue Network zgodnie z zatwierdzonym protokołem WVU Institutional Review Board oraz WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee. Uzyskano świadomą pisemną zgodę pacjentów. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w warunkach aseptycznych w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, zgodnie z odpowiednimi protokołami dotyczącymi środków ochrony osobistej (PPE). Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Wysokoprzepustowa dysocjacja enzymatyczna tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Rozmrozić i połączyć enzymy H, R i A z zestawu do dysocjacji guza u człowieka w sterylnej C-probówce. Dodać 200 μl enzymu H, 100 μl enzymu R i 25 μl enzymu A. Doprowadzić końcową objętość do ~5 ml, dodając 4,7 ml sterylnej pożywki RPMI 1640 do probówki C. 
	UWAGA: Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco może być używany zamiast RPMI 1640.</li>
	<li>Fragmenty guza można wycinać i zamrażać zgodnie z opisem w istniejących protokołach9. Przenieść rozmrożone fragmenty guza i towarzyszącą im pożywkę do zamrażania na jedną połówkę sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś fragmenty guza do sterylnej mikroprobówki o pojemności 5 ml. 
	UWAGA: Sterylna igła podskórna może być używana jako alternatywa dla kleszczy. Zamiast mikroprobówki o pojemności 5 ml można użyć naczynia o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Przemyj fragmenty guza 1-3 ml sterylnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 1x). Manipulować fragmentami roztworu za pomocą kleszczy, aby zapewnić dokładne usunięcie pozostałego medium zamrażającego.</li>
	<li>Przenieś umyte fragmenty do mikroprobówki o pojemności 2 ml za pomocą kleszczy. Nałóż 1 ml roztworu potrójnego antybiotyku (TAB) na fragmenty guza i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W razie potrzeby ten krok można pominąć. 10x Zapas TAB można wytworzyć przez rozpuszczenie 1% gentamycyny, 1% klindamycyny i 0,5% siarczanu polimyksyny B w sterylnym 1x PBS. Rozcieńczyć do 1x roztwór TAB w sterylnym 1x PBS.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś zdezynfekowane fragmenty do nowej mikroprobówki o pojemności 5 ml. Wykonaj drugie płukanie 1-3 ml sterylnego PBS. Przenieść umyte fragmenty do suchej połowy naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm z kroku 1.2.</li>
	<li>Za pomocą dwóch sterylnych ostrzy skalpela nr 10 dokładnie zmielić tkankę nowotworową. Przenieś zmielone fragmenty guza na jedno ostrze i umieść je w C-probówce zawierającej przygotowany roztwór enzymu. Mocno zamocuj pokrywę tuby, aż poczujesz ostatnie kliknięcie.</li>
	<li>Odwróć rurkę C kilka razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie fragmentów guza w roztworze enzymu.</li>
	<li>Umieść rurkę C w dysocjatorze mechanicznym. Odwróć probówkę i upewnij się, że cała zawartość jest zanurzona w medium. Rura będzie w pozycji odwróconej w maszynie.
	<ol>
		<li>Zamocuj rurkę w szczelinie tak, aby wgłębiona część była skierowana w stronę operatora. W razie potrzeby umieść grzejnik wokół rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz program 37C_h_TDK_3 z interfejsu ekranu dotykowego. Ten program działa przez 60 minut w temperaturze 37 °C. W przypadku guzów miękkich można zastosować 37C_h_TDK_1 lub 2. 
	UWAGA: Aby uzyskać największą skuteczność, zaleca się, aby myszy były przygotowane do wstrzyknięcia w tym okresie dysocjacji poprzez nałożenie kremu do depilacji na miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Po zakończeniu programu dysocjacji sprawdź zawartość probówki. Nie powinny pozostać żadne widoczne fragmenty guza. 
	UWAGA: Jeśli obecne są fragmenty, może być wymagany dodatkowy czas dysocjacji. W takich przypadkach uruchom program na dodatkowe 20-30 minut.</li>
	<li>Po osiągnięciu odpowiedniej dysocjacji należy odwirować probówkę C o masie 200 x g przez 5-8 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zdysocjowanych komórek. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą aspiracji próżniowej lub pipety.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5-10 ml świeżej pożywki RPMI. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, aby ułatwić manipulację. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5-8 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant. 
	UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli osad ogniwa jest mały. W takich przypadkach komórki są ponownie zawieszane bezpośrednio w żądanej objętości pożywki, a następnie łączone z ekstraktem z błony podstawnej (Matrigel) w celu zminimalizowania utraty komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad ogniwa w objętości RPMI 1640, co odpowiada połowie pożądanej końcowej objętości wstrzyknięcia. RPMI 1640 i Matrigel zostaną połączone w stosunku 1:1 v/v, z końcową objętością wstrzyknięcia wynoszącą 100 μl na miejsce wstrzyknięcia. 
	UWAGA: W przypadku wstrzyknięcia dwustronnego u 4 myszy całkowita wymagana objętość wynosi 800 μl. W związku z tym należy ponownie zawiesić ogniwa w co najmniej 400 μl RPMI 1640. Aby uwzględnić potencjalną utratę objętości, zaleca się dodanie dodatkowych 20% do końcowej objętości, przy zachowaniu stosunku 1:1 v/v. Alternatywnie zamiast RPMI 1640 można użyć DMEM lub 1x PBS.</li>
	<li>Policz zawieszone komórki za pomocą hemocytometru lub metody automatycznej. Rozcieńczyć w razie potrzeby, aby osiągnąć pożądane stężenie do wstrzykiwań. Sugeruje się punkt wyjścia około 1-2 milionów komórek na miejsce wstrzyknięcia.</li>
	<li>W okrągłodennej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml połącz żądaną ilość rozcieńczonej zawiesiny komórek w RPMI z równą objętością Matrigelu. Delikatnie wymieszać zawiesinę, wielokrotnie pipetując, aby zapewnić jednorodność. 
	UWAGA: Postępując zgodnie z poprzednim krokiem, dodaj 400 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do 400 μl Matrigel. Należy wziąć pod uwagę liczbę igieł do wstrzykiwań, które należy użyć i uwzględnić związane z tym straty objętości. Trzymaj Matrigel na lodzie przez cały czas. Nie rozmrażaj go, dopóki komórki nie zostaną ponownie zawieszone, ponieważ szybko się zestale. Zalecany do przechowywania małych porcji (np. 120 μl) w celu szybkiego rozmrażania i łączenia w probówce o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową należy utrzymywać na lodzie do momentu, gdy będzie gotowa do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Ortotopowa pachwinowa poduszeczka tłuszczowa sutka zdysocjowanego PDX
<ol>
	<li>Określ masę każdej myszy za pomocą skalibrowanej wagi. Nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na docelowe miejsce wstrzyknięcia. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika wmasuj krem naprzemiennie w prawo i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby ułatwić szybkie usunięcie sierści.
	<ol>
		<li>Usuń nadmiar sierści i kremu do depilacji za pomocą sterylnej gąbki z gazy nasączonej solą fizjologiczną. Zapewnić całkowite usunięcie owłosienia w miejscu wstrzyknięcia. 
		UWAGA: Nie przekraczaj 60 sekund ekspozycji na krem do depilacji, aby zapobiec podrażnieniu skóry. Myszy można golić przed nałożeniem kremu do depilacji, aby jeszcze bardziej zminimalizować czas ekspozycji. Ten krok można wykonać podczas dysocjacji guza, aby zoptymalizować wydajność czasu i zminimalizować czas przechowywania zawiesiny komórkowej na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy przeprowadzić dokładne oględziny każdej myszy w celu oceny przydatności do wstrzyknięcia. Oceń, czy nie ma żadnych oznak bólu, niepokoju, choroby lub innych przeciwwskazań.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml bez dołączonej igły, delikatnie zassać zawiesinę komórek w górę i w dół, aby zapewnić jednorodność. Podłączyć igłę 26 G do strzykawki o pojemności 1 ml i pobrać żądaną objętość wstrzyknięcia. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki poprzez delikatne stukanie lub przesuwanie. 
	UWAGA: Zaleca się, aby nie przekraczać 600 μl na strzykawkę, aby ułatwić wstrzykiwanie jedną ręką.</li>
	<li>Umieścić przygotowaną strzykawkę poziomo na pojemniku z lodem, z igłą skierowaną w kierunku przeciwnym do operatora. Pojemnik z lodem i igłę należy umieścić po tej samej stronie, co ręka dominująca operatora lub preferowana ręka do wstrzykiwania. Wyjmij mysz z obudowy i zdezynfekuj miejsce wstrzyknięcia za pomocą nasączonego alkoholem wacika czyszczącego.</li>
	<li>Bezpiecznie unieruchom, mocno chwytając skórę grzbietową na karku i z tyłu. Zapewnić wystarczające unieruchomienie, aby wyraźnie odsłonić poduszeczki tłuszczowe sutka. Pachwinowa poduszeczka tłuszczowa sutka rozciąga się od sutka do górnej części biodra. Można go zaobserwować jako miękką, różowawą tkankę w opisanym obszarze pod skórą. 
	UWAGA: Asystent operatora może użyć płaskich kleszczy do uszczypnięcia i uniesienia skóry zawierającej poduszkę tłuszczową. Ta technika pomaga zapewnić, że operator wykonujący wstrzyknięcie skutecznie celuje w poduszeczkę tłuszczową.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej. Włóż igłę (skos do góry) pod kątem 45 stopni, kierując się w stronę biodra około 0,5-1 cm ogonowo do poduszeczki tłuszczowej, dostosowując długość igły.
	<ol>
		<li>Wsuń igłę do poduszki tłuszczowej. W kontrolowany sposób wstrzykiwać żądaną objętość zawiesiny komórek. Wydajna prędkość wtrysku pomoże zminimalizować pobudzenie zwierząt spowodowane długotrwałym unieruchomieniem. 
		UWAGA: Aby zminimalizować stres zwierząt, maksymalny czas ciągłego ręcznego krępowania nie powinien przekraczać 30 sekund. Jeżeli czas krępowania przekracza 30 s, zwierzę powinno zostać wypuszczone do klatki w celu odzyskania sił przed drugą próbą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wstrzyknięciu obrócić igłę o 180 stopni (skos w dół). Utrzymuj pozycję igły przez krótki czas przed powolnym wycofaniem, aby zminimalizować utratę komórek w miejscu wstrzyknięcia. Jeśli wystąpi krwawienie, w razie potrzeby zastosuj gazę standardową lub gazę hemostatyczną.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.6 i 2.7 dla przeciwległej poduszeczki tłuszczowej, jeśli wymagane jest obustronne wstrzyknięcie. W przypadku wielu zwierząt w razie potrzeby powtórz kroki 2.2-2.7.</li>
</ol>
3. Procedury uzupełniające
<ol>
	<li>Wszystkie ostre przedmioty należy wyrzucać do wyznaczonych pojemników na ostre przedmioty. Całą pozostałą zawartość należy wyrzucić do odpowiednich pojemników na odpady.</li>
	<li>Jeśli krwawienie wystąpi podczas wstrzyknięcia, należy monitorować myszy przez co najmniej 1 godzinę po wstrzyknięciu, aby zapewnić hemostazę.</li>
	<li>Monitoruj masę ciała co tydzień. Oceń objętość guza, gdy wzrost stanie się wyczuwalny.</li>
</ol>

High-Throughput Dissociation and Orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-Derived Xenografts

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 3 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renewable+tissue+resource+of+phenotypically+stable%2C+biologically+and+ethnically+diverse%2C+patient-derived+human+breast+cancer+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models.</a> Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> J Hematol Oncol. 13 (1), 1-16 (2020).</li>
<li>Wilson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+xenograft+model+implicates+peroxisome+proliferator-activated+receptor+signaling+as+driver+of+cancer-induced+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer xenograft model implicates peroxisome proliferator-activated receptor signaling as driver of cancer-induced muscle fatigue.</a> Clin Cancer Res. 25 (7), 2336-2347 (2019).</li>
<li>Wilson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+reprogramming+by+breast+cancer+regardless+of+treatment+history+or+tumor+molecular+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle reprogramming by breast cancer regardless of treatment history or tumor molecular subtype.</a> NPJ Breast Cancer. 6 (1), 18(2020).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+of+human+breast+cancer%3A+Protocols+for+in+vitro+and+in+vivo+applications+in+tumor+biology+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models of human breast cancer: Protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine.</a> Curr Protoc Pharmacol. 14, Unit14.23(2013).</li>
<li>Whittle, J. R., Lewis, M. T., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+breast+cancer+and+their+predictive+power%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of breast cancer and their predictive power.</a> Breast Cancer Res. 17 (1), 17(2015).</li>
<li>Fleming, J. M., Miller, T. C., Meyer, M. J., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+human+breast+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local regulation of human breast xenograft models.</a> J Cell Physiol. 224 (3), 795-806 (2010).</li>
<li>Okano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+achieves+better+engraftment+and+faster+growth+than+subcutaneous+implantation+in+breast+cancer+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation achieves better engraftment and faster growth than subcutaneous implantation in breast cancer patient-derived xenografts.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 25 (1), 27-36 (2020).</li>
<li>Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+antibiotics+in+cell+culture+with+caution%3A+Genome-wide+identification+of+antibiotic-induced+changes+in+gene+expression+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation.</a> Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).</li>
<li>Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+system+effects+on+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Immune system effects on breast cancer.</a> Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

W artykule przedstawiono skuteczną, wysokoprzepustową metodę ortotopowego wszczepiania BC PDX do pachwinowych poduszek tłuszczowych sutka myszy z niedoborem odporności. Ten zoptymalizowany przepływ pracy umożliwia pojedynczemu badaczowi wszczepianie PDX dziesiątkom myszy dziennie, wspierając badania na dużą skalę i z odpowiednią mocą. Zdolność do jednoczesnej dysocjacji i implantacji wielu unikalnych PDX umożliwia również precyzyjne podejście onkologiczne. Poza efektywnością czasową, dysocjacja guzów tworzy jednorodną zawiesinę typów komórek, która jest równomiernie rozłożona między myszami. Z naszego doświadczenia wynika, że ta jednorodność przyczynia się do spójnego tempa wszczepienia i wzrostu guza.
Chociaż protokół ten jest ogólnie skuteczny, może wymagać modyfikacji w niektórych scenariuszach. Na przykład standardowy 1-godzinny czas pracy dysocjatora mechanicznego czasami okazuje się niewystarczający do całkowitej dysocjacji tkanki nowotworowej. Mocno chwytając rurkę C, przesuń ją kilka razy w dół, aby zgromadzić zabłąkaną tkankę na dnie. Jeśli pozostaną widoczne fragmenty tkanki, kontynuuj dysocjację i ponownie sprawdzaj w odstępach 15 minut. Ważne jest, aby pamiętać, że niektóre tkanki, szczególnie tkanka włóknista lub tłuszczowa, mogą być odporne na dysocjację i wymagać ręcznego usunięcia, aby zapobiec zatykaniu się igły podczas wstrzykiwania.
Zalecamy użycie najmniejszej możliwej igły (27 G lub 26 G), aby zminimalizować stres zwierzęcia i zmniejszyć ryzyko cofania się komórek z miejsca wstrzyknięcia, co może mieć wpływ na powodzenie przeszczepu i tempo wzrostu guza. Jeśli jednak pozostaną niezdysocjowane tkanki lub fragmenty tkanki tłuszczowej, może być konieczne użycie igły o większej średnicy (16 G lub 18 G), aczkolwiek ze zwiększonym ryzykiem krwawienia lub utraty komórek. Niezależnie od wybranego rozstawu igieł, biegłość w obchodzeniu się ze zwierzętami jest najważniejszym elementem skutecznego wykonywania iniekcji. W tym protokole nie stosuje się znieczulenia i chociaż oszczędza to czas, pozwala również zwierzęciu na pewien stopień mobilności podczas wykonywania zastrzyków. Jeśli podczas zacierania nie zostanie osiągnięte odpowiednie unieruchomienie, nagłe ruchy kończyn mogą spowodować przebicie naczyń, utworzenie rany wyjściowej, która uniemożliwia zatrzymanie komórek, lub nakłucia ścian brzucha. Zalecana jest wystarczająca praktyka w wstrzykiwaniu przed wstrzyknięciem cennych komórek.
Opisana technika dysocjacji jest wysoce transferowalna i może być stosowana w implantacji wielu innych typów nowotworów zarówno w modelach ortotopowych, jak i podskórnych. Jednak przynajmniej w kontekście BC należy unikać implantacji podskórnej. Ortotopowe wstrzyknięcie BC PDX powoduje lepsze unaczynienie przeszczepionego guza przez gospodarza w porównaniu z implantacją poduszeczki tłuszczowej pachwinowej, a implantacja pachwinowej poduszeczki tłuszczowej prowadzi do większych wskaźników wszczepienia niż poduszeczka tłuszczowa klatki piersiowej11. Ponadto implanty ortotopowe PDX mają krótszy czas wszczepienia i szybsze tempo wzrostu w porównaniu z iniekcjami podskórnymi12. Należy również zauważyć, że chociaż dysocjacja ułatwia szybkie wstrzyknięcie komórek nowotworowych, z natury rzeczy powoduje utratę kontekstu komórka-komórka; W związku z tym może to nie być właściwe podejście we wszystkich przypadkach. W przypadku przypadków wymagających autentycznej interakcji komórkowej (np. transkryptomika przestrzenna guzów) preferowane może być wstrzykiwanie zmielonych kawałków guza lub wszczepianie fragmentów. 
Chociaż jest to niezbędne dla badań PDX, stosowanie myszy z niedoborem odporności wprowadza pewne ograniczenia. Z logistycznego punktu widzenia wymagane jest w pełni sterylne środowisko, w tym pomieszczenia mieszkalne, żywność i woda. To z kolei wymaga wydzielenia obszarów przetrzymywania zwierząt z niedoborem odporności, aby zmniejszyć ryzyko infekcji, co potencjalnie zwiększa koszty utrzymania. Ta zwiększona podatność na infekcje jest powodem, dla którego sugeruje się etap inkubacji antybiotyku dla fragmentów guza przed dysocjacją. Jednak niektóre badania wykazały, że stosowanie antybiotyków w hodowlach komórkowych prowadzi do zmian w profilach ekspresji genów13. Biorąc to pod uwagę, naukowcy powinni ocenić stosowanie antybiotyków w każdym badaniu. Podczas gdy efektywny brak układu odpornościowego pozwala PDX na wszczepienie, wyklucza to również badanie licznych skutków układu odpornościowego na progresję BC14. 
Metoda ta wykazuje wysoką wierność próbkom guza pobranym od pacjenta. Uwierzytelnienie histopatologiczne potwierdziło zgodność pasażowanego PDX w stosunku do próbki guza pacjenta, zgodnie z oczekiwaniami. Wysokie dopasowanie odczytów do ludzkiego genomu silnie sugeruje, że PDX utrzymuje wysoki odsetek ludzkich komórek po pasażu. Jest to dodatkowo wspierane przez >80% podobieństwo w profilach STR i silną dodatnią korelację w danych sekwencyjnych RNA między guzem pacjenta a PDX. Adaptacje molekularne w tkankach obwodowych myszy PDX po wzroście guza piersi są również zgodne z adaptacjami molekularnymi u pacjentów z BC. Masowe analizy sekwencyjne RNA i proteomiczne mięśni szkieletowych myszy BC PDX są uderzająco zgodne ze zmianami molekularnymi w biopsjach mięśni uzyskanych od pacjentów, u których zdiagnozowano wczesne stadium BC 6,7. Podsumowując, podobieństwo profilowania STR i sekwencjonowania RNA, w połączeniu ze spójnymi adaptacjami w tkankach obwodowych, dostarcza przekonujących danych do wykorzystania myszy BC PDX w badaniach przedklinicznych.

Rak piersi (BC) diagnozuje się każdego roku u ponad 2 milionów kobiet na całym świecie1. Aby pogłębić podstawową wiedzę biologiczną na temat BC i skutecznie przełożyć nowe terapie na zatwierdzone metody leczenia, niezbędne są przedkliniczne modele zwierzęce, które zachowują cechy definiujące nowotwory pacjentów. Wykazano, że ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) rekapitulują heterogeniczność guza z wysoką wiernością po wszczepieniu ortotopowym, w tym histopatologię, ekspresję receptorów i aberracje genetyczne2,3,4. Co ważne, zatrzymują również komórki zrębu, które przyczyniają się do mikrośrodowiska guza, takie jak naczynia krwionośne, komórki odpornościowe i fibroblasty związane z rakiem. Chociaż są one stopniowo zastępowane przez mysie komórki zrębu gospodarza z pasażowaniem5. PDX umożliwiają również badanie powikłań ogólnoustrojowych wynikających ze wzrostu guza, takich jak zmęczenie6,7, co nie jest obecnie możliwe przy użyciu modeli in vitro.
Udane wszczepienie BC PDX wymaga jednak szczepu myszy z niedoborem odporności, przy czym najczęściej używanym szczepem jest NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). Myszy NSG są pozbawione odporności adaptacyjnej i wykazują wysoce wadliwą odporność wrodzoną8. Ingrafpację BC PDX osiągnięto w innych szczepach z niedoborem odporności, takich jak SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl), z podobnymi wskaźnikami wszczepienia4.
Tradycyjne metody wszczepiania BC PDX polegają na chirurgicznym wszczepieniu fragmentu guza do poduszeczki tłuszczowej sutka9, a to podejście prowadzi do udanego wszczepienia w korzystnym tempie. Jednak konieczność sterylnych zabiegów chirurgicznych i stosowania środków znieczulających sprawia, że jest to czasochłonne, co ogranicza liczbę myszy, które można wszczepić w określonym oknie czasowym. Biorąc pod uwagę potencjalne korzyści predykcyjne PDX wynikające z reakcji leków w nowotworach i ich zastosowania w medycynie precyzyjnej10, posiadanie prostego i powtarzalnego przepływu pracy do jednorodnego wszczepiania PDX myszom ma kluczowe znaczenie. Artykuł ten pokazuje dysocjację ludzkich guzów piersi na zawiesinę pojedynczej komórki, a następnie ortotopowe wstrzyknięcie do poduszek tłuszczowych sutków myszy z niedoborem odporności.

<table><tbody><tr><td>1 ml strzykawka tuberkulinowa</td><td>BD</td><td>305945</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówek okrągłodennych 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030123620</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>igła 26 G, &frac12; in.</td><td>BD</td><td>305111</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>mikroprobówka 5,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030119401</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>8+ tygodniowa NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) myszy</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#005557</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki nasączone alkoholem</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>sterylny</td></tr><tr><td>ekstrakt z błony podstawnej (Matrigel)</td><td>Cultrex</td><td>3632-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką, 6 cali.</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-553</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>zakrzywione kleszcze ze średnimi nieząbkowanymi końcówkami, 152 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>50-365-845</td><td>sterylny</td></tr><tr><td>krem do depilacji</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo dysocjator z grzałkami</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Nr 10 ostrzy skalpela</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-162</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>gąbki z włókniny z gazy, 4x4 cale</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-028-558</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x + L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>sterylny</td></tr><tr><td>zestaw do dysocjacji nowotworów, człowiek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) dostarczają klinicznie istotnej metody do rekapitulacji typów komórek związanych z nowotworem i mikrośrodowiska guza, co jest niezbędne do poszerzenia wiedzy o raku piersi (BC). Dodatkowo modele PDX umożliwiają badanie skutków ogólnoustrojowych BC, co nie jest możliwe przy użyciu modeli in vitro. Tradycyjne metody wszczepiania ksenoprzeszczepów BC zazwyczaj obejmują znieczulenie i sterylne zabiegi chirurgiczne, które są czasochłonne, inwazyjne i ograniczają skalowalność modeli PDX w badaniach BC. Protokół ten opisuje prostą i skalowalną metodę ortotopowego implantacji BC PDX u myszy. Do wszczepienia PDX użyto mysiego szczepu myszy NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG). Ludzkie próbki BC uzyskane od pacjentów, którzy wyrazili zgodę na IRB, zostały mechanicznie i enzymatycznie zdysocjowane, a następnie ponownie zawieszone w roztworze ekstraktu z błony podstawnej (BME) i RPMI 1640. Zwierzęta krępowano za pomocą chrupania, a następnie nakładano krem do depilacji, aby usunąć włosy z poduszek tłuszczowych przy czwartym sutku pachwinowym, a następnie wstrzykiwano. Około 2 miliony komórek w zawiesinie o objętości 100 μl wstrzyknięto obustronnie ortotopowo do poduszeczek tłuszczowych sutka za pomocą igły 26 G. Warto zauważyć, że nie było wymagane znieczulenie, a całkowity czas zabiegu wynosił poniżej 5 minut, od przygotowania komórek do wstrzyknięcia. Po kilkumiesięcznym okresie wzrostu guzy zostały wycięte i przetworzone w celu uwierzytelnienia. Walidacja obejmowała ocenę statusu receptora za pomocą immunohistochemii ze specyficznymi przeciwciałami dla tradycyjnych receptorów BC (tj. ER, PR, HER2). Morfologię guza potwierdzono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), co zostało zinterpretowane przez patologa. Podobieństwo genetyczne do próbki pobranej od pacjenta zweryfikowano za pomocą sekwencjonowania RNA i analizy krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Takie podejście do wszczepiania i walidacji PDX wspiera rygorystyczny rozwój modeli i wysokoprzepustową implantację guza, umożliwiając dobrze prowadzone badania nad różnymi podtypami BC.

Niniejsze badanie przedstawia wydajną i nienachirurgiczną metodę ortotopowej implantacji kseroprzeniesień raka piersi pochodzących od pacjentów u myszy. Tkankę guza piersi rozdzielono z wykorzystaniem enzymów specyficznych dla ludzi oraz agitacji mechanicznej, resuspensowano w stosunku 1:1 v/v Matrigel: RPMI 1640, a następnie wstrzyknięto ortotopowo do pachwinowych poduszek tłuszczowych gruczołów piersiowych myszy NSG (Rycina 1 i Rysunek 2). Aby zapewnić wierność modeli PDX, zgodność pierwotnej próbki guza pacjenta z guzami pasażowanymi została zweryfikowana przy użyciu uznanych technik histopatologicznych i genomicznych. Ekspresję receptorów określono za pomocą barwienia immunohistochemicznego (IHC) w kierunku standardowych receptorów raka piersi, w tym receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronowego (PR) oraz ludzkiego receptora nadwrażliwości naskórkowej czynnika wzrostu 2 (HER2) (Rycina 3). Morfologię komórkową oceniono przy użyciu hematoksyliny i eozyny (H&amp;E) barwienie przekrojów plastrów guza oraz interpretacja zabarwionych preparatów przez doświadczonego patomorfologa. Zachowanie krajobrazu genetycznego oraz obecność ludzkich komórek potwierdzono za pomocą sekwencjonowania całego RNA (bulk RNA-sequencing) oraz analizy krótkich tandemowych powtórzeń (STR) (Rysunek 4 i Tabela 1Dodatkowo badania w kierunku patogenów nie wykazały kontaminacji próbek pobranych od pacjenta ani próbek guza z pasażowania, co stanowi kluczowy etap weryfikacji ze względu na zastosowanie myszy z niedoborem odporności.
<img alt="Schemat przetwarzania i monitorowania guza; dysocjacja, wstrzyknięcie, analiza MRI, monitorowanie wzrostu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Przedstawienie schematu dysocjacji i wstrzykiwania guza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Myszy NSG przygotowano do iniekcji, stosując krem depilacyjny nanoszony naprzemiennymi ruchami zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby dokładnie usunąć sierść z obszaru pachwinowej poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego (Rysunek 2A). Nadmiar kremu depilacyjnego usunięto z odsłoniętej skóry brzucha za pomocą sterylnej gazy, a następnie obszar ten zdezynfekowano wacikiem nasączonym alkoholem (Rysunek 2B). Sterylną igłę z zawiesiną dysocjowanych komórek nowotworowych ustawiono pod kątem około 45 stopni, 0,5-1 mm ku strony ogonowej względem pachwinowej poduszki tłuszczowej czwartego sutka (Rysunek 2C). Komórki nowotworowe wstrzyknięto w sposób kontrolowany do pachwinowych poduszek tłuszczowych czwartego sutka (Rysunek 2D). Wzrost guza wykrywano początkowo za pomocą palpacji cyfrowej poduszek tłuszczowych. Następnie postęp wzrostu objętości guza monitorowano ilościowo przy użyciu obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) (Rysunek 2E). Zarówno masę ciała (Rysunek 2F), jak i objętość guzów (Rysunek 2G) mierzono co tydzień w celu monitorowania wahań wagi oraz postępu wzrostu objętości guzów. Guzy poddawano ocenie wizualnej w celu monitorowania ewentualnych ran, takich jak owrzodzenia, które mogłyby wymagać przedwczesnego przerwania badania. Pomyślne obustronne przeszczepienie PDX do pachwinowych poduszek tłuszczowych gruczołów mlekowych przedstawiono na Rysunku 2H, a poduszki tłuszczowe po wycięciu guzów pokazano na Rysunku 2I.
<img alt="Modelowanie guzów u myszy; wstrzyknięcie guza, MRI, wykresy wzrostu, wyniki sekcji; badania onkologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie myszy, wstrzyknięcie PDX i monitorowanie progresji guza. (A) Podskórne poduszki tłuszczowe gruczołów mlekowych zostały dokładnie wydepilowane. (B) Prezentacja miejsca wstrzyknięcia z wyraźną widocznością docelowych obszarów iniekcji. (C) Pozycja strzykawki na poduszce tłuszczowej, zazwyczaj 0,5-1 mm guzowo względem poduszki tłuszczowej, w zależności od długości igły. Biała strzałka wskazuje docelowy obszar wprowadzenia igły. (D) Przedstawienie wstrzyknięcia dysocjowanych komórek do lewej czwartej pachwinowej poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego. Podczas wstrzykiwania igłę należy trzymać pod kątem około 45 stopni, jak pokazano na rysunku. (E) Reprezentatywny obraz MRI obustronnie wszczepionych guzów w miejscu iniekcji. Guzy zaznaczono na zielono. (F) Reprezentatywna progresja masy ciała w gramach po wstrzyknięciu komórek nowotworowych (n = 5). Ciemnoniebieska linia przedstawia prostą regresję liniową, która jest istotnie różna od zera (p &lt; 0,0001); masa ciała myszy rosła średnio o 22 mg.day-1. Ciemnoniebieskie cieniowanie to 95% przedział ufności, jasnoniebieskie cieniowanie to 95% przedział prognozy, a pomarańczowe linie to podłużne pomiary masy ciała. (G) Reprezentatywna progresja indywidualnych objętości guzów w mm3 po wstrzyknięciu komórek nowotworowych (n = 10). Ciemnoniebieska linia przedstawia regresję wykładniczą; czas podwojenia objętości guza wynosił 19,08 dnia. Ciemnoniebieskie cieniowanie to 95% przedział ufności, jasnoniebieskie cieniowanie to 95% przedział prognozy, a pomarańczowe linie to podłużne pomiary objętości guzów. (H) Pomyślne obustronne wszczepienie komórek PDX do pachwinowych poduszek tłuszczowych gruczołów mlekowych. Zauważalna jest unaczynienie doprowadzające krew do każdego guza. Białe strzałki wskazują guzy. (I) Obszar pachwinowej poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego po wycięciu guzów. (H,I) Jednostki na linijce są podane w cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Reprezentatywny model PDX (PEN_056) pochodził od 31-letniej kobiety rasy kaukaskiej z inwazyjnym rakiem piersi w stadium 3A. Guz pierwotny, pobrany z prawej piersi, miał status receptorów ER i PR ujemny oraz HER2 dodatni (ER-PR-HER2+). Barwienie IHC dla receptorów ER, PR i HER2 wykazało zgodność między guzem pacjentki a guzem PDX (Rysunek 3). Niemniej jednak, model PDX wykazuje silniejszą ekspresję HER2, co może wynikać z selektywnego wzrostu komórek HER2+. Ocena patomorfologiczna skrawków barwionych H&amp;E potwierdziła słabo zróżnicowany rak z podobną morfologią i cytologią w próbkach pacjentki oraz PDX (Rysunek 3).
<img alt="Porównanie histologiczne, barwienie ER, PR, HER2 oraz H&amp;E w próbkach guza, obraz mikroskopowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Barwienie H&amp;E oraz IHC receptorów. (Lewa kolumna) Barwienie IHC receptorów ER, PR i HER2 oraz barwienie H&amp;E w guzie pacjenta. Barwienia ER i PR nie wykazują wyraźnego obrazu dodatniego, zgodnie z oczekiwaniami. Barwienia HER2 wykazują dodatni wynik dla HER2 (kolor brązowy). (Prawa kolumna) Barwienie IHC receptorów ER, PR i HER2 oraz barwienie H&amp;E w pasażowanej próbce PDX. Barwienie receptorów ściśle przypomina obraz widoczny w próbce pacjenta, choć HER2 wykazuje silniejszą ekspresję po pasażowaniu. Pasek skali: 50 µm; powiększenie: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Genotypowanie krótkich powtórzeń tandemowych (STR) potwierdziło &gt;80% podobieństwa w 13 loci autosomalnych zdefiniowanych przez wytyczne konsensusu American Type Cell Culture Collection (ATCC) ASN-0002-2022 oraz w 3 dodatkowych loci (Tabela 1). Sekwencjonowanie całego RNA (RNA-seq) próbki guza pacjenta i modelu PDX potwierdziło równoważne poziomy dopasowania do najnowszej referencyjnej genomu ludzkiego (T2T CHM13v2.0), przy czym odpowiednio 82,3% i 79,1% odczytów zostało dopasowanych. Ponadto guz pacjenta i PDX wykazały silną dodatnią korelację z wartością r Pearsona wynoszącą 0,9559 (Rysunek 4A). Analiza wzbogacenia zestawów genów (GSEA) w porównaniu PDX z guzami pacjenta wykazała, że 10 najważniejszych istotnie wzbogaconych szlaków z biologicznych procesów ontologii genów to przede wszystkim zestawy genów immunologicznych, co sugeruje, że większość wariancji transkrypcyjnej między PDX a guzami pacjenta wynika z braku komórek odpornościowych w próbce PDX (Rysunek 4B).
<table border="1" fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D5S818</td>
			<td>D13S317</td>
			<td>D7S820</td>
			<td>VWA</td>
			<td>TH01</td>
			<td>AM</td>
			<td>TPOX</td>
			<td>CSF1PO</td>
			<td>D3S1358</td>
			<td>D21S11</td>
			<td>D18S51</td>
			<td>Penta_E</td>
			<td>Penta_D</td>
			<td>D8S1179</td>
			<td>FGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guz pacjenta</td>
			<td>12 
			13</td>
			<td>8 
			8</td>
			<td>8 
			9</td>
			<td>17 
			17</td>
			<td>9 
			9.3</td>
			<td>X 
			X</td>
			<td>8 
			10</td>
			<td></td>
			<td>15 
			16</td>
			<td>29 
			31.2</td>
			<td>16 
			19</td>
			<td>12 
			13</td>
			<td>14 
			14</td>
			<td>10 
			14</td>
			<td>21 
			25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guz PDX</td>
			<td>13 
			14</td>
			<td>8 
			8</td>
			<td>8 
			9</td>
			<td>17 
			17</td>
			<td>9 
			9.3</td>
			<td>X 
			X</td>
			<td>10 
			10</td>
			<td></td>
			<td>15 
			15</td>
			<td>29 
			29</td>
			<td>16 
			19</td>
			<td>12 
			13</td>
			<td>14 
			14</td>
			<td>10 
			14</td>
			<td>21 
			25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Uwierzytelnianie za pomocą krótkich tandemowych powtórzeń (STR).
<img alt="Schemat ekspresji genów; korelacja Pearsona; rozkład wzbogacenia; analiza odpowiedzi immunologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67607/67607fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Korelacja sekwencjonowania RNA i wzbogacenie zestawów genów. (A) Wykres rozrzutu wizualizujący log2 znormalizowaną liczbę odczytów na milion (CPM) dla wszystkich genów z guza pacjenta (oś x) i PDX (oś y). Stwierdzono silną dodatnią korelację, z wartością r Pearsona wynoszącą 0,9559. (B) Wykresy grzbietowe (ridge plots) dla 10 najbardziej wzbogaconych zestawów genów procesów biologicznych ontologii genów przy porównaniu PDX vs. guza pacjenta. Krzywe przedstawiają rozkład wyniku wzbogacenia dla każdego zestawu genów; kolor reprezentuje wartość q FDR dla każdego zestawu genów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67607/67607fig4large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Ten protokół opisuje skuteczną, niechirurgiczną metodę ortotopowego wszczepiania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi u myszy. Technika ta polega na enzymatycznej dysocjacji guza, a następnie bezpośrednim wstrzyknięciu do poduszek tłuszczowych sutka, co umożliwia implantację o wysokiej przepustowości. Kompleksowa walidacja zapewnia wierność modelu, ułatwiając rygorystyczne badania nad różnymi podtypami raka piersi.

Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Patient-derived xenografts (PDXs) provide a clinically relevant method for recapitulating tumor-involved cell types and the tumor microenvironment, which ...

Badania w moim laboratorium koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw zmęczenia mięśni u pacjentek z rakiem piersi. W szczególności chcemy zrozumieć komunikację między guzem zlokalizowanym w tkance piersi a obwodowymi mięśniami szkieletowymi, a następnie reakcje molekularne w tym mięśniu, które prowadzą do zmęczenia. Opracowanie trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych umożliwia przeprowadzenie badań o wysokiej przepustowości, w których reakcje funkcjonalne, takie jak zmęczenie mięśni, mogą być badane w kontrolowanych warunkach.Eksperymenty z funkcjonalnymi hodowlami komórkowymi mogą być prowadzone równolegle i zajmują mniej czasu niż równoważne modele zwierzęce, co ułatwia szybkie odkrywanie i wprowadzanie innowacji. Ocena odpowiednich fenotypów funkcjonalnych przy użyciu tradycyjnych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów jest zarówno czasochłonna, jak i wymaga dużych zasobów. Protokół ten ułatwia jednoczesne wstrzykiwanie PDX myszom, umożliwiając naukowcom badanie ogólnoustrojowych odpowiedzi na ludzkie nowotwory przy użyciu dobrze zasilanych eksperymentów na zwierzętach.Protokół ten umożliwia ortotopowe wstrzykiwanie komórek guza piersi pochodzących od pacjenta na lepszą skalę w porównaniu z istniejącymi metodami, ułatwiając szybkie wstrzykiwanie do kilkudziesięciu myszy dziennie przez jednego badacza. Dodatkowo dysocjacja guza generuje jednorodną zawiesinę komórkową, która równomiernie rozprowadza typy komórek między zwierzętami. Dane z mojego laboratorium zidentyfikowały podobne reakcje molekularne mięśni na raka piersi u pacjentów z rakiem u myszy PDX i u ludzi.Dlatego chcemy wykorzystać ten przedkliniczny model myszy do badań przesiewowych potencjalnych leków i identyfikacji terapii, które mogą złagodzić zmęczenie u pacjentek z rakiem piersi. Na początek rozmrozić enzymy H, R i A z zestawu do dysocjacji ludzkiego guza. Dodaj 200 mikrolitrów enzymu H, 100 mikrolitrów enzymu R i 25 mikrolitrów enzymu A w sterylnej probówce C. Dodaj 4,7 mililitra sterylnej pożywki RPMI 1640 do probówki C, aby dostosować końcową objętość do około pięciu mililitrów.Następnie przenieś rozmrożone fragmenty guza i towarzyszącą im pożywkę zamrażającą na jedną połówkę sterylnego 100-milimetrowego naczynia hodowlanego. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś fragmenty guza do sterylnej pięciomililitrowej mikroprobówki i umyj je jednym do trzech mililitrów sterylnego PBS. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś zdezynfekowane fragmenty do nowej pięciomililitrowej mikroprobówki.Po drugim przemyciu sterylnym PBS przenieść fragmenty do suchej połowy 100-milimetrowej płytki hodowlanej. Za pomocą dwóch sterylnych ostrzy skalpela numer 10 dokładnie zmiel tkankę nowotworową. Przenieś zmielone fragmenty guza na jedno ostrze i umieść je w probówce C zawierającej przygotowany roztwór enzymu.Odwróć rurkę C kilka razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie fragmentów guza w roztworze enzymu. Teraz umieść rurkę C w dysocjatorze mechanicznym i odwróć rurkę, aby upewnić się, że cała zawartość jest zanurzona w medium. Wybierz program 37CHTDK3 z interfejsu ekranu dotykowego.Po zakończeniu programu dysocjacji sprawdź zawartość probówki. Po osiągnięciu odpowiedniej dysocjacji należy odwirować probówkę C o sile 200 g przez pięć do ośmiu minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą aspiracji próżniowej lub pipety ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w RPMI 1640 do objętości odpowiadającej połowie pożądanej końcowej objętości wtrysku.W dwumililitrowej mikroprobówce wirówkowej z okrągłym dnem połącz żądaną ilość rozcieńczonej zawiesiny komórek w RPMI z równą objętością Matrigel. Delikatnie wymieszać zawiesinę, wielokrotnie pipetując, aby uzyskać jednorodność. Na początek należy rozdzielić ludzkie guzy piersi na zawiesinę jednokomórkową.Następnie, za pomocą jednomililitrowej strzykawki bez dołączonej igły, delikatnie zasysaj zawiesinę komórek w górę iw dół, aby zapewnić jednorodność. Podłączyć igłę o rozmiarze 26 do strzykawki i pobrać żądaną objętość wstrzyknięcia. Następnie delikatnie postukać lub przesunąć strzykawkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na docelowe miejsce wstrzyknięcia myszy. Po oczyszczeniu miejsca wstrzyknięcia należy mocno chwycić skórę grzbietową przy karku i plecach, aby bezpiecznie przytrzymać mysz i ułożyć ją w pozycji leżącej. Włóż igłę pod kątem 45 stopni skierowaną w stronę biodra około 0,5 do jednego centymetra ogonowo do poduszeczki tłuszczowej, dostosowując długość igły.Wsunąć igłę do poduszeczki tłuszczowej i w kontrolowany sposób wstrzyknąć pożądaną objętość zawiesiny komórkowej. Po wstrzyknięciu obrócić igłę o 180 stopni i utrzymać ją przez chwilę przed jej powolnym wycofaniem, aby zminimalizować utratę komórek z miejsca wstrzyknięcia.

high-throughput-dissociation-orthotopic-implantation-breast-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj wysokoprzepustową metodę dysocjacji i ortotopowej implantacji ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi w myszach. Umożliwia badanie systemowych odpowiedzi na nowotwory ludzkie.

Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Przeglądaj więcej filmów