Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Badania w moim laboratorium koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw zmęczenia mięśni u pacjentek z rakiem piersi. W szczególności chcemy zrozumieć komunikację między guzem zlokalizowanym w tkance piersi a obwodowymi mięśniami szkieletowymi, a następnie reakcje molekularne w tym mięśniu, które prowadzą do zmęczenia. Opracowanie trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych umożliwia przeprowadzenie badań o wysokiej przepustowości, w których reakcje funkcjonalne, takie jak zmęczenie mięśni, mogą być badane w kontrolowanych warunkach.

Eksperymenty z funkcjonalnymi hodowlami komórkowymi mogą być prowadzone równolegle i zajmują mniej czasu niż równoważne modele zwierzęce, co ułatwia szybkie odkrywanie i wprowadzanie innowacji. Ocena odpowiednich fenotypów funkcjonalnych przy użyciu tradycyjnych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów jest zarówno czasochłonna, jak i wymaga dużych zasobów. Protokół ten ułatwia jednoczesne wstrzykiwanie PDX myszom, umożliwiając naukowcom badanie ogólnoustrojowych odpowiedzi na ludzkie nowotwory przy użyciu dobrze zasilanych eksperymentów na zwierzętach.

Protokół ten umożliwia ortotopowe wstrzykiwanie komórek guza piersi pochodzących od pacjenta na lepszą skalę w porównaniu z istniejącymi metodami, ułatwiając szybkie wstrzykiwanie do kilkudziesięciu myszy dziennie przez jednego badacza. Dodatkowo dysocjacja guza generuje jednorodną zawiesinę komórkową, która równomiernie rozprowadza typy komórek między zwierzętami. Dane z mojego laboratorium zidentyfikowały podobne reakcje molekularne mięśni na raka piersi u pacjentów z rakiem u myszy PDX i u ludzi.

Dlatego chcemy wykorzystać ten przedkliniczny model myszy do badań przesiewowych potencjalnych leków i identyfikacji terapii, które mogą złagodzić zmęczenie u pacjentek z rakiem piersi. Na początek rozmrozić enzymy H, R i A z zestawu do dysocjacji ludzkiego guza. Dodaj 200 mikrolitrów enzymu H, 100 mikrolitrów enzymu R i 25 mikrolitrów enzymu A w sterylnej probówce C. Dodaj 4,7 mililitra sterylnej pożywki RPMI 1640 do probówki C, aby dostosować końcową objętość do około pięciu mililitrów.

Następnie przenieś rozmrożone fragmenty guza i towarzyszącą im pożywkę zamrażającą na jedną połówkę sterylnego 100-milimetrowego naczynia hodowlanego. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś fragmenty guza do sterylnej pięciomililitrowej mikroprobówki i umyj je jednym do trzech mililitrów sterylnego PBS. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś zdezynfekowane fragmenty do nowej pięciomililitrowej mikroprobówki.

Po drugim przemyciu sterylnym PBS przenieść fragmenty do suchej połowy 100-milimetrowej płytki hodowlanej. Za pomocą dwóch sterylnych ostrzy skalpela numer 10 dokładnie zmiel tkankę nowotworową. Przenieś zmielone fragmenty guza na jedno ostrze i umieść je w probówce C zawierającej przygotowany roztwór enzymu.

Odwróć rurkę C kilka razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie fragmentów guza w roztworze enzymu. Teraz umieść rurkę C w dysocjatorze mechanicznym i odwróć rurkę, aby upewnić się, że cała zawartość jest zanurzona w medium. Wybierz program 37CHTDK3 z interfejsu ekranu dotykowego.

Po zakończeniu programu dysocjacji sprawdź zawartość probówki. Po osiągnięciu odpowiedniej dysocjacji należy odwirować probówkę C o sile 200 g przez pięć do ośmiu minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą aspiracji próżniowej lub pipety ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w RPMI 1640 do objętości odpowiadającej połowie pożądanej końcowej objętości wtrysku.

W dwumililitrowej mikroprobówce wirówkowej z okrągłym dnem połącz żądaną ilość rozcieńczonej zawiesiny komórek w RPMI z równą objętością Matrigel. Delikatnie wymieszać zawiesinę, wielokrotnie pipetując, aby uzyskać jednorodność. Na początek należy rozdzielić ludzkie guzy piersi na zawiesinę jednokomórkową.

Następnie, za pomocą jednomililitrowej strzykawki bez dołączonej igły, delikatnie zasysaj zawiesinę komórek w górę iw dół, aby zapewnić jednorodność. Podłączyć igłę o rozmiarze 26 do strzykawki i pobrać żądaną objętość wstrzyknięcia. Następnie delikatnie postukać lub przesunąć strzykawkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na docelowe miejsce wstrzyknięcia myszy. Po oczyszczeniu miejsca wstrzyknięcia należy mocno chwycić skórę grzbietową przy karku i plecach, aby bezpiecznie przytrzymać mysz i ułożyć ją w pozycji leżącej. Włóż igłę pod kątem 45 stopni skierowaną w stronę biodra około 0,5 do jednego centymetra ogonowo do poduszeczki tłuszczowej, dostosowując długość igły.

Wsunąć igłę do poduszeczki tłuszczowej i w kontrolowany sposób wstrzyknąć pożądaną objętość zawiesiny komórkowej. Po wstrzyknięciu obrócić igłę o 180 stopni i utrzymać ją przez chwilę przed jej powolnym wycofaniem, aby zminimalizować utratę komórek z miejsca wstrzyknięcia.