Zakażenie in vivo i in vitro korzeni ziemniaka nicieniami pasożytniczymi roślin w celu oceny indukowanych zmian strukturalnych

Protokół opisuje zakażenie korzeni Solanum tuberosum pasożytniczymi nicieniami w warunkach szklarniowych in vivo oraz transgeniczne korzenie ziemniaka in vitro do analizy histochemicznej struktury korzenia za pomocą mikroskopii optycznej.

Na badania nad infekcjami pasożytniczymi nicieni w uprawach ma wpływ zmienność warunków środowiskowych, która może znacząco wpływać na wyniki eksperymentów i odtwarzalność danych.

Opracowaliśmy kultury in vitro transgenicznych korzeni ziemniaka z nicieniami pasożytniczymi roślin jako niezawodną alternatywę, która zajmuje mniej miejsca, wymaga mniej czasu na uzyskanie i jest wolna od zanieczyszczeń lub zmienności genetycznej gospodarza.

Śledzenie postępu czasowego infekcji nicieniami w korzeniach roślin uprawnych pozostaje wyzwaniem. Techniki barwienia różnicowego zapewniają niezawodną metodę identyfikacji miejsc infekcji i precyzyjnego rozróżniania etapów życia nicieni.

W porównaniu z badaniami szklarniowymi, ciężkie korzenie ziemniaka wspierają ciągły i kontrolny system zapewniający wszystkie etapy rozwoju nicieni, niezależnie od zmian sezonowych lub klimatycznych.

Tak więc opisany protokół oferuje kilka obiecujących przyszłych zastosowań. Na przykład umożliwia szczegółowe badania nad molekularnymi i komórkowymi mechanizmami dostarczającymi informacji o tym, w jaki sposób nicienie pasożytnicze roślin infekują i manipulują żywicielami.

[Narrator] Na początek umyj marchewkę pod bieżącą wodą z kranu, a następnie zwykłym roztworem detergentu, aby usunąć zanieczyszczenia. Po wysuszeniu ręcznikiem papierowym włóż wysterylizowany metalowy szpikulec w wierzch marchewki, około jednego do dwóch centymetrów do wewnątrz. Za pomocą butelki do mycia wyposażonej w dyszę zwilż marchewkę 96% etanolem. Osusz dolną końcówkę marchwi na wysterylizowanej bibule filtracyjnej. Następnie ostrożnie przepuść go przez płomień. Za pomocą sterylnej obieraczki obierz marchewkę od góry do dołu i powtórz płomienie. Po odrzuceniu górnej i dolnej części umieść środkową część na sterylnej szalce Petriego. Za pomocą sterylnego ostrza i pęsety wytnij odcinki o grubości jednego centymetra. Przenieść skrawki na sterylne szalki Petriego. Po uszczelnieniu płytki trzymaj ją w świetle UV przez 60 minut z każdej strony w celu sterylizacji krążków marchwi. Inkubuj krążki marchwi w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności przez jeden do dwóch tygodni. Następnie za pomocą sterylnego ostrza wykonaj nacięcie w kształcie litery X pośrodku krążka marchwi, tnąc tylko do połowy. Do nacięcia należy pobrać pipetą 50 mikrolitrów zawiesiny nicieni z uszkodzeniami korzeniowymi, zawierającej co najmniej 50 mieszanych etapów życia. Po zamknięciu szalki Petriego inkubuj ją w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności przez okres do trzech miesięcy. Aby usunąć nicienie uszkadzające korzenie, przenieś krążki marchwi z widoczną nekrozą na sito o oczkach 75 mikrometrów o średnicy ośmiu centymetrów umieszczone w sterylnej szklanej misce. Następnie wlej roztwór antybiotyku na sito, aż krążki zostaną przykryte. Po całonocnej inkubacji w ciemności za pomocą wysterylizowanej pipety przenieś nicienie z dna miski do wysterylizowanego szklanego bloku barwiącego. Wlej pipetą jeden mililitr roztworu antybiotyku do bloku barwiącego i pozwól nicieniom osiąść na 30 do 40 minut. Odpipetować zużyty roztwór antybiotyku i powtórzyć proces mycia cztery do pięciu razy. Zawiesinę nicieni do uszkadzania korzeniowego należy natychmiast użyć lub przechowywać w temperaturze 11 stopni Celsjusza. Wybierz bulwy ziemniaka tej samej wielkości i wyrzuć te, które mają, siniaki lub miękkie kawałki. Napełnij pięciolitrowe doniczki mieszanką jeden do jednego ziemi autoklawu i piasku i wymieszaj z 22,5 grama nawozu NPK o powolnym uwalnianiu. Następnie siej ziemniaki na głębokości dziewięciu centymetrów pod powierzchnią gleby. Umieść doniczki w szklarni o wilgotności od 50 do 70%. Często podlewaj, aby utrzymać wilgotność gleby na poziomie 70% maksymalnej zdolności zatrzymywania wody, unikając ekstremalnych temperatur. Gdy pojawią się rośliny ziemniaka, utwórz równomiernie rozmieszczone cztery do sześciu otworów wokół każdej rośliny, aby zobaczyć głębokość. Odpipetować do otworów osiem mililitrów zawiesiny zawierającej 30 000 żywych, mieszanych nicieni uszkadzających korzenie w fazie życia. Następnie przykryj otwory mieszanką gleby. W przypadku doniczek kontrolnych i doniczek zawierających nicienie powodujące uszkodzenia korzeni należy wstrzymać podlewanie w dniu szczepienia. Po dwóch miesiącach uprawy wyrwij rośliny ziemniaka z korzeniami i oddziel pędy i korzenie do zważenia. Ostrożnie umyj system korzeniowy. Zbadaj korzenie pod kątem miejsc ataku RLN przy użyciu odpowiednich technik barwienia. Umyte i wysterylizowane bulwy ziemniaka umieścić w pojemniku. Przykryj bulwy 25% komercyjnym roztworem wybielacza. Zamknij pojemnik i mieszaj przez 15 minut. Po wyrzuceniu wybielacza opłucz bulwy trzykrotnie wysterylizowaną wodą z kranu. Następnie w okapie przepływowym zanurz bulwy w 80% roztworze etanolu na 15 minut, energicznie mieszając. Po odpipetowaniu etanolu spłukać trzykrotnie wysterylizowaną wodą z kranu. Za pomocą sterylnego skalpela usuń obwodowe części bulw. Podziel wewnętrzną centralną część na segmenty o grubości 0,5 centymetra. Aby zaszczepić skrawki, najpierw wymieszaj jeden mililitr zawiesiny Rhizobium rhizogenes z dziewięcioma mililitrami pożywki SH. Zanurz końcówkę sterylnego skalpela w rozcieńczonej zawiesinie i nawiń powierzchnię segmentów ziemniaka pięć razy. Po wysuszeniu segmentów umieść je na półstałym podłożu SH i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez trzy dni w ciemności, aby ułatwić transfekcję plazmidu. Pod koniec trzeciego dnia przenieść zakażone segmenty na płytki zawierające półstałe podłoże SH uzupełnione antybiotykami. Po trzech miesiącach użyj sterylnej pęsety, aby zebrać jednogramową grupę transgenicznych korzeni. Przenieś korzenie na środek płytki za pomocą świeżej, półstałej, wolnej od antybiotyków pożywki SH. Aby zebrać masy jaj nicieni, uzyskaj galasy korzeniowe. Użyj sterylnej, ultracienkiej pęsety, aby ostrożnie wydobyć masę jajową pod lornetkowym mikroskopem stereoskopowym ustawionym na 20-krotne powiększenie. Umieść masy jajowe na przykrytej szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów sterylnej wody z kranu i pozwól im wykluć się przez 48 godzin. Następnie, w kapturze przepływowym, odpipetować pięć mililitrów zawiesiny J2 zawierającej 100 nicieni na mililitr na sito o oczkach 20 mikrometrów. Po umyciu sterylną wodą z kranu zanurzyć dolną połowę sita zawierającego nicienie J2 w 20% roztworze nadtlenku wodoru i mieszać okrężnymi ruchami przez 15 minut. Wlej sterylną wodę z kranu przez sito na nicienie i powtórz proces mycia dwa razy. Przechyl sito tak, aby nicienie zbierały się na granicy podczas końcowego mycia. Następnie odpipetuj jeden mililitr sterylnej ultraczystej wody z brzegu sita, aby odzyskać nicienie. W kapturze przepływowym subkulturuj jednogramową kępę transgenicznych korzeni ziemniaka na płytkach SH ze 100 sterylnymi nicieniami. Regularnie monitoruj kokulturę pod odwróconym mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu. Kiedy masy jajowe stają się widoczne, należy przeprowadzić subkulturę korzeni na nową płytkę pożywki SH. Stosowanie krążków marchwi spowodowało średnio 100-krotny wzrost populacji nicieni w ciągu trzech miesięcy. Rośliny ziemniaka nie wykazywały widocznych objawów przy niskiej liczebności populacji nicieni powodujących uszkodzenia korzeniowe. Po barwieniu kwasem fuksyny zaobserwowano kilka etapów rozwojowych Pratylenchus penetrans w korze korzenia, co wskazuje na przenikanie do tkanki i związane z tym zmiany martwicze były wyraźnie widoczne w zakażonych obszarach. Rozwój transgenicznych korzeni ziemniaka wykazał początkowy wzrost masy komórkowej wzdłuż ran wywołanych skalpelem w sekcji bulw ziemniaka, a następnie pojawienie się korzeni transgenicznych. W pożywce zaobserwowano trwały wzrost korzeni, a kępy korzeni z powodzeniem przeniesiono na świeżą pożywkę hodowlaną w celu dalszego wzrostu. Transgeniczne kultury korzeniowe ziemniaków zostały z powodzeniem zakażone młodocianymi Meloidogyne chitwoodi w drugim stadium w celu stworzenia kokultur nicieni roślinnych. W zakażonych kulturach zaobserwowano galasy korzeniowe zawierające dorosłe samice i masy jajowe. Tkanki żółciowe utworzone przez Meloidogyne chitwoodi były widoczne po zakażeniu transgenicznych korzeni ziemniaka z wyraźnymi etapami rozwoju i rozmnażania nicieni, które można było zidentyfikować, w tym tworzenie mas jajowych i jaj.