Metoda hodowli wczesnych zarodków piskląt ex vivo (nowa kultura)
October 20th, 2008
Ten film demonstruje nową hodowlę, metodę, za pomocą której zarodki piskląt są hodowane poza jajem przez okres do 24 godzin. Metoda ta pozwala na badanie wczesnego rozwoju (prymitywna smuga do 14 som.), okres odpowiadający E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ i immunohistochemię.
Ta procedura rozpoczyna się od wyizolowania jajka ze skorupki. Worek z żółtkiem jest cięty wokół jajka, a błona jest obierana i umieszczana na szkiełku zegarkowym. Na zarodku umieszcza się pierścień.
Membrana vilin jest uniesiona nad pierścieniem. Zarodek przenosi się do naczynia hodowlanego. Naczynie hodowlane przenosi się do pudełka hodowlanego, które umieszcza się w inkubatorze, a zarodek jest hodowany.
Cześć, jestem Delphine z Ture Brick Finn w Centrum Medycyny Środowiskowej i Genomicznej na Uniwersytecie Teksańskim w Houston. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę hodowli zarodków policzków poza komórką jajową. Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania wpływu leków przeciwpadaczkowych na rozwój U w zarodku policzka.
Więc zacznijmy. Ten protokół hodowli zarodków rozpoczyna się od jaj, które były inkubowane przez 16 godzin na boku w wilgotnym inkubatorze do hamburgera i Hamiltona. Etap czwarty.
Na początek otwórz jajko, stukając kleszczami w skorupkę i usuwając kawałki skorupki dookoła skorupki. Zdejmij górną część skorupy i wyrzuć na etapie HH cztery. Zarodek ma prawie dwa milimetry długości z dobrze zaznaczoną prymitywną smugą i jest otoczony zoną w kształcie gruszki. Lucita.
Zbierz cienką albuminę, przechylając dolną powłokę na bok. Następnie usuń gęstą albuminę za pomocą kleszczy. Umieść zarodek w plastikowym naczyniu wewnątrz naczynia Pyrex zawierającego sól fizjologiczną Panic compton.
Na koniec usuń pozostałą albuminę za pomocą kleszczy. Teraz zarodek jest gotowy do wyśrodkowania na pierścieniu. Kolejnym krokiem jest umieszczenie zarodka na pierścieniu.
Aby to zrobić, najpierw przechyl worek z żółtkiem tak, aby zarodek był skierowany do góry, za pomocą cienkich nożyczek. Przetnij worek z żółtkiem na poziomie równika lub poniżej. Szybko oderwij błonę vilin za pomocą kleszczy.
Ustaw membranę tak, aby była ziarnista lub niebłyszcząca stroną skierowaną do góry. Umieść membranę na szkiełku zegarka. Następnie umieść szklany pierścień na błonie vilin i wyśrodkuj zarodek.
Na koniec podnieś membranę wokół krawędzi szklanego pierścienia. Wyjmij ten zestaw z naczynia z solą fizjologiczną. Następnie przenieś go do mikroskopu, aby zakończyć ustawianie kultury.
Hodowla zarodków jest ustawiana podczas oglądania pod lunetą sekcyjną. Za pomocą cienkich kleszczy upewnij się, że membrana villin jest mocno uniesiona nad szklanym pierścieniem. Przytnij nadmiar membrany villin od wewnętrznej krawędzi szklanego pierścienia.
Uważaj, aby nie przekłuć membrany pipetą lub kleszkami. Następnie usuń sól fizjologiczną z zewnętrznej krawędzi pierścienia za pomocą sterylnej pipety pastwiskowej. Delikatnie spłucz zarodek roztworem soli fizjologicznej.
Aby usunąć komórki żółtka i luźny materiał błony, dodaj 200 mikrolitrów soli fizjologicznej do zewnętrznej krawędzi pierścienia. Ułatwi to przeniesienie do naczynia hodowlanego. Na koniec przykryj zespół odwróconą 35-milimetrową naczynią hodowlaną Falcon.
Teraz zarodek jest gotowy do hodowli. Aby rozpocząć hodowlę zarodka, dodaj 2,5 litra cienkiej albuminy do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego Falcon. Następnie dodaj 200 mikrolitrów cienkiej albuminy do wewnętrznej krawędzi pokrywki naczynia hodowlanego.
Spowoduje to uszczelnienie komory hodowlanej i zapobiegnie odwodnieniu zarodka za pomocą cienkich kleszczy. Odsłoń zarodek, przesuwając szklany pierścień wzdłuż krawędzi szkiełka zegarka i przenieś zestaw do naczynia hodowlanego. Usuń wszystkie resztki soli fizjologicznej z wewnętrznej powierzchni pierścienia za pomocą pipety Pasteura.
Przykryj naczynie pokrywką i umieść zarodek w wilgotnej komorze. Zarodek można hodować do 24 godzin w temperaturze 38 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach hodowli zarodka można go utrwalić w paraformowym aldehydzie.
W przypadku innych procedur, takich jak hybrydyzacja in situ opisana w załączonym filmie, należy usunąć kulturę z inkubatora i natychmiast umieścić ją na lodzie. Napełnij naczynie hodowlane lodowatym PBS lub desy PBS, jeśli zarodki mają być przetwarzane do hybrydyzacji in situ. Za pomocą kleszczy odłącz zarodek od błony vilin.
Używając końca pipety pastwiskowej, przenieś zarodek do świeżego naczynia hodowlanego zawierającego lód. Zimny PBS lub desy PBS. Przygwoźdź zarodek za pomocą kleszczy i odessaj PBS z naczynia.
Dodaj świeżo przygotowany lód. Utrwalający aldehyd paraform jest wysoce toksyczny. Dlatego te czynności należy wykonywać w kapturze chemicznym z okularami ochronnymi i rękawicami.
Czas utrwalania i temperatura będą zależeć od aplikacji, która ma być użyta do hybrydyzacji in situ. Ustal przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza do kriosekcji. Utrwalaj przez sześć do ośmiu godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza dla całej chemii Mount Immunohisto.
Utrwalić na jedną godzinę w temperaturze pokojowej po utrwaleniu na odpowiedni czas, usunąć roztwór utrwalający i odpowiednio zutylizować jako odpady chemiczne. Następnie napełnij naczynie lodowatym PBS lub dey PBS. Jeśli zarodek będzie używany do hybrydyzacji in situ w całości lub barwienia immunologicznego, pożądane jest przekłucie głowy i serca igłą lub nożem do mikrodysekcji.
Zapobiegnie to uwięzieniu przez te struktury sondy lub przeciwciała w późniejszych krokach. Teraz, gdy przeszliśmy przez procedurę utrwalania zarodków, przyjrzyjmy się, w jaki sposób ten system hodowli może być wykorzystany do śledzenia migracji komórek in vitro przed hodowlą, zarodek znajduje się w fazie prymitywnej smugi. Pod koniec okresu hodowli zarodek rozwinął się do HH 10, długości od dwóch do trzech milimetrów i jest widoczny w środku naczynia hodowlanego.
Możliwe jest oznaczenie grupy komórek karbozaniną, barwnikiem fluorescencyjnym tuż przed hodowlą i śledzenie ich ruchu przez cały okres hodowli, kropka. W tym przypadku komórki poniżej węzła Hensona zostały oznaczone Dai. Wykazano, że komórki te przyczyniają się do postępującego rozwoju somitów, rozwoju somitów.
Właśnie pokazaliśmy, jak hodować korzenie kurczaka poza jajkiem. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o jak najszybszej pracy, aby zminimalizować kontakt zarodka z temperaturą pokojową. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To wideo demonstruje metodę hodowania zarodków kurczaka poza jajkiem przez do 24 godzin, umożliwiając badanie wczesnych etapów rozwoju. Ta technika jest przydatna w różnych procedurach eksperymentalnych, w tym w elektroporacjach i immunohistochemii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Embriologia
- Techniki eksperymentalne
Tło
- Zarodki kurczaka stanowią model do badania rozwoju kręgowców.
- Rozumienie wczesnych etapów rozwoju jest kluczowe dla biologii rozwojowej.
- Techniki takie jak elektroporacja mogą być stosowane do manipulacji komórkami zarodkowymi.
- Immunohistochemia umożliwia wizualizację określonych białek podczas rozwoju.
Cel badania
- Przedstawić nową metodę hodowli zarodków kurczaka.
- Umożliwić badanie wczesnych procesów rozwojowych.
- Ułatwić różne zastosowania eksperymentalne w embriologii.
Zastosowanie metod
- Izolacja jaja od skorupki.
- Cięcie woreczka żółtkowego i zdjęcie błony.
- Przeniesienie zarodka do naczynia hodowlowego.
- Inkubacja naczynia hodowlowego w kontrolowanym środowisku.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na pomyślną hodowlę zarodków przez do 24 godzin.
- Zarodki mogą być manipulowane dla różnych technik eksperymentalnych.
- Wczesne etapy rozwoju mogą być obserwowane i badane skutecznie.
- Zastosowania obejmują hybrydyzację in situ i immunohistochemikę.
Wnioski
- Nowa metoda hodowli jest cennym narzędziem w badaniach nad biologią rozwoju.
- Daje wgląd we wczesny rozwój zarodkowy.
- Ta technika może ulepszyć podejścia eksperymentalne w embriologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This ex vivo chick embryo culture method enables direct observation of early developmental processes, supporting target validation in developmental pathways relevant to congenital disorder research. By maintaining embryo viability for up to 24 hours, it provides a reproducible system for mechanistic de-risking of compounds affecting embryogenesis. The approach bridges in vitro models and in vivo complexity, offering predictive value for preclinical assessment of developmental toxicity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in early embryogenesis through electroporation of nucleic acid constructs.
- Operational Value: Supports phenotypic screening of compound effects on primitive streak formation and germ layer patterning.
- Strategic Value: Facilitates target confidence assessment in pathways governing somitogenesis and organogenesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a transparent, accessible system for quantitative whole-mount immunohistochemistry and in situ hybridization readouts.
- Operational Value: Standardizes embryo preparation and culture conditions for reproducible compound exposure studies.
- Strategic Value: Enables scalable assessment of developmental biomarkers across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains physiological relevance of chick embryo as a vertebrate model for developmental toxicity screening.
- Operational Value: Supports continuity from early discovery to GLP-compatible embryotoxicity assays.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by detecting teratogenic potential early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing a manipulable system for pathway clarification prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of developmental gene networks through timed culture and fixation.
- Screening: Delivers quantitative spatial readouts of protein expression changes following compound treatment.
- Analytics: Generates measurable developmental endpoints (e.g., somite count, neural tube closure) for dose-response modeling.
- Translational Research: Connects early mechanism insights to fetal development models via conserved vertebrate pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized embryology platform applicable across multiple therapeutic areas investigating developmental mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in developmental pathway modulation studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized explantation and culture chamber sealing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying embryotoxic liabilities before mammalian model investment.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of compounds with favorable developmental safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical embryo handling and sterile technique.
- Dependent on precision instrumentation (glass rings, Pasteur pipettes, humidified chambers).
- Necessitates standardization of incubation timing and albumin preparation across users.
- Adaptation considerations include species-specific membrane properties and culture duration limits.
- Practical limitations include embryo fragility during transfer and sensitivity to temperature fluctuations.
