16.10: RNAi Experimental

A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo celular que inibe a expressão gênica suprimindo sua transcrição ou ativando o processo de degradação do RNA. O mecanismo foi descoberto por Andrew Fire e Craig Mello em 1998 em plantas. Hoje, é observado em quase todos os eucariotos, incluindo protozoários, moscas, nematóides, insetos, parasitas e mamíferos. Este mecanismo celular preciso de silenciamento de genes foi desenvolvido em uma técnica que fornece uma maneira eficiente de identificar e determinar a função de vários genes sem modificar geneticamente o organismo.

Aplicações de RNAi

RNAi ajuda na análise das funções dos genes. Por exemplo, a técnica de RNAi ajudou a rastrear os cromossomos I e III de C.elegans e levou à identificação de genes envolvidos na divisão celular e no desenvolvimento embrionário. Esta tecnologia também foi aplicada com sucesso à Drosophila melanogaster para identificar genes com papéis essenciais no desenvolvimento embrionário, cascatas de sinalização bioquímica e outros processos celulares fundamentais. Nas plantas de café, o gene responsável pela produção da teobromina sintase foi eliminado usando uma construção de RNA, produzindo plantas de café descafeinadas. A pesquisa mostra que pequenos RNAs interferentes (siRNA) podem inibir infecções causadas pelo vírus da imunodeficiência humana, vírus da hepatite B e poliovírus em linhagens de células humanas cultivadas. Os pesquisadores também conseguiram derrubar genes expressos pelo vírus sincicial respiratório, responsável por causar doenças respiratórias graves em bebês e neonatos.

Vantagens do RNAi sobre o nocaute genético convencional

Antes de descobrir a tecnologia RNAi, a função do gene foi analisada eliminando o gene de interesse do genoma e observando as mudanças fenotípicas. Embora o nocaute genético seja um método irreversível, o RNAi é um método reversível que fornece silenciamento em larga escala de genes codificadores de proteínas em um genoma. Além disso, é uma técnica precisa que pode silenciar diferencialmente genes mesmo com uma única variação de nucleotídeo. Portanto, pode ajudar no direcionamento de mutantes dominantes, como alguns oncogenes. Além disso, a técnica de RNAi é altamente potente, pois as moléculas efetoras funcionam em baixa concentração em comparação com os oligonucleotídeos ou ribozimas utilizados no método antigo.

A interferência de RNA, ou RNAi, é um processo que as células usam para silenciar a expressão gênica.

Nesse mecanismo, uma enzima, Dicer, cliva o RNA curto em RNA de interferência curto, ou siRNA, com aproximadamente vinte e dois pares de bases de comprimento.

Este siRNA é captado por um complexo enzimático chamado complexo de silenciamento induzido por RNA, ou RISC, e convertido em RNA de fita simples durante a montagem de risco em seu mRNA alvo.

O RNA de fita simples pode hibridizar com mRNA complementar. Uma enzima do complexo RISC chamada Argonauta cliva o mRNA alvo. A degradação do mRNA inibe o processo de tradução, resultando no silenciamento de genes.

A interferência de RNA tem sido usada por pesquisadores para estudar a função de vários genes, como o APC, um gene que se acredita estar envolvido no câncer. É construído um vetor que codifica um RNA de grampo curto que tem como alvo um transcrito de mRNA específico.

Este vetor pode ser adicionado a células ou a um organismo para silenciar um gene. Se o vetor for introduzido nas células-tronco embrionárias de camundongos, sua sequência será integrada ao genoma do hospedeiro, produzindo camundongos transgênicos.

Esses camundongos produzem RNA a partir da sequência inserida que se dobra em estruturas em grampo. Essas estruturas são reconhecidas pela maquinaria de RNAi no citoplasma e são clivadas em RNA de fita dupla.

O RNA é então incorporado ao RISC como um RNA de fita simples. O RISC se liga à sequência complementar em um transcrito de mRNA alvo, resultando em sua degradação.

Camundongos com um gene APC inativado desenvolvem tumores no cólon com mais frequência do que camundongos de controle com um gene APC funcional. Isso indica que é provável que o APC seja responsável por suprimir o crescimento do tumor.