16.12: Hibridização in situ

A hibridização in situ (ISH) é uma técnica usada para detectar e localizar moléculas específicas de DNA ou RNA em células, tecidos ou seções de tecido usando uma sonda marcada. A técnica foi usada pela primeira vez em 1969 para a investigação de ácidos nucléicos. Atualmente, é uma ferramenta essencial em pesquisas científicas e ambientes clínicos, especialmente para fins diagnósticos.

Tipos de sondas e rótulos

Uma sonda é uma fita complementar de DNA ou RNA que se liga às sequências de nucleotídeos correspondentes em uma célula. Muitas sondas diferentes, como sondas de DNA de fita simples, sondas de DNA de fita dupla, sondas de RNA antisense ou riboprobus e sondas de oligodesoxinucleotídeos sintéticos, são usadas na hibridização in situ. A escolha da sonda depende de vários fatores, incluindo sua sensibilidade, especificidade, estabilidade e facilidade de penetração na amostra de tecido.

Essas sondas podem ser marcadas com radioisótopos, corantes fluorescentes ou outras moléculas de antígeno para fins de detecção. As ^{sondas 3}H, ³⁵S e ³²P são sondas radiomarcadas amplamente utilizadas, enquanto os marcadores não radioativos incluem biotina, digoxigenina e fluoresceína. Esses rótulos podem ser anexados à molécula de DNA da sonda por meio de métodos de rotulagem final, tradução de entalhe ou síntese aleatória de primer. Métodos de detecção, como autorradiografia, microscopia de fluorescência ou imuno-histoquímica, são usados para visualização do alvo com base no rótulo anexado à sonda hibridizada.

Vantagens e desvantagens da hibridização in situ

Uma das principais vantagens da hibridização in situ é que ela pode até ser aplicada a tecidos congelados para permitir o máximo aproveitamento de tecidos difíceis de obter. Além disso, pode ser combinado com outras técnicas, como imuno-histoquímica, para detectar proteínas e mRNA ativos na amostra. No entanto, ao trabalhar com amostras com baixas cópias de DNA e RNA, pode ser difícil identificar alvos usando hibridização in situ.