5.12
Hibridização in-situ
A hibridização in situ (ISH) é uma técnica usada para detectar e localizar moléculas específicas de DNA ou RNA em células, tecidos ou seções de tecido…
A hibridização in situ é uma técnica usada para localizar DNA ou RNA em células cultivadas ou em seções de tecido quimicamente preservadas.
A hibridização in situ de RNA é usada para monitorar onde um gene está sendo expresso, detectando e quantificando os transcritos específicos de mRNA.
Os mRNAs alvo são detectados por sondas de RNA complementares de fita simples que são criadas pela transcrição in vitro de um molde de DNA ou sintetizadas por uma reação química.
As sondas são marcadas com isótopos radioativos, fluoróforos ou outras moléculas repórteres, como biotina ou digoxigenina, que podem ser ligadas e detectadas por um anticorpo marcado.
A hibridização in situ de RNA tem quatro etapas principais: fixação do tecido, permeabilização, hibridização e detecção.
Para começar, o tecido fresco é colhido e tratado quimicamente para interromper quaisquer reações bioquímicas dentro do tecido e preservar sua integridade estrutural. Essa técnica de preservação é chamada de fixação de tecido.
Em seguida, proteínas e lipídios no tecido precisam ser removidos para que a sonda acesse e se ligue ao RNA alvo.
Para degradar as proteínas e permeabilizar a membrana celular, a amostra é tratada com ácido clorídrico 0,2 molar e enzimas como proteinases, enquanto detergentes são usados para quebrar os lipídios.
O RNA alvo é então hibridizado com as sondas a uma temperatura logo abaixo do ponto de fusão do híbrido RNA-sonda. Isso ajuda as sondas a recozer com os mRNAs complementares. As sondas não ligadas e frouxamente ligadas são removidas realizando várias lavagens.
O método para detectar as sondas hibridizadas depende do tipo de rótulo. As sondas radioativas são expostas a filmes fotográficos, enquanto as sondas fluorescentes são visíveis sob microscópios fluorescentes.
Para outros rótulos, os anticorpos contra a molécula repórter são marcados com um corante fluorescente ou colorimétrico.
A detecção de sondas hibridizadas revela a distribuição de mRNAs específicos indicando onde os genes de interesse são expressos.
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Q1: What is in situ hybridization used for in molecular biology?
In situ hybridization is a technique that detects and localizes specific DNA or RNA molecules in cultured cells or preserved tissue sections. RNA in situ hybridization specifically monitors where genes are expressed by detecting and quantifying mRNA transcripts using complementary RNA probes labeled with radioactive isotopes, fluorophores, biotin, or digoxigenin for visualization.
Q2: What are the four main steps of RNA in situ hybridization?
The four main steps are tissue fixation, permeabilization, hybridization, and detection. Tissue fixation chemically preserves structural integrity. Permeabilization removes proteins and lipids using hydrochloric acid, proteinases, and detergents to allow probe access. Hybridization anneals probes to complementary mRNAs at controlled temperatures. Detection reveals mRNA distribution using methods suited to the probe label type.
Q3: How do different probe labels affect detection in in situ hybridization?
Detection methods depend on the probe label type. Radioactive probes are exposed to photographic films via autoradiography. Fluorescent probes are visualized under fluorescent microscopes. For other labels like biotin or digoxigenin, antibodies tagged with fluorescent or colorimetric dyes bind the reporter molecule for visualization, enabling flexible detection strategies.
Q4: What types of probes are used in in situ hybridization?
Multiple probe types are employed, including single-stranded DNA probes, double-stranded DNA probes, antisense RNA probes (riboprobes), and synthetic oligodeoxynucleotide probes. Probe selection depends on sensitivity, specificity, stability, and tissue penetration ability. These probes are complementary strands that bind to corresponding nucleotide sequences in cells or tissue samples.
Q5: Why is tissue permeabilization necessary in in situ hybridization?
Tissue permeabilization removes proteins and lipids that block probe access to target RNA. The sample is treated with hydrochloric acid and proteinases to degrade proteins and permeabilize cell membranes, while detergents break down lipids. This step ensures probes can penetrate tissue and successfully anneal with complementary mRNA sequences.
Q6: What are the advantages of in situ hybridization for gene expression analysis?
In situ hybridization can be applied to frozen tissues, maximizing use of difficult-to-obtain samples. It can be combined with other techniques like immunohistochemistry to detect both protein and active mRNA simultaneously. However, samples with low DNA and RNA copy numbers may present challenges for target identification.
Q7: How are probes labeled and detected in in situ hybridization?
Probes are labeled using radioisotopes (3H, 35S, 32P), non-radioactive labels (biotin, digoxigenin, fluorescein), or fluorescent dyes attached via end-labeling, nick-translation, or random primer synthesis. These labeled probes enable detection through reporter genes or antibodies tagged with fluorescent or colorimetric dyes, allowing visualization of hybridized target sequences.