Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a Provisão e Recomendação Geral da Legislação Chinesa de Administração de Animais Experimentais e foram aprovados pelo Comitê da Instituição de Cuidados e Uso de Animais da Capital Medical University (Ref no. AEEI-2014-052). Foram utilizados camundongos Balb/c fêmeas com idade entre 6 e 8 semanas.
1. Preparação das células e animais
- Um dia antes da operação, raspe o cabelo ao redor dos quartos mamilos para expor a área de operação.
- Use uma mão para segurar o mouse firmemente na parte de trás para garantir que o mouse não se mova livremente, levante o mouse para expor a barriga ao operador e, em seguida, use a outra mão para raspar o pelo ao redor dos quartos mamilos com um barbeador eletrônico.
- Coloque uma fina camada de creme depilatório ao redor dos mamilos por 30 a 60 segundos, limpe o creme com água destilada e seque o mouse com papel macio.
- No dia da operação, colete células murinas de câncer de mama (4T1-luc2), conte o número de células e ajuste a densidade celular para 2 x 105 células/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em tubos de microcentrífuga estéreis e mantenha-os no gelo. Para cada camundongo, 1 x 104 células/50 μL em uma seringa de 1 mL são preparados.
2. Injeção ortotópica
- Anestesia de camundongos
- Induza a anestesia. Coloque os ratos em um recipiente transparente fechado e ligue o gás isoflurano a 2% para anestesiar os ratos por cerca de 5 minutos, até que todos se deitem e adormeçam.
- Mantenha a anestesia. Transfira os camundongos do recipiente para máscaras de anestesia individuais, coloque um pouco de pomada veterinária nos olhos para evitar ressecamento, mantenha os camundongos em decúbito dorsal com os mamilos expostos ao operador e deixe-os continuar a inalar o gás isoflurano por alguns minutos até que a injeção seja realizada.
- Confirme o sucesso da anestesia pela falta de um reflexo de retirada de pinça do dedo do pé.
- Aplique pomada oftálmica nos olhos dos camundongos para evitar o ressecamento dos olhos.
OBSERVAÇÃO De acordo com o tamanho do recipiente e o número de máscaras de anestesia individuais disponíveis, um grupo de camundongos pode ser anestesiado e injetado um a um sob anestesia individual.
- Desempenho da injeção
- Use uma mão para prender a pele ao redor do quarto mamilo com uma pinça, para montar um "túnel" elevado para a seringa seguir. Use a outra mão para segurar a seringa com a agulha virada para cima para entrar na pele por via subcutânea a 5 - 10 mm do mamilo; Em seguida, siga o "túnel" até que a ponta da agulha se aproxime do mamilo, mova cuidadosamente a ponta da agulha para dentro da almofada de gordura mamária até que o olho da agulha fique sob a ponta do mamilo, descarte a pinça e injete as células lentamente.
- Vire um pouco a agulha e retraia a seringa lentamente; use um cotonete para pressionar a ferida da agulha por 10 a 20 segundos para garantir que não haja infiltração de fluido.
- Observe o quarto mamilo para confirmar uma injeção bem-sucedida: uma esfera plana branca transparente com o mamilo como centro pode ser observada (Figura 1).
- Mantenha os camundongos anestesiados por mais um minuto para evitar que os camundongos se recuperem e se movam muito rapidamente, o que fará com que a ferida da injeção se abra e as células tumorais vazem.
Figura 1: Fotos antes e depois da injeção ortotópica na almofada de gordura mamária de camundongos Balb/c fêmeas. A operação foi realizada e as fotos foram tiradas enquanto os camundongos estavam sob anestesia com isoflurano. A, antes da injeção, B, após a injeção.
