Injeção intratorácica: entrega composta ao coração do peixe-zebra adulto

Resumo

Fonte: Bise, T., et al. Injeção intratorácica para o estudo do coração de peixe-zebra adulto. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo descreve a técnica de entrega de compostos no coração de peixes-zebra adultos usando injeção intratorácica.

Protocolo

1. Preparação do peixe para injeção intratorácica

1. Pegue um peixe-zebra adulto (Danio rerio) com uma rede e transfira-o para a solução anestésica.
2. Após 1−2 min, quando o peixe parar de nadar e o movimento do opérculo for reduzido, toque no peixe com uma colher de plástico para garantir que ele não reaja a nenhum contato.
3. Transfira rápida e cuidadosamente o peixe com a colher para a ranhura da esponja molhada, com o lado ventral para cima. A cabeça do peixe deve apontar para longe da mão dominante do operador.

2. Microinjeção no pericárdio

1. Sob o microscópio estereoscópico, observe cuidadosamente o movimento do coração batendo sob a pele do peixe. Determine visualmente o ponto de injeção acima do coração batendo e no meio do triângulo definido pelas placas cartilaginosas ventrais (Figura 1D). Insira a ponta do capilar em um ângulo de 30−45° em relação ao eixo do corpo (Figura 1E). Penetre suavemente na pele com a ponta do microcapilar no pericárdio (Figura 1C). Um ponto de entrada ideal é mais próximo do abdômen do que da cabeça.
   nota: Não insira o capilar muito profundamente no corpo e no coração, pois isso causará lesões no órgão. Em caso de punção cardíaca, a agulha geralmente se enche de sangue. Se isso acontecer, remova o capilar e exclua os peixes do experimento.
2. Uma vez que a agulha esteja dentro do pericárdio, conclua a injeção pressionando o pedal do dispositivo microinjetor.
   nota: Tenha cuidado para não injetar ar na cavidade torácica.
3. Após a injeção, retire suavemente o capilar do tórax e transfira imediatamente o peixe para um tanque com água do sistema para recuperação.
4. Monitore os peixes até a recuperação total da anestesia.
5. Colete o coração no momento desejado e prepare-o para uma análise mais aprofundada.
   nota: Caso o peixe não retome o movimento do opérculo dentro de 30 s, reanime o peixe espremendo água nas guelras com uma pipeta de plástico.

Resultados

Figura 1: Injeção intratorácica (IT) em peixe-zebra adulto. (A) Fotografia de um capilar de microinjeção tracionado com filamento (6", 1,0 mm de diâmetro) e valores do programa de extrator de agulhas utilizado. (B) Fotografia de um capilar de microinjeção puxado com filamento (6", 1,0 mm de diâmetro) preenchido com 2,5 μL de solução contendo vermelho de fenol a 10%. A ponta puxada da agulha tem no máximo 7 mm de comprime...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Macroscópio (binocular)	M400		com Apozoom
Microinjetor femtojet	Eppendorf	Rolamento 5247 0034 77
Microcarregadores femtotips	Eppendorf	Rolamento 5242 956.003
Agulhas de vidro para micropipetas tipo C	WPI	TW100F-6	capilar de parede fina
Extrator de micropipetas modelo P-87	Flamejante/Marrom	20081016	caixa de filamento 2,5 mm x 4,5 mm
esponja	qualquer	qualquer	Dim. Esponja esculpida 7cm x 3 cm x 1 cm
Tricaína (Anestética)	sigma	E10521