Injeção intratorácica: entrega composta ao coração do peixe-zebra adulto

1. Preparação do peixe para injeção intratorácica

1. Pegue um peixe-zebra adulto (Danio rerio) com uma rede e transfira-o para a solução anestésica.
2. Após 1−2 min, quando o peixe parar de nadar e o movimento do opérculo for reduzido, toque no peixe com uma colher de plástico para garantir que ele não reaja a nenhum contato.
3. Transfira rápida e cuidadosamente o peixe com a colher para a ranhura da esponja molhada, com o lado ventral para cima. A cabeça do peixe deve apontar para longe da mão dominante do operador.

2. Microinjeção no pericárdio

1. Sob o microscópio estereoscópico, observe cuidadosamente o movimento do coração batendo sob a pele do peixe. Determine visualmente o ponto de injeção acima do coração batendo e no meio do triângulo definido pelas placas cartilaginosas ventrais (Figura 1D). Insira a ponta do capilar em um ângulo de 30−45° em relação ao eixo do corpo (Figura 1E). Penetre suavemente na pele com a ponta do microcapilar no pericárdio (Figura 1C). Um ponto de entrada ideal é mais próximo do abdômen do que da cabeça.
   nota: Não insira o capilar muito profundamente no corpo e no coração, pois isso causará lesões no órgão. Em caso de punção cardíaca, a agulha geralmente se enche de sangue. Se isso acontecer, remova o capilar e exclua os peixes do experimento.
2. Uma vez que a agulha esteja dentro do pericárdio, conclua a injeção pressionando o pedal do dispositivo microinjetor.
   nota: Tenha cuidado para não injetar ar na cavidade torácica.
3. Após a injeção, retire suavemente o capilar do tórax e transfira imediatamente o peixe para um tanque com água do sistema para recuperação.
4. Monitore os peixes até a recuperação total da anestesia.
5. Colete o coração no momento desejado e prepare-o para uma análise mais aprofundada.
   nota: Caso o peixe não retome o movimento do opérculo dentro de 30 s, reanime o peixe espremendo água nas guelras com uma pipeta de plástico.

Figura 1: Injeção intratorácica (IT) em peixe-zebra adulto. (A) Fotografia de um capilar de microinjeção tracionado com filamento (6", 1,0 mm de diâmetro) e valores do programa de extrator de agulhas utilizado. (B) Fotografia de um capilar de microinjeção puxado com filamento (6", 1,0 mm de diâmetro) preenchido com 2,5 μL de solução contendo vermelho de fenol a 10%. A ponta puxada da agulha tem no máximo 7 mm de comprimento. (C) Representação esquemática do procedimento de injeção de TI. (D) Fotografias do procedimento de injeção de TI. Esta figura foi modificada de Bise et al. Os números nos painéis C e D correspondem às mesmas etapas do procedimento: (1) o peixe é colocado com o lado ventral voltado para cima em uma esponja umidificada. O local da punção (ponto vermelho no triângulo) está localizado no centro do tórax, perto das brânquias. (2) Penetração da agulha no pericárdio. O ponto vermelho indica o local da punção. (3) A injeção é monitorada observando-se a disseminação da solução vermelha na cavidade pericárdica. (E) Esquema de injeção de TI. O ângulo entre o capilar de injeção e o eixo do corpo deve estar entre 30° e 45° para evitar punção cardíaca. (F) Fotografias do tórax do peixe 1 hora após a injeção de TI dos volumes indicados. Setas brancas estão apontando para o tecido avermelhado, o que pode indicar sangramento interno