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Abstract

Fonte: Hillert-Richter, L. K. et al., Medindo a Composição do Complexo de Sinalização Indutor de Morte CD95 e Processamento de Procaspase-8 neste Complexo. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve o western blotting baseado em quimioluminescência de lisados imunoprecipitados. A técnica ajuda a determinar o processamento e a ativação de proteínas. O sinal quimioluminescente detectado é proporcional ao nível de processamento da proteína durante sua ativação.

Protocol

experimentos com células T foram realizados de acordo com o acordo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparando células para o experimento

NOTA: O número médio de células para esta imunoprecipitação é de 1 × 10⁷. As células aderentes devem ser semeadas um dia antes do experimento, de modo que haja 1 × 10⁷ células no dia do experimento.

1. Preparando células aderentes para o experimento
   1. Semeie 5-8 × 10⁶ células aderentes em 20 mL de meio (consulte a Tabela de Materiais para a composição) para cada condição em placas de 14,5 cm um dia antes do início do experimento.
   2. No dia do experimento, certifique-se de que as células sejam 80-90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes.
2. Preparando células em suspensão para o experimento
   1. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁷ células em suspensão em 10 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais para a composição) por condição em placas de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
   2. Se estiver usando células primárias, isole as células T primárias de acordo com o procedimento descrito anteriormente. Trate as células T primárias com 1 μg / mL de fitohemaglutinina por 24 h, seguido de tratamento com 25 U / mL de IL2 por 6 dias.
   3. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁸ células T primárias em 10 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais para a composição) por condição em placas de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
      nota: Esse número maior de células T primárias é recomendado, pois essas células são menores.

2. Estimulação CD95L

1. Estimular as células com CD95L (produzido conforme descrito anteriormente ou comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
   nota: A concentração do CD95L e o tempo de estimulação dependem do tipo de célula. Prepare uma condição de estimulação duas vezes para gerar uma amostra de ‘controle de contas’ em paralelo.
   1. Estimule as células aderentes com a concentração selecionada de CD95L. Segure a placa em ângulo e pipete o ligante no meio sem tocar nas células aderentes.
   2. Estimule as células em suspensão com CD95L pipetando a solução ligante na suspensão celular.

3. Colheita de células e lise

1. Coloque os pratos de células no gelo.
   nota: Não descarte o meio. As células moribundas flutuam no meio e são importantes para a análise.
2. Adicione 10 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) à suspensão celular e raspe as células anexadas da placa. Recolha a suspensão celular em um tubo de 50 mL.
3. Lave o prato celular com 10 mL de PBS frio duas vezes e coloque a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mL. Centrifugar a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C.
4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 1 mL de PBS frio. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL.
5. Centrifugar a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com 1 ml de PBS frio.
6. Centrifugue a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com 1 ml de tampão de lise (contendo 4% de cocktail inibidor da protease). Incube por 30 min no gelo.
7. Centrifugue o lisado na velocidade máxima (~ 17.000 × g) por 15 min, 4 ° C.
8. Transfira o sobrenadante (lisado) para um tubo limpo. Descarte o pellet. Tomar 50 μL do lisado noutro tubo. Analise a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford e tome a quantidade de lisado correspondente a 25 μg de proteína em um frasco. Adicione o buffer de carregamento (consulte a Tabela de Materiais para a composição) ao frasco. Armazene-o a -20 °C como controle de lisado.

4. Imunoprecipitação (IP)

1. Adicione 2 μL de anticorpos anti-APO-1 e 10 μL de esferas de sepharose de proteína A (preparadas conforme recomendado pelo fabricante) ao lisado. Adicione apenas 10 μL dos grânulos a um tubo separado contendo lisado (amostra estimulada) para gerar um ‘controle de grânulos’
   nota: Use pontas de pipeta com orifícios largos cortando as pontas ou comprando pontas especiais para IP ao manusear as esferas de sepharose da proteína A.
2. Incubar a mistura de lisado com anticorpos/esferas de sepharose de proteína A com mistura suave durante a noite a 4 °C. Centrifugar os lisados com anticorpos/esferas de sepharose de proteína A a 500 × g durante 4 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 ml de PBS frio às esferas e repetir este passo pelo menos três vezes.
3. Descarte o sobrenadante. Aspire as esferas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 μL.

5. Western blot

1. Adicione 20 μL de tampão de carga 4x (consulte a Tabela de Materiais para a composição) aos grânulos e aqueça a 95 °C por 10 min. Aqueça os controles de lisado a 95 °C por 5 min.
2. Carregue os lisados, IPs e um padrão de proteína em um gel de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 12,5% (consulte a Tabela de Materiais para a preparação do gel) e opere com uma tensão constante de 80 V.
3. Transferir as proteínas do gel SDS para uma membrana de nitrocelulose.
   nota: Aqui, a técnica semi-seca, otimizada para as proteínas de interesse, foi utilizada para a transferência ao longo de 12 min (25 V; 2,5 A = constante). Mergulhe a membrana de nitrocelulose e duas pilhas de transferência de tamanho pequeno em tampão de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais para a composição, prepare de acordo com as instruções do fabricante) por alguns minutos antes do western blotting.
4. Coloque a membrana borrada em uma caixa e bloqueie-a por 1 h em uma solução de bloqueio (0,1% Tween-20 em PBS (PBST) + 5% de leite). Incubar a membrana com a solução de bloqueio sob agitação suave.
5. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.

6. Detecção de Western blot

1. Adicionar o primeiro anticorpo primário à membrana na diluição indicada (ver Tabela de Materiais) e incubá-lo durante a noite a 4 °C com agitação suave.
2. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.
3. Incubar a membrana com 20 mL de anticorpo secundário (diluído 1:10.000 em PBST + 5% de leite) com agitação suave por 1 h em temperatura ambiente.
4. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.
5. Descarte o PBST e adicione aproximadamente 1 mL de substrato de peroxidase de rábano à membrana.
6. Detecte o sinal quimioluminescente (ver Tabela de Materiais).
   nota: O tempo de exposição e o número de imagens capturadas dependem da quantidade de proteína na célula e da especificidade dos anticorpos utilizados. Deve ser estabelecido empiricamente para cada anticorpo utilizado para a detecção.

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000