Ensaio de Western Blot Quimioluminescente para Processamento de Proteínas

Published: May 31, 2023
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Abstract

Fonte: Hillert-Richter, L. K. et al., Medindo a Composição do Complexo de Sinalização Indutor de Morte CD95 e Processamento de Procaspase-8 neste Complexo. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve o western blotting baseado em quimioluminescência de lisados imunoprecipitados. A técnica ajuda a determinar o processamento e a ativação de proteínas. O sinal quimioluminescente detectado é proporcional ao nível de processamento da proteína durante sua ativação.

Protocol

experimentos com células T foram realizados de acordo com o acordo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparando células para o experimento

NOTA: O número médio de células para esta imunoprecipitação é de 1 × 107. As células aderentes devem ser semeadas um dia antes do experimento, de modo que haja 1 × 107 células no dia do experimento.

  1. Preparando células aderentes para o experimento
    1. Semeie 5-8 × 106 células aderentes em 20 mL de meio (consulte a Tabela de Materiais para a composição) para cada condição em placas de 14,5 cm um dia antes do início do experimento.
    2. No dia do experimento, certifique-se de que as células sejam 80-90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes.
  2. Preparando células em suspensão para o experimento
    1. Coloque cuidadosamente 1 × 107 células em suspensão em 10 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais para a composição) por condição em placas de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
    2. Se estiver usando células primárias, isole as células T primárias de acordo com o procedimento descrito anteriormente. Trate as células T primárias com 1 μg / mL de fitohemaglutinina por 24 h, seguido de tratamento com 25 U / mL de IL2 por 6 dias.
    3. Coloque cuidadosamente 1 × 108 células T primárias em 10 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais para a composição) por condição em placas de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
      nota: Esse número maior de células T primárias é recomendado, pois essas células são menores.

2. Estimulação CD95L

  1. Estimular as células com CD95L (produzido conforme descrito anteriormente ou comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
    nota: A concentração do CD95L e o tempo de estimulação dependem do tipo de célula. Prepare uma condição de estimulação duas vezes para gerar uma amostra de ‘controle de contas’ em paralelo.
    1. Estimule as células aderentes com a concentração selecionada de CD95L. Segure a placa em ângulo e pipete o ligante no meio sem tocar nas células aderentes.
    2. Estimule as células em suspensão com CD95L pipetando a solução ligante na suspensão celular.

3. Colheita de células e lise

  1. Coloque os pratos de células no gelo.
    nota: Não descarte o meio. As células moribundas flutuam no meio e são importantes para a análise.
  2. Adicione 10 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) à suspensão celular e raspe as células anexadas da placa. Recolha a suspensão celular em um tubo de 50 mL.
  3. Lave o prato celular com 10 mL de PBS frio duas vezes e coloque a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mL. Centrifugar a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C.
  4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 1 mL de PBS frio. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL.
  5. Centrifugar a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com 1 ml de PBS frio.
  6. Centrifugue a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com 1 ml de tampão de lise (contendo 4% de cocktail inibidor da protease). Incube por 30 min no gelo.
  7. Centrifugue o lisado na velocidade máxima (~ 17.000 × g) por 15 min, 4 ° C.
  8. Transfira o sobrenadante (lisado) para um tubo limpo. Descarte o pellet. Tomar 50 μL do lisado noutro tubo. Analise a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford e tome a quantidade de lisado correspondente a 25 μg de proteína em um frasco. Adicione o buffer de carregamento (consulte a Tabela de Materiais para a composição) ao frasco. Armazene-o a -20 °C como controle de lisado.

4. Imunoprecipitação (IP)

  1. Adicione 2 μL de anticorpos anti-APO-1 e 10 μL de esferas de sepharose de proteína A (preparadas conforme recomendado pelo fabricante) ao lisado. Adicione apenas 10 μL dos grânulos a um tubo separado contendo lisado (amostra estimulada) para gerar um ‘controle de grânulos’
    nota: Use pontas de pipeta com orifícios largos cortando as pontas ou comprando pontas especiais para IP ao manusear as esferas de sepharose da proteína A.
  2. Incubar a mistura de lisado com anticorpos/esferas de sepharose de proteína A com mistura suave durante a noite a 4 °C. Centrifugar os lisados com anticorpos/esferas de sepharose de proteína A a 500 × g durante 4 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 ml de PBS frio às esferas e repetir este passo pelo menos três vezes.
  3. Descarte o sobrenadante. Aspire as esferas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 μL.

5. Western blot

  1. Adicione 20 μL de tampão de carga 4x (consulte a Tabela de Materiais para a composição) aos grânulos e aqueça a 95 °C por 10 min. Aqueça os controles de lisado a 95 °C por 5 min.
  2. Carregue os lisados, IPs e um padrão de proteína em um gel de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 12,5% (consulte a Tabela de Materiais para a preparação do gel) e opere com uma tensão constante de 80 V.
  3. Transferir as proteínas do gel SDS para uma membrana de nitrocelulose.
    nota: Aqui, a técnica semi-seca, otimizada para as proteínas de interesse, foi utilizada para a transferência ao longo de 12 min (25 V; 2,5 A = constante). Mergulhe a membrana de nitrocelulose e duas pilhas de transferência de tamanho pequeno em tampão de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais para a composição, prepare de acordo com as instruções do fabricante) por alguns minutos antes do western blotting.
  4. Coloque a membrana borrada em uma caixa e bloqueie-a por 1 h em uma solução de bloqueio (0,1% Tween-20 em PBS (PBST) + 5% de leite). Incubar a membrana com a solução de bloqueio sob agitação suave.
  5. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.

6. Detecção de Western blot

  1. Adicionar o primeiro anticorpo primário à membrana na diluição indicada (ver Tabela de Materiais) e incubá-lo durante a noite a 4 °C com agitação suave.
  2. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.
  3. Incubar a membrana com 20 mL de anticorpo secundário (diluído 1:10.000 em PBST + 5% de leite) com agitação suave por 1 h em temperatura ambiente.
  4. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.
  5. Descarte o PBST e adicione aproximadamente 1 mL de substrato de peroxidase de rábano à membrana.
  6. Detecte o sinal quimioluminescente (ver Tabela de Materiais).
    nota: O tempo de exposição e o número de imagens capturadas dependem da quantidade de proteína na célula e da especificidade dos anticorpos utilizados. Deve ser estabelecido empiricamente para cada anticorpo utilizado para a detecção.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

12.5% SDS gelSelf-madeFor two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishesGreiner639160
AcrylamideCarl RothA124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orificeVWR46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysateSigma AldrichA2103Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-805-038-C100Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 AbCell signaling9662 SDilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-242-C100Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-804-961-0100Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 AbProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOADI-AAM-212-EDilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP AbCell signaling9542Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APSCarl Roth9592.3
&beta;-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450mlBio Rad500-0006Used according to manufacturer's instructions
CD95LProvided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZOALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma AldrichALX-522-020-C005Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, MgPAN BiotechP04-53500Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis bufferSelf-made10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
GlycineCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech&nbsp;1070-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001For activation of T cells
KClCarl Roth6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>Carl Roth3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mLBio Rad161-0747Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrateMilliporeWBLUFO500
Lysis bufferSelf-made13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/LPAN BiotechP04-41154Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cellsgibco by Life Technologie21875034Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powderCarl RothT145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTSelf-made20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milkSelf-made50 g milk powder + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801For activation of T Cells
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beadsNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
ScraperVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
ShakerHeidolph
Sodium azideCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacksBio Rad170-4270Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membraneBio Rad170-4270Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000

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Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

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Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21369, doi: (2025).

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