Transplante de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Procedimento de transplante

1. Preparação para a cirurgia
   1. Limpe e esterilize o equipamento cirúrgico.
   2. Prepare o dispositivo estereotáxico e o sistema de bomba de microinjeção.
      NOTA: É fundamental testar a seringa Hamilton e a agulha de 30 G e 2 polegadas antes de iniciar. Insira a agulha em um tubo contendo NaCl estéril a 0,9% (cloreto de sódio) e retire lentamente a solução para dentro e para fora.
   3. Configure a máquina de anestesia. Teste a máquina antes de envolver qualquer animal. Limpe a câmara de indução com etanol a 70%.
2. Preparação dos animais
   1. Mantenha os camundongos por pelo menos 7 dias antes dos experimentos em condições padrão para aclimatá-los.
      NOTA: Os seguintes animais foram utilizados para este protocolo: fêmea NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, também conhecida como NSG) e fêmea C57BL/6J (20-25 g, também conhecida como B6). O procedimento também pode ser realizado com camundongos machos.
   2. Meça o peso corporal do camundongo e ajuste a dose do analgésico a ser injetado. Administre carprofeno (5 mg / kg de peso corporal) por via intraperitoneal para reduzir a dor e / ou prevenir uma resposta inflamatória.
   3. Anestesiar os animais com isoflurano (3% na fase de indução e 1,5-2% na fase de manutenção durante a cirurgia) vaporizado em oxigênio.
      NOTA: A anestesia gasosa é preferida devido a um rápido despertar após o procedimento cirúrgico e porque os níveis de gás anestésico podem ser facilmente ajustados.
   4. Use reflexos nociceptivos para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado (por exemplo, beliscões nos dedos dos pés). Quando a anestesia profunda for alcançada, transporte o animal da câmara de indução para a estrutura estereotáxica. Mantenha a anestesia usando uma máscara facial.
      NOTA: A frequência respiratória precisa ser monitorada visualmente durante todo o procedimento (40-60 respirações por minuto). Use uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia durante o procedimento.
   5. Aplique lubrificante oftálmico para evitar que os olhos sequem.
   6. Raspe o couro cabeludo do camundongo com um barbeador elétrico e desinfete a pele com solução de betadina a 5% usando cotonetes.
   7. Prenda a cabeça do mouse e insira as barras auriculares no meato externo.
      NOTA: Tenha cuidado para não danificar os tímpanos. Aplique pomada de lidocaína em ambos os canais auditivos antes de inserir as barras auriculares. Para verificar se a cabeça do animal está em uma posição estável, empurre cuidadosamente a cabeça para baixo para ver se há movimento. Se o movimento for observado, a barra auricular, o posicionamento do revólver ou ambos estão incorretos e precisam ser reajustados.
3. Craniotomia
   1. Use uma lâmina cirúrgica para fazer um corte ao longo da linha média grande o suficiente para revelar os pontos de referência lambda e bregma.
      NOTA: Afastadores de pele podem ser aplicados para manter o crânio exposto.
   2. Retraia o periósteo e a fáscia com um bisturi e use cotonetes estéreis para secar a superfície do crânio.
   3. Ajuste as barras da orelha e da boca para padronizar a posição da cabeça.
      NOTA: As coordenadas verticais para bregma e lambda precisam ser idênticas para o posicionamento ântero-posterior.
   4. Coloque a agulha no bregma e calcule as coordenadas dos pontos de injeção desejados (as coordenadas de interesse escolhidas para este protocolo: ântero-posterior (AP): + 0,5 mm, médio-lateral (ML): + 1,5 mm). Mova a agulha até esse ponto e marque-a com tinta.
      NOTA: As coordenadas foram escolhidas com base no Atlas do Cérebro de Rato de Franklin e Paxinos. As distâncias são mm do bregma.
   5. Aplique NaCl estéril a 0,9% no crânio e faça um furo com um diâmetro de 2-3 mm no crânio com uma broca cirúrgica odontológica.
   6. Mova a agulha para a superfície da dura-máter e calcule as coordenadas de profundidade.
4. Procedimento de transplante
   1. Ressuspenda as células progenitoras neurais humanas transduzidas virais no tubo e coloque 2 μL de suspensão celular em uma seringa (5 μL ou 10 μL).
      NOTA: Certifique-se de que não haja bolhas de ar na suspensão celular. A seringa deve ser mantida na posição horizontal até ser montada no dispositivo estereotáxico para evitar a sedimentação celular.
   2. Coloque a seringa acima do local alvo (coordenadas calculadas: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) e mova lentamente a agulha para a superfície da dura-máter.
      NOTA: Se não tiver certeza sobre as coordenadas corretas, realize injeções com corante e avaliação histológica do local da injeção antes do transplante das células.
   3. Guie a agulha a uma taxa de 0,02 mm/s no cérebro até a profundidade adequada (a coordenada escolhida para este protocolo é dorsal-ventral (DV) - 0,8 mm). Ultrapasse a profundidade em 0,1 mm e retire a agulha na mesma distância para criar uma bolsa para as células injetadas.
   4. Aplique adesivo de tecido ao redor da agulha usando uma pinça para evitar vazamento de células.
   5. Injete 2 μL da suspensão celular preparada a uma taxa constante de 3-5 nL/s.
      NOTA: O procedimento de injeção durará entre 7 e 12 min.
   6. Após a injeção, deixe a agulha no lugar por pelo menos 5 minutos antes de retirá-la lentamente. Aplique adesivo de tecido para selar o orifício no crânio e aguarde mais 2 min.