Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) es una poderosa herramienta para identificar las proteínas: las interacciones de la cromatina que se producen en el contexto de las células vivas 1-3. Esta técnica ha sido ampliamente explotada en las células de cultivo de tejidos, y en menor medida, en el tejido principal. La aplicación de chip en el tejido embrionario de roedores, especialmente en los momentos iniciales de desarrollo, se complica por la limitada cantidad de tejido y la heterogeneidad de las células y tipos de tejidos en el embrión. Aquí presentamos un método para llevar a cabo mediante un chip el día embrionario disociados 8.5 (E8.5) embrión. Cromatina esquilada de un solo embrión E8.5 se pueden dividir en un máximo de cinco alícuotas, lo que permite que el material suficiente para el investigador y controles para la investigación de proteínas específicas: las interacciones de la cromatina.
Hemos utilizado esta técnica para comenzar a documentar las proteínas: las interacciones de la cromatina durante la especificación de los tejidos específicos de los programas de expresión génica. La heterogeneidad de los tipos de células en un embrión necesariamente restringe la aplicación de esta técnica porque el resultado es la detección de proteínas: las interacciones de la cromatina sin distinguir si las interacciones ocurren en todos, un subconjunto de, o un solo tipo de células (s). Sin embargo, el análisis de genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de la expresión génica es posible por dos razones. En primer lugar, la inmunoprecipitación de los factores específicos de tejido necesariamente aislados de la cromatina del tipo de célula donde se expresa el factor. En segundo lugar, la inmunoprecipitación de coactivadores y las histonas que contiene modificaciones post-traduccionales que se asocian con la activación de genes sólo se encuentran en los genes y secuencias reguladoras de genes en el tipo de células donde el gen está siendo o ha sido activada. La técnica debe ser aplicable al estudio de la mayoría de los tejidos específicos de los eventos de activación genética.
En el ejemplo que se describe a continuación, se utilizó E8.5 y E9.5 embriones de ratón para examinar los factores de unión en un promotor del gen específico del músculo esquelético. Somitas, que son las precursoras de los tejidos que los músculos del esqueleto del tronco y las extremidades se forman, están presentes en E8.5-9,5 4,5. Myogenin es un factor de regulación necesarios para la diferenciación del músculo esquelético 6.9. Los datos demuestran que miogenina se asocia con su propio promotor en E8.5 y E9.5 embriones. Porque miogenina sólo se expresa en somitas en esta etapa de desarrollo 6,10, los datos indican que las interacciones miogenina con su propio promotor ya se han producido en las células del músculo esquelético precursor en E8.5 embriones.
En el protocolo de chip se describe, se muestra que la miogenina regulador miogénico se asocia con el promotor miogenina en el tejido esquelético precursor muscular presente en un solo E8.5 y E9.5 embriones. Estudios anteriores han caracterizado ampliamente miogenina unión a la caja de E que contienen secuencias, comenzando con los primeros experimentos de vitro utilizando gel de cambio traducido de vitro o producidas por bacterias y ADN miogenina radiomarcado que codifica la porci…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 GM56244 a ANI, que incluye los fondos otorgados a través de la Recuperación y Reinversión de 2009, y por el NIH R01 GM87130 a Jarp
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |